比较方法来表征景观的宿主 - 病原体蛋白 - 蛋白相互作用

摘要

本文重点介绍高信心之间的相互作用数据库宿主与病原体的蛋白质结合使用两个正交的方法识别：酵母双杂交，然后通过高通量相互作用的检测在哺乳动物细胞中名为HT-GPCA。

摘要

聚集产生重大努力大型综合性蛋白质 - 蛋白质相互作用网络图。这是有助于理解病原体的宿主关系，基本上是由遗传放映酵母双杂交系统。由Gaussia基于荧光素酶片段互补法检测蛋白质相互作用最近有所改善，现在提供了发展的机会，中西医结合的比较interactomic的方法必须严格比较不同的病原体菌株变种对一组共同的细胞因子的蛋白质的互动型材。

本文特别着重于实用程序相结合的两个正交的方法生成的蛋白质-蛋白质相互作用的数据集：酵母双杂交（Y2H）和一个新的测定法，高通量Gaussia颤蛋白互补法（HT-GPCA）在哺乳动物细胞中进行。 NT“>大型识别病原体蛋白细胞伙伴进行通过交配的酵母双杂交放映cDNA文库使用多个病原体应变变种。是进一步的交互合作伙伴上选择了高可信度的统计评分的一个子集验证整套的病原体变体的蛋白质，使用HT-GPCA成对的相互作用，在哺乳动物细胞中的两个互补的方法，此组合提高了鲁棒性的交互数据集，并允许严格的比较相互作用分析的性能，这样的比较interactomics构成一个可靠和强大战略破译任何病原主机interplays的的。

引言

越来越多的数据收集产生的蛋白质 - 蛋白质相互作用图谱打开的角度来进一步了解病原体的感染。随着全球病原体感染的认识开始出现，它提供了访问连接时，病原体蛋白诱导人类蛋白质组¹范围内的扰动。因此，它提供了一种方式来理解，病原体如何操纵宿主细胞的机械。特别是，一些病毒宿主相互作用网络的映射显示，病毒蛋白的优先目标主机蛋白高度蜂窝网络中的连接（集线器），或中央许多在一个网络中的路径（瓶颈蛋白^）2-4。这些互动让病毒操纵重要的蜂窝流程，这是有助于复制并产生感染性子代。最近进行相关病毒与目标提取信息相对比较相互作用映射发病机制^4。此外，研究宿主病原体相互作用景观一直延伸到许多病原体^5。针对性的细胞因子识别提供洞察战略病原体感染细胞，并允许潜在的致病性标志物的检测。

酵母双杂交系统是目前最流行的方法来识别二进制交互作用，因为遗传筛查是一种高效，敏感的蛋白质 - 蛋白质相互作用的高通量映射工具。这里提出的方法，进一步提高个别Y2H放映通过评估多种病原体的蛋白质应变变种，从而提供比较概述病原宿主蛋白 - 蛋白相互作用。此外，酵母双杂交筛选的一个主要限制在于较高的假阴性率，因为它恢复约20％的总相互作用^6。这意味着，只有一个子集的病理检测的相互作用一族变种可能逃脱检测与他人。因此，从所有双杂交放映个别合作伙伴，新兴的互动与研究菌株齐全的进一步挑战，提供比较相互作用数据库。因为它表明，结合不同的方法强烈地增加了鲁棒性的蛋白-蛋白相互作用的数据集^7，此验证在哺乳动物细胞中进行了新开发的蛋白质片段互补法称为HT-GPCA ^8。此细胞为基础的系统允许，Gaussia颤通过互补性分裂的蛋白质的相互作用的检测荧光素酶和已被设计为具有高通量的格式兼容。基于其发光技术及其背景噪音低，与其他基于荧光检测相比，HT-GPCA显示了惊人的高灵敏度。

总体而言，这种做法构成了一个高效工具来生成一个全面的映射宿主 - 病原体interplays的，它代表一个全球性的理解宿主细胞劫持的第一步。

研究方案

1。酵母双杂交放映

1. 进行以下所需的解决方案：
   1. 完成合成跌落式（SD）：与葡萄糖在1升水中溶解26.7克的最小SD基地。添加氨基酸混合物制备如下：将2克精氨酸盐酸盐，2克2克腺嘌呤硫酸盐，2克盐酸组氨酸异亮氨酸，2克，4克亮氨酸盐酸赖氨酸，将2克，蛋氨酸2克，苯丙氨酸3克G L 2丝氨酸，2 G L-苏氨酸， 色氨酸 3克，2克酪氨酸，1.2克尿嘧啶，缬氨酸9克。
   2. 选择性输出SD-L/-W/-H下降：SD每一个人体必需的氨基酸，除了那些指定（-L-亮氨酸-W-色氨酸-H-组氨酸）。
   3. YPGLU：对于1升，重10克的酵母提取物，细菌用胰蛋白胨10克，20克葡萄糖。完成25克细菌琼脂固体培养基。
   4. YCM：与为YPGLU，但是pH值调整到4.5。
2. 交配和蔓延
   1. 使用冷冻等分预变换ED Y187酵母菌株（交配型α）cDNA文库克隆PACT2。 SD-L板电镀系列稀释检查细胞活力。
   2. 病原体ORF克隆到酵母表达载体pGBKT7，重组质粒转化AH109酵母菌株（交配型）使用的标准程序。
   3. 差价构建转化AH109酵母SD-W板。在培养箱中孵育至少两天30℃。板可在4℃下储存，​​直到双杂交筛选。
   4. 使用3 - 氨基三唑（3-AT），HI​​S3酶的竞争性抑制剂，抵消潜在的HIS3报道基因的转录自病原体的蛋白质。执行自动激活试验确定的浓度为3-AT的构建转化酵母的生长，从而防止在SD-W/-H平板。
   5. SD-W种子30毫升的构建转化AH109几个殖民地。在30°C孵育30小时旋转。
   6. 种子的SD-W与30毫升200毫升的AH109文化。在30℃下孵育20小时左右旋转
   7. 孵育，孵育10分钟，在30℃下用旋转20毫升YPGLU的解冻cDNA文库转化Y18​​7。
   8. 离心构建转化AH109用相当量的5分钟，在3,500 rpm转速的可行Y187酵母细胞的培养相应的体积在20℃下小心翼翼地撤回上清，重悬沉淀在10毫升YPGLU。
   9. 混合悬浮的AH109酵母与含Y187库。在50毫升管中的传输。离心5分钟，在3,500 rpm转速在20°C，仔细退出上清（脆弱沉淀）。
   10. 一共拿到在YPGLU悬浮颗粒1.5毫升。
   11. 传播酵母3 YCM-琼脂150毫米板，0.5毫升/板。孵育4.5小时，在30°C。
   12. 收集从YCM板，刮耙玻璃，在10毫升SD-L/-W/-H交配酵母。冲洗板两次用5毫升SD-L/-W/-H媒体和游泳池。
   13. 在3,500 rpm转速离心5分钟，20℃。弃上清，悬浮酵母沉淀在5毫升SD-L/-W/-H介质。
   14. 差价10板（0.5毫升/板）辅以适当浓度的3 - 氨基三唑（3-AT）在自动激活测试确定的SD-L/-W/-H琼脂酵母交配。在30°C孵育，湿度条件下6-10天。
   15. 确定二倍体（2n）的速率，以评估通过传播250μl的系列稀释液（10 ^{-4〜10 -6）}的交配的酵母悬浮液上SD-L/-W板的配合效率。两天，在30℃下孵育板。与计数菌落生长SD-L/-W，推断出总的二倍体数存在于酵母的交配的初始体积。报告这个二倍体可行库含酵母数计算的二倍体率。它的范围应该10-25％左右。
   16. 6-10天孵化后，在30°C，挑交配的酵母菌菌落在新鲜SD-L/-W/-H + 3-AT板。 [ 提示：为了酵母在计划8线再现96孔板中的12个孔，这样它会更容易之后测序]。让酵母菌菌落生长为4-5天，在30℃在加湿的气氛中。
3. 筛选的HIS3阳性克隆通过PCR和测序
   我们的目标是PCR扩增的ORF中所载的质粒pACT2的酵母载体上生长的菌落选择性SD-L/-H/-W板。
   1. 将96孔PCR板在冰上。
   2. 以裂解酵母细胞，每孔50μl的Zymolase 20T溶液（2.5 mg / ml的10mM的HEPES缓冲液pH 7.7）添加。
   3. 轻轻悬浮每一个菌落。
   4. 在37℃和15分钟，在95℃下孵育15分钟
   5. 把盘子放在冰上。每孔加入50微升的蒸馏水。上下吹打拌匀。
   6. 离心5分钟，在3,500 rpm和4℃。
   7. PCR扩增10微升来检测插入物，使用引物退火是来自于cDNA的质粒pACT2载体的ORF两侧。该协议是g尔文96 ExTaq聚合酶裂解酵母菌落的扩增。需准备以下组合：525微升10×ExTaq缓冲液，420微升的dNTPs混合（2.5毫摩尔），10.5微升正向引物（1微克/微升）10.5微升反向引物（1微克/微升）31.5微升ExTaq（5 U /μl的）和3202.5微升H _{2 O中} 。分发40微升的搭配，每孔96孔PCR板。加入10微升裂解酵母每口井。执行放大如下：94℃3分钟，然后35个循环，在94℃下30秒，60℃1分钟，72℃下4分钟，结束与72℃7分钟。运行3微升的PCR产物在1.2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR阳性克隆。需要注意的是使用预投了96以及琼脂糖凝胶建议。
      [提示：板可以在-20°C存储了几个月，并重新用于新的PCR]
   8. 序列的PCR扩增片段孤立从HIS3的阳性克隆。执行BLAST分析识别蜂窝ORF。低信任路线（E值＆> 10 ^-10，身份<80％，<20个氨基酸肽长度）被丢弃，以及frameshifted和含有提前终止密码子序列。

2。 HT-GPCA矩阵建设

HT-GPCA是哺乳动物的基于细胞的测定，其中的病原体和宿主蛋白瞬时表达融合到分割Gaussia颤荧光素酶片段互补。当贸易伙伴的相互作用，这种酶被重新允许其酶活性的措施。相互作用强度，从而推导出归一发光比率（见下图1）

4. 选择宿主细胞伙伴的
   1. 选择确定在哺乳动物细胞中的进一步验证在Y2H放映的三倍以上的蛋白质，以增加的数据集的信心^9。
   2. 添加已知位置的病原体蛋白质相互作用的合作伙伴VE控制。
5. 转移到HT-GPCA兼容的载体
   1. 克隆每个病原体蛋白的ORF中的pSPICA-N2向量生成病原体蛋白与氨基酸110至185的萤光素酶融合在其N-末端（GL2-病原体蛋白融合）的人源化Gaussia颤 。
   2. PCR扩增的细胞蛋白的ORF直接从酵母双杂交阳性克隆或从其他ORF的资源（人类的ORFeome http://horfdb.dfci.harvard.edu/ ）的，并将它们传送到pSPICA-N1载体中，以产生融合蛋白在N-末端与氨基酸18至109，人性化Gaussia荧光素酶颤 （GL1主机蛋白融合）。
      [提示：对于大规模克隆，网关克隆系统的建议。在这种情况下，进行PCR扩增，使用设计为包含网关兼容的位点的引物]。
   3. 所有序列的表达载体。 pSPICA-N1和pSPICA的-N2的序列的参考文献8中可以找到。

请注意，质粒结构可以反转， 即病原体蛋白在pSPICA-N1和宿主蛋白到pSPICA-N2。

3。高通量Gaussia颤基于荧光素酶蛋白质互补技术（HT-GPCA）

6. 细胞转染
   1. 种子染293T细胞，在35万个细胞/ ml的DMEM，10％胎牛血清（FBS）的无抗生素。分发100μl/孔，在无菌的白色培养板。在一次实验中，不超过10板。让细胞生长24小时，在37℃5％CO _2。
      [ 提示：，由于pSPICA质粒包含SV40原点的，293T细胞中的使用允许其在转染细胞中的复制，从而导致过度的两种荧光素酶片段。]
   2. 次日，使用任何适当的转染协议的转染细胞。需要注意的是，怒江一定的转染试剂MBER种子细胞可能会进行调整。使用100纳克每口井的病原体和宿主ORF质粒结构。共转染10纳克每口井的CMV-萤火虫荧光素酶质粒转染效率的正常化。每个点都一式三份进行测试。
      [ 提示：转染前一天，可以进行DNA混合，并储存在-20℃下用粘接剂密封。]
   3. 转染混合物转移至293T细胞培养板。要小心，轻轻地沉积到细胞的DNA混合，293T强粘附性，和容易地从井的底部分离。用5％的CO ₂在37℃下孵育24-30小时，在细胞培养孵化器。

7. 细胞的裂解和Gaussia荧光素酶用量
   1. 洗涤细胞，用PBS（100μl/孔）。加入40μl1X 海肾裂解缓冲液。搅拌下，在室温下孵育30分钟。
   2. 10微升的细胞裂解液保存在另一个白色平台E随后剂量的萤火虫荧光素酶的活性。储存在4℃下，或者在-20℃下与密封。
   3. 测量的Gaussia活动的剩余30μL细胞裂解液加入100微升海肾萤光素酶检测试剂和计数光度计发光，持续10秒。 96孔板的剂量需要约半小时。因为冷冻或长期储存可能会影响相互作用介导Gaussia活动的新鲜细胞提取物进行测量。

8. 萤火虫活动的测量
   1. 测量萤火虫活性，对保存的10微升的细胞裂解液，加入50μl的萤火虫荧光素酶测定试剂和数量，持续10秒的发光。 96孔板的剂量需要约半小时。 [ 提示：萤火虫荧光素酶的用量可以进行冷冻裂解后的第二天。

9. NLR计算
   1. 对于每个交互，计算Gaussia荧光素酶活性和萤火虫荧光素酶活性，以获得归一化Gaussia考虑到账户的转染效率和细胞存活率的发光值之间的比率。计算三次重复的平均值。
   2. 要监视的相互作用，估计每个病原体宿主对归一发光比率（NLR）。要做到这一点，除归Gaussia发光测量控制井的活动的总和（改编自8参考图1）病原体和宿主蛋白存在活性检测。据估计，大约3.5 ⁸ NLR良性互动的截止值。

10. 数据分析
    1. 使用R统计软件包进行分层聚类。首先，组NLR数据进行分类，然后计算出一个互动树状使用完整的联动方法。这个可视化“树形图¹⁰ JavaTreeView。计算互动Pearson相关系数聚类分析和进化树之间的距离。
    2. 要产生互动网络，选择良性互动从HT-GPCA数据集和使用在Cytoscape的软件^1。宿主蛋白的提取度，并绘制其分布访问本地网络的动态。主机病原体网络可以叠加到宿主相互作用组病原体蛋白在宿主细胞网络在全球的影响提供了一个评估。
    3. 提取与目标细胞因子与大卫的生物信息学数据库¹²评估数据集的功能富集的GO（Gene Ontology的）条款。

结果

HT-GPCA的主要优势在于它的高灵敏度，假阳性和假阴性率HPV E2蛋白在图2（改编自参考文献13）所示的评估。要确定假阴性率，已知的相互作用进行了评估，从HPV16 E2 HT-GPCA（ 图2A）。满分18相互作用没有恢复（对应于22％的假阴性率）。假阳性相互作用测定为5.8％，使用12种HPV E2蛋白对细胞的蛋白质（ 图2B）一组随机的。此外，特异性强的方法是突出图2C

讨论

独立，酵母双杂交和哺乳动物的相互作用分析，，如GST拉下来，LUMIER或MAPPIT，已被证明是有效的工具来检测蛋白质 - 蛋白质相互作用，但假阳性和假阴性率高的限制与这些技术^15的相互作用。此外，越来越多的证据正交的方法相结合，提高了可靠性，得到的交互数据集^7。这里描述的的HT-GPCA技术的最新发展，不仅提高了检测的灵敏度二进制在哺乳动物细胞中蛋白质相互作用，但也?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Yeast strains	Clontech
Minimal SD base	US biological	D9500
Amino acids	Sigma
3-amino-1,2,4-Triazole (3-AT)	Acros organics	264571000
Zymolase	Seikagaku	120491
DMEM	Gibco-Life Technologies	31966
Fetal bovine serum	BioWest	S1810
Phosphate buffer Saline (PBS)	Gibco-Life Technologies	14190
Penicillin-Streptomycin	Gibco-Life Technologies	15140
Trypsin-EDTA	Gibco-Life Technologies	25300
Renilla luciferase assay	Promega	E2820
White culture plate	Greiner Bio-One	655083
96-wellPCR plates	4titude	4t-i0730/C
Incubator (30 °C)	Memmert
Incubator (37 °C)	Heraeus
Luminometer	Berthold	Centro XS-LB 960