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요약

생체 이중 순환 태반 관류 모델은 인간의 태반을 통해 생체 이물질 및 나노 입자의 이동을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 이 비디오 프로토콜에서 우리는 장비와 태반 관류의 성공적인 수행에 필요한 기술을 설명합니다.

초록

인간의 태반 수십 년 전에이 어머니와 태아 사이에 꿰 뚫을 수없는 장벽이 될 것으로 생각되었다. 그러나 탈리도마이드에 의한 기형아 많은 나중에 연구의 발견은 나중에 반대를 증명했다. 오늘 니코틴 등 여러 가지 유해 생체이는, 헤로인, 메타돈 또는​​ 약물뿐만 아니라 환경 오염 물질이 장벽을 극복하기 위해 설명 하였다. 나노 기술의 사용 증가와 함께, 태반는 실수로 노출을 통해 또는 의도적으로 잠재적 인 나노 메디칼 응용 프로그램의 경우 새로운 나노 입자와 접촉 할 가능성이 높습니다. 태반 대부분의 종 특정 포유류 기관 1이기 때문에 동물 실험의 데이터가 인간에게 추정 할 수 없습니다. 따라서 Panigel 등에 의해 개발 된 생체 이중 순환 태반 관류. 1,967 2 지속적 슈나이더 등으로 수정했습니다. 1,972 3, 우수한 모델 T와 같은 역할을 할 수생체이 또는 입자의 이동을 연구 O를.

여기, 우리는 재현 가능한 결과를 얻기 위해 인간의 태반 관류 프로토콜과 발전을 순환 생체 이중에 초점을 맞 춥니 다.

태반은 제왕 절개 배달을받은 단순한 용어 임신에서 산모의 동의 이후 하였다. 그대로 자​​엽의 태아와 산모의 배는 적어도 5 시간 유관 및 관류 하였다. 모델 입자로 80 사이즈 직경 500 nm의와 찬란 폴리스티렌 입자는 어머니의 회로에 추가되었습니다. 80 nm의 입자는 태반 장벽을 통과하고 500 nm의 입자가 태반 조직이나 산모의 회로에서 유지하는 동안 태아에게 태반을 통해 전송되는 물질에 대한 완벽한 예제를 제공 할 수 있었다. 생체 인간의 태반 관류 모델에 대한 신뢰할 수있는 정보를 제공하는 몇 가지 모델 중 하나입니다예측 및 임상 관련 데이터를 제공하는 중요한 조직 장벽의 생체 이물의 전송 동작.

서문

태반은 산소, 이산화탄소, 영양분과 노폐물과 어머니와 서로 분리 성장 태아의 두 혈액 회로를 유지할 수 동시에 교환을 담당하는 복잡한 기관이다. 또한, 그것은 산모의 면역 시스템에 의해 아이의 거부를 방지하고 임신을 유지하는 호르몬을 분비. 세포 장벽 4,5 측면 세포막없이 진정한 syncytium 퓨즈 및 양식 cytotrophoblast 세포에 의해 형성된다. 전체 태반은 하나의 태아 융모 트리를 포함하고 태반의 하나의 기능 단위를 나타내는 여러 자엽,로 구성되어 있습니다.

태반 장벽 기능의 연구는 1960 년대 탈리도마이드 유도 기형의 발견과 강화되었다. 분명한 이유를 들어 임산부 전위 연구는 수행 할 수 없습니다. 따라서, 다양한 대안 모델을 6,7를 개발되었습니다 까지. 가장 유망한 그리고 아마도 대부분의 임상 관련 모델 Panigel 및 동료 2,3에 의해 개발 된 생체 인간의 태반 관류 모델입니다.

많은 여성들은 이러한 자신의 임신 8 중 마약이나 환경 오염과 같은 다른 생체 이물질에 노출되어 있습니다. 이미 임신 중에 정기적으로 투여 된 마약의 경우, 생체 내 연구에서 제대혈의 그것과 산모의 혈중 농도를 비교하여 수행 할 수 있습니다. 그러나 일반적으로 태아 및 이들 물질의 기형에 약물 동력학 및 역학에 대한 제한된 정보가있다.

헤로인은 쉽게 태반 장벽을 통과하고 자궁 내 성장 제한, 조산이나 자연 유산 9,10으로 이어질 수있는 것처럼 예를 들어 약물. 따라서 임신 중에 실종 금욕의 경우 메타돈과 대체 요법이 권장됩니다. 전생체 인간의 태반 관류 모델은 태아 순환에 메타돈의 전송이 배달 12 후 계산 된 제대혈에 산모의 혈액 농도 비율과 잘 상관 관계를 무시할 11이라고 밝혔다.

나노 기술, 특히 의학의 성장 분야이다. 그래서 자연적으로 잘 발생 (직경 <2.5 μm의)와 산불, 화산 폭발의 연기와 사막의 먼지 미세 입자 (직경 <0.1 μm의), 나노 물질의 노출 (최소 하나의 차원 <0.1 μm의 13 아래 ) 증가하고있다. 이 나노 물질의 독성 가능성에 대한 질문을 제기했다. 어떤 사람의 위험은 아직 입증되지 수 있지만, 설계 나노 입자는 독성 결과 14로 이어지는 부작용 생물학적 반응을 일으킬 수 있음을 나타내는 주요 실험 연구가있다. 최근 일부 연구에 그 태아 노출 표시대기 오염은 신생아 및 어린이 15,16에서 더 높은 호흡 필요와기도 염증에 연결되어 있습니다. 또한, 작은 나노 입자는 특히 태아 나 어머니 중 하나를 치료하는 약물 캐리어로 사용할 수 있습니다. 따라서, 서로 다른 생체 이물질이나 나노 물질과 태반 장벽을 통과 할 수있는 능력의 광범위한 연구가 필요하다는 분명해진다. 나노 물질에 태반 투과성의 현재 연구의 실제 개요 메네 제스 등으로 요약되어 있습니다. 2,011 17 Buerki-Thurnherr 등이. 2,012 7.

인간의 태반 관류 모델을 순환 생체 이중에 대한 책임 메커니즘 등 다양한 내인성 및 외인성 화합물 3,11,12,18,19의 태반 전송 및 태반의 다른 기능의 넓은 범위를 공부 통제하고 안정적인 시스템을 제공 자간전증과 같은 병적 상태의 개발 <> 20-22을 먹다. 축적 효과와 생체 이물질이나 나노 입자의 광범위한 세트의 전위 비율의 연구를 수 있도록이 프로토콜에서 우리는 세트에 주로 최대 초점, 취급 및 방법.

프로토콜

1. 관류 시스템 준비

  1. 물 목욕, 재관류 챔버, 산소에 대한 두 개의 열, 두 개의 연동 펌프, 두 개의 버블 트랩, 두 개의 흐름 히터와 하나의 압력 센서 (그림 1)으로 구성된 관류 시스템을 설정합니다. 그림 2의 방식에 따라 실리콘 및 폴리 염화 비닐 재료로 구성된 튜브 섹션에서 이러한 구성 요소를 연결합니다. 마지막으로 각각 태아와 산모 회로를 나타내는 두 개의 회로가있다.
  2. 물 목욕, 흐름 히터 및 재관류 챔버 가열을 켭니다. 온도는 37 ° C.이어야한다
  3. (NCTC-135 조직 문화 매체 얼의 버퍼 (6.8 g / L 염화나트륨 0.4 g / L 칼륨 염화물, 0.14 g / L 글루타민산 소다 인산염, 0.2 g / L 황산 마그네슘 0.2 g과 1:2 희석 살포 매체를 워밍업 / L 칼슘 염화물, 2g / L 포도당) 포도당 이하 (1 g / L), 덱스 트란 40 (10 G / L), 소 혈청 알부민 (10g로 보충/ L), 나트륨 헤파린 (2,500 IU / L), amoxicilline (250 ㎎ / L)와 중탄산 나트륨 (2.2 g / L)의 물을 욕조에 산도 7.4).
  4. - 20 ML 15 연속 다시 증류수 200 mL (유량) 200 mL를 증류수로 태아와 산모 회로의 동맥 시스템, B) 50 ML 1 % 수산화 나트륨, C) 1 % 인산 D)를 씻어 / 분).
  5. 태아의 정맥에 연결합니다 (Ø 1.2 mm, 무딘 바늘 수정 된 날개 달린 바늘 주입 세트에 연결해야합니다) 태아 동맥 튜빙.
  6. 모든 튜브 매체 (: 15-20 ML / 분 유량)를 포함 할 때까지 관류 매체와 태아와 산모 회로의 동맥 시스템을 씻어. 이 단계에서 버블 트랩을 작성하고 트랩의 거품 스트림을 제거합니다. 그런 다음 펌프를 중지합니다. 그것은 심성 동맥 튜브는 항상 거품이 없는지 정말 중요합니다, 그렇지 않으면 도관졌다가 특히 좋은 태아 혈관이 파열 할 수 있습니다.
  7. 가스 흐름을 켭니다. 산모의 회로는 위스콘신에 산소 공급일 5 % 이산화탄소와 5 % 이산화탄소와 95 %의 질소와 95 %의 합성 공기와 태아 회로.
  8. 압력 센서의 기록을 시작합니다.

2. 태반을 Cannulating

  1. 기본 제왕 절개 후 단순한 용어 임신에서 그대로 태반을 구하십시오. 서면 동의는 납품의 앞에 어머니에 의해 (우리의 연구의 경우에서 얻어진) 부여되어야하며 연구 (우리의 연구의 경우 WAS) 지역 윤리위원회의 승인을 받아야합니다. 먼저 시각적 컨트롤은 건강하고 그대로 태반을 보장하기 위해 조산사에 의해 수행되어야한다.
  2. 태반의 도관은 중요한 단계입니다! 재관류시 조직의 모든 작은 혼란은 임산부와 태아 순환 사이의 누수가 발생할 수 있습니다. 태반은 출산 후 30 분 이내에 얻을 수있다.
  3. 산모의 측면에서 볼 차질없이 태반의 한계 영역에서 그대로 떡잎을 선택합니다. 융모 판에,제대 동맥 수술 봉합사를 사용하여 나중에 도관 측 (탯줄을 향해) 상류 정맥을 모두 연결 지점을 묶어. 항상 두 개의 매듭을 만든다.
  4. 먼저 태아 동맥 Cannulate. 태아 태반 동맥은 항상 정맥보다 작고 얇은입니다.
  5. 태아 동맥 주위 봉합을하지만, 즉시 묶어하지 않습니다. 집게와 배를 잡고 조심스럽게 혈관을 잘라 동맥에 작은 정맥 (Ø 1.2 mm)를 넣습니다. 다음 봉합 (2 개 매듭)를 묶어.
  6. 같은 방법으로 태아의 정맥을 진행하지만 더 큰 정맥을 사용 (Ø 1.5-1.8 mm, 무딘 바늘 수정 된 날개 달린 바늘 주입 세트에 연결해야합니다.)에게
  7. 태아 펌프 (2 ㎖ / 분)를 켭니다. 거기에 눈에 띄는 누수가없고 혈액이 태아의 정맥 정맥에서 발산하는 경우, 천천히 4 ML / 분까지의 흐름을 증가시킵니다. 태아 동맥의 압력을 관찰, 그것은 70 mmHg로를 초과하지 않아야합니다. 태아 또는 동료에 액체가 새어 경우rnal 정맥는 다른 봉합사를 고정합니다.
  8. 태아면 조직 홀더 태반을 놓고 스파이크를 통해 태반 막과 조직을 당겨. 결국 관류 떡잎은 조직 홀더의 구멍의 중간에 있어야합니다.
  9. 단지 막 실리콘 막 (Ø 1mm) 또는 양자 택일로 두 파라 필름 (parafilm) 조각과 태반을 보유하고있는 부분을 안정.
  10. 전체 조직 홀더를 조립 나사를 조여 걸쳐 조직을 잘라. 정맥 및 동맥 캐 뉼러가 눌리지 않았는지주의 대신 조직 홀더의 작은 채널에 누워하시기 바랍니다.
  11. 거꾸로 조직 홀더를 돌려 재관류 챔버에 넣고 덮개를 추가합니다. 이제, 산모 측 상단에 있어야합니다. 태아 회로 그대로이고 매체가 태아 정맥 튜브로 흐르는 경우 항상 확인합니다.
  12. 임산부 펌프 (12 ML / 분)를 켭니다. 일에 세 무뚝뚝한 캐 뉼러 (Ø 0.8 mm)를 소개탈락 판을 관통하여 intervillous 공간으로 모체 동맥 튜브의 전자 끝. 임산부 회로에 관류을 반환하면 재관류 챔버의 상부에 가장 낮은 위치에 산모 펌프와 연결되어 정맥 배수로서 하나의 튜브를 넣어.
  13. 태아 정맥 튜브에 태아 정맥 정맥을 연결합니다.

3. 관류의 사전 및 실험 단계를 실행

  1. 조직이 배달 후 허혈 기간에서 복구하고 intervillous 공간에 혈액을 밖으로 플러시 수 있도록, 20 분 전 단계 개방이 필요합니다. 임산부와 태아의 정맥을 의미 관류 매체를 포함 동맥 저수지로 이어지는되지 않습니다. 병에 태아와 산모의 정맥 유출을 수집하고 사전 단계 후 폐기합니다.
  2. 관류의 무결성을 평가하는 것은 20 분의 또 다른 사전 단계를 수행하지만, 폐쇄 회로한다. 관류 중간에 두 개의 별도의 공기통을 사용하여태아와 산모 회로와 태아 저수지와 산모 저수지 산모의 정맥 유출 뒤 다시 태아의 정맥 유출을 선도하여 회로를 닫습니다.
  3. 주요 관류 실험 120 ML 관류 매체 (임산부를위한 하나 태아 ​​저수지 하나) 두 개의 플라스크를 준비합니다. 하나는 산모의 저수지에 분석하고자하는 찬란 생체 이물 또는 나노 입자 (방사성 물질; 긍정적 인 제어 역할을주의 4 NCI / ㎖)이 방사성 동위 원소 14 C-antipyrine을 추가합니다. 또한 산모의 관류를 섞는다.
  4. 두 준비한 플라스크 (태아와 산모 저수지)와 함께 순수 관류 매체를 교환하여 실험을 시작합니다. 태아 저수지 태아의 정맥 유출 뒤와 산모 저수지 산모의 정맥 유출 백을 선도하여 회로를 닫습니다.
  5. 6 시간 동안 재관류를 계속하고 정기적으로 샘플을 채취. 항상 태아와 산모의 매체를 resuspend을탈퇴하기 전에 저수지.
  6. 관류 동안 태아의 동맥 (70 mmHg로를 초과하지 않아야), 두 회로의 산도 (생리적 범위 7.2-7.4에 있어야) 및 저수지의 음량 (태아 볼륨 손실이 4 ML / 시간을 초과하지 않아야한다)의 압력을 조절 . 필요하다면 염산 또는 수산화 나트륨을 사용하여 산도 값을 조정합니다.
  7. 태아 저수지에서 볼륨 손실이 4을 초과 할 경우 ML / HR이 조직에 누수 하나는 살포를 중지 할 수 있습니다. 누출없이 6 시간 동안 재관류 성공률은 15-20 %이다.
  8. 6 시간 후 재관류를 중지합니다. 펌프, 수조, 흐름 히터 및 가스 흐름을 켭니다.
  9. 조직 홀더에서 태반을 제거, 관류 떡잎을 잘라 (unperfused 조직보다 밝게)와 무게.
  10. unperfused (처음에 삭감 된 태반의 일부, 이미 전 단계에서 수행 될 수 있었다)에서 샘플을 채취하고 관류 조직 (각 약 1 g) 및 -20 ° C에서 보관균질화까지 이상 분석을위한 액체 질소합니다. 조직 병리학 적 평가를 위해 포르말린 4 %에서 다른 조직 샘플을 수정합니다. 샘플은 태반의 모든 레이어를 포함해야합니다.
  11. ) 연속적) 200 mL를 증류수로 B를 태아와 산모 회로의 동맥 시스템을 세척하여 50 ML 1 % 수산화 나트륨, C)을 다시 50 ML 1 % 인산 d)에 증류수 200 mL를 관류 한 후 튜브를 청소 (유량 : 15-20 ML / 분).

태반 관류 실험의 전체 작업 과정은 그림 3에 묘사되어있다.

4. 샘플 분석

  1. 잔류 적혈구를 제거하기 위해 분석 전에 800 XG에서 10 분 동안 관류 샘플을 원심 분리기. 추가 분석을 위해 상층 액을 가져 가라. 샘플은 4 ℃에서 하룻밤 남아있을 수 있습니다 렙틴과 hCG의 생산의 분석을위한 시료는 -20 ° C.에 저장할 수 있습니다
  2. 의 투과성을 평가하기 위해태반은 액체 섬광에 의해 C-antipyrine 14 분석합니다. 베타 카운터 5 분 3 ML의 섬광 칵테일과 측정으로 태아와 산모의 시료 300 μl를 섞는다.
  3. 형광 나노 입자의 양도 또는 관심의 생체 이물이 마이크로 리더 (표시된 파장은 우리가 나노 입자에 사용되는 노란색 녹색 라벨의 분석 용)의 485 nm의 여기 및 528 nm의 방출에 형광을 읽으을 평가합니다.
  4. 관류 측정시 태반 조직의 포도당 소비와 자동 혈액 가스 시스템과 태아와 산모의 회로에서 젖산 생산의 가능성을 확인하십시오. 또한, 태반 호르몬 인간 choriongonadotropin (hCG를) 효소 결합 면역 분석 (ELISA)에 의한 균질 조직 샘플 및 관류 렙틴의 생산을 평가합니다.

결과

그림 4A는 태아의 구획에 전송되지 않은 큰 폴리스티렌 입자 (500 NM)에 비해 태반을 통해 전송 된 작은 폴리스티렌 입자 (80 nm의)의 재관류 프로파일을 보여줍니다. 각 데이터 포인트는 최소 3 독립적 인 실험의 주어진 시점까지의 평균 입자 농도를 나타냅니다. 폴리스티렌 태반 전송 사이즈에 따라 19입니다 나노 입자. 500 nm의 폴리스티렌 입자도 재관류 6 시간 후 태아의 회로에?...

토론

이중 순환 살포는 여기에 보여 아래에 대답해야하는 질문에 따라 가능한 여러 가지 다른 실험 구성도이다. 특히 오픈 태반 perfusions는 일반적으로 정상 상태 농도 3시 약물 허가를 평가하는 데 사용됩니다. 순환 관류 셋업은 내인성 또는 외인성 물질의 능동 수송을 확인하기 위해 적용 할 수 있습니다. 이 방법에 대한 생체 이물의 동일한 농도는 산모와 태아 순환에 추가 할 수 있습니다. 농...

공개

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

감사의 말

이 작품은 재정적 스위스 국립 재단 (NRP 64 프로그램에는 4064-131232 권한을 부여하지 않음)에 의해 지원됩니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
NCTC-135 mediumICN Biomedicals, Inc.10-911-22Ccould be replaced by Medium 199 from Sigma (M3769)
Sodium chloride (NaCl)Sigma-Aldrich, Fluka71381
Potassium chloride (KCl)Hospital pharmacyalso possible: Sigma (P9541)
Monosodium phosphate (NaH2PO4 · H2O)Merck106346
Magnesium sulfate (MgSO4 · H2O)Sigma-Aldrich, Fluka63139
Calcium chloride (CaCl, anhydrous)Merck102388
D(+) Glucose (anhydrous)Sigma-Aldrich, Fluka49138
Sodium bicarbonate (NaHCO3)Merck106329
Dextran from Leuconostoc spp.Sigma-Aldrich31389
Bovine serum albumin (BSA)ApplichemA1391
Amoxicilline (Clamoxyl)GlaxoSmithKline AG2021101A
Sodium heparinB. Braun Medical AG3511014
Sodium hydoxide (NaOH) pelletsMerck106498CAUTION: corrosive
Ortho-phosphoric acid 85% (H3PO4)Merck100573CAUTION: corrosive
Maternal gas mixture: 95% synthetic air, 5% CO2PanGas AG
Fetal gas mixture: 95% N2, 5% CO2PanGas AG
Antipyrine (N-methyl-14C)American Radiolabeled Chemicals, Inc.ARC 0108-50 μCiCAUTION: radioactive material (specific activity: 55mCi/mmol)
Scintillation cocktail (IrgaSafe Plus)Zinsser Analytic GmbH1003100
Polystyrene particles 80 nmPolyscience, Inc.17150
Polystyrene particles 500 nmPolyscience, Inc.17152
EQUIPMENT
Water bathVWR462-7001
ThermostatIKA-Werke GmbH Co. KG3164000
Peristaltic pumpsIsmatecISM 833
Bubble traps (glass)UNI-GLAS Laborbedarf
Flow heaterUNI-GLAS Laborbedarf
Pressure sensor + Software for analysesMSR Electronics GmbH145B5
NotebookHewlett Packard
Miniature gas exchange oxygenatorLiving Systems InstrumentationLSI-OXR
Tygon Tube (ID: 1.6 mm; OD: 4.8 mm)IsmatecMF0028
Tubes for pumps (PharMed BPT; ID: 1.52 mm)IsmatecSC0744
Blunt cannulae ( 0.8 mm)Polymed Medical Center03.592.81
Blunt cannulae ( 1.2 mm)Polymed Medical Center03.592.90
Blunt cannulae ( 1.5 mm)Polymed Medical Center03.592.94
Blunt cannulae ( 1.8 mm)Polymed Medical Center03.952.82
ParafilmVWR291-1212
Perfusion chamber with tissue holder (plexiglass)Internal technical departmentSimilar equipment is available from Hemotek Limited, UK
Surgical suture material (PremiCron)B. Braun Medical AGC0026005
Winged Needle Infusion Set (21G Butterfly)Hospira, Inc.ASN 2102
Multidirectional stopcock (Discofix C-3)B. Braun Medical AG16494C
Surgical scissorsB. Braun Medical AGBC304R
Dissecting scissorsB. Braun Medical AGBC162R
Needle holderB. Braun Medical AGBM200R
Dissecting forcepsB. Braun Medical AGBD215R
Automated blood gas system Radiometer Medical ApSABL800 FLEX
Multi-mode microplate readerBioTekSynergy HT
Liquid scintillation analyzerGMI, Inc.Packard Tri-Carb 2200
Scintillation tubes 5.5 mlZinsser Analytic GmbH3020001
Tissue HomogenizerOMNI, Inc.TH-220
pH meter + electrodeVWR662-2779

참고문헌

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