גישה השוואתית כדי לאפיין את הנוף של אינטראקציות בין חלבונים מאכסן לפתוגן

Summary

מאמר זה מתמקד בזיהוי של מערכי נתונים אינטראקציה גבוה בין המארח בטוח וחלבוני הפתוגן באמצעות שילוב של שתי שיטות מאונך: שמרים שני היברידיים ואחרי assay אינטראקציה תפוקה גבוהה בתאי יונקים הנקרא HT-GPCA.

Abstract

מאמצים משמעותיים נאספו ליצירת מפות רשת אינטראקציה בין חלבונים מקיפות בקנה מידה גדולה. זו היא סייעה להבין את יחסי פתוגן-מארחים ולמעשה בוצעה על ידי הקרנות גנטיות בשמרים שתי מערכות היברידיות. השיפור האחרון של זיהוי אינטראקציה בין חלבונים על ידי assay שלמת בר מבוסס לוציפראז Gaussia מציע כעת את ההזדמנות לפתח גישות interactomic השוואתיות אינטגרטיביים הדרושים על מנת להשוות בקפדנות פרופילי אינטראקציה של חלבונים מגרסות זן פתוגן שונים נגד מערך משותף של גורמים הסלולר.

מאמר זה מתמקד באופן ספציפי את השירות של שילוב של שתי שיטות מאונך ליצירת מערכי נתונים אינטראקציה בין חלבונים: שמרי שני היברידי (Y2H) ובדיקה חדש, assay תפוקה גבוהה Gaussia Princeps חלבון שלמה (HT-GPCA) שבוצע בתאי יונקים. NT "> זיהוי בקנה מידה גדול של שותפים הסלולר של חלבון הפתוגן מבוצע על ידי הזדווגות מבוססת שמרי הקרנות שתי היברידיות של ספריות cDNA באמצעות גרסאות זן פתוגן מרובות. משנה של שותפים באינטראקציה שנבחרו על ניקוד ברמת הוודאות גבוהה הוא סטטיסטי נוסף תוקף בתאי יונקים לאינטראקציות חכמות זוג עם המערך השלם של חלבוני גרסאות פתוגן באמצעות HT-GPCA. זה שילוב של שתי שיטות משלימות משפר את חוסנו של מערך יחסי הגומלין, ומאפשר ביצועים של ניתוח השוואתי אינטראקציה מחמירה. interactomics השוואתי כאלה מהווה אסטרטגיה אמינה וחזקה לפענח כל interplays הפתוגן-מארח.

Introduction

הכמות הולכת והגדלה של נתונים שנאספו כדי ליצור מפות אינטראקציה בין חלבונים פותחת אופקים כדי להבין עוד יותר זיהומי הפתוגן. ככל שהבנה הגלובלית של זיהומי פתוגן מתחילה להתגלות, הוא מספק גישה למגוון של הפרעות הנגרמות על ידי חלבוני גורמי מחלה בעת חיבור proteome האנושי ^1. זה ובכך מציע דרך כדי להבין איך לתפעל את מכונות פתוגנים התא המארחת. בפרט, המיפוי של מספר רשתות אינטראקציה ויראלי-מארחות גילה כי חלבונים נגיפיים מעדיפים למקד חלבונים מארחים שהם מאוד מחוברים ברשת הסלולרית (רכזות), או שהם מרכזיים בנתיבים רבים ברשת (חלבוני צווארי בקבוק) ^2-4. אינטראקציות אלה מאפשרים לוירוסים כדי לתפעל תהליכים תאיים חשובים, אשר היא סייע לשכפל ולייצר צאצאים מדבקים. מיפוי אינטראקציות השוואתי שנערכו לאחרונה על וירוסים הקשורים במטרה לחלץ מידע ביחס לפתוגנזה ^4. יתר על כן, מחקרים של הנוף מארח פתוגנים האינטראקציות שהורחבו לפתוגנים רבים ^5. זיהוי הגורמים ממוקד התא מספק תובנות האסטרטגיות בשימוש על ידי פתוגנים להדביק תאים ומאפשר זיהוי של סמנים פתוגניים פוטנציאליים.

המערכת דו היברידי השמרים היא השיטה הפופולרית ביותר לזיהוי אינטראקציות בינאריים מאז סריקות גנטיות היא כלי יעיל ורגיש למיפוי תפוקה גבוהה של אינטראקציות בין חלבונים. הגישה מוצעת כאן עוד יותר משפר את הקרנות Y2H בודדות על ידי הערכת חלבון של גרסאות זן פתוגנים רבות, המספק גישה לסקירה השוואתית של אינטראקציות בין חלבונים הפתוגן-מארחים וכך. יתר על כן, מגבלה עיקרית של הקרנת שתי היברידי שמרים טמון בשיעור שגוי שלילי גבוה, מאחר שהוא מתאושש כ -20% מאינטראקציות סה"כ ^6. משמעות הדבר הוא כי אינטראקציות עם אותרו רק קבוצת משנה של פתיוגרסאות גנס אולי חמקו מזיהוי עם האחרים. לכן, שותפים בודדים המתעוררים מכל ההקרנות של שתי ההיברידיות מאותגרים עוד יותר לאינטראקציה עם מגוון רחב של זנים למדו מלא, ומספקים מערכי נתונים השוואתיים אינטראקציה. מאז שהוכיח כי שילוב מתודולוגיות שונות מגביר משמעותי את החוסן של מערכי נתונים אינטראקציה בין חלבונים ^7, אימות זה מבוצעת בתאי יונקים ידי assay שלמת חלבון שבר חדש שפותח בשם HT-GPCA ^8. מערכת מבוססת תא זה מאפשר זיהוי של אינטראקציות חלבון על ידי שלמה של Princeps Gaussia לפצל לוציפראז ותוכנן כך שיתאים לפורמט תפוקה גבוהה. הודות לטכנולוגיה המבוססת על הארה שלה ורעש הרקע הנמוך שלה בהשוואה לassay הקרינה מבוססת אחרים, HT-GPCA מציג רגישות גבוהה להפליא.

באופן כללי, גישה זו מהווה יעילהכלי ליצירת מיפוי מקיף של interplays מאכסן לפתוגן, המייצג את הצעד הראשון לקראת הבנה גלובלית של התא המארח חטיפה.

Protocol

1. שתי הקרנות היברידיות-שמרים

1. הפוך את פתרונות הדרושים הבאים:
   1. מתוך סינטטי מלא בגלילה (SD): לפזר 26.7 גרם של בסיס SD מינימאלי עם גלוקוז ב1 ליטר של מים. הוסף 2 גרם של תערובת חומצת אמינו מוכנה כדלקמן: hemisulfate 2 גרם אדנין, 2 גרם ארגינין הידרוכלוריד, 2 גרם היסטידין HCl, 2 גרם Isoleucine, 4 גרם לאוצין, 2 גרם ליזין הידרוכלוריד, 2 גרם מתיונין, 3 גרם פנילאלנין, 2 גרם L -סרין, אורציל 2 גרם L-תראונין, 3 גרם טריפטופן, טירוזין G 2, 1.2 גר ', 9 גרם Valine.
   2. זרוק סלקטיבית מתוך SD-L/-W/-H: SD המכיל כל חומצות אמינו חיוניות, למעט אלו שצוינו (-L:-אוצין;-W:-טריפטופן;-H:-היסטידין).
   3. YPGLU: עבור 1 ליטר, במשקל 10 גרם של תמצית שמרים, 10 גרם של Bacto Peptone ו20 גרם של גלוקוז. השלם עם 25 גרם אגר Bacto לתקשורת מוצקה.
   4. YCM: כמו YPGLU, אבל מותאם לרמת חומציות 4.5.
2. הזדווגות ומתפשט
   1. השתמש aliquots הקפוא של טרום ההתמרהזן אד Y187 שמרים (הזדווגות הסוג α) המכיל ספריית cDNA המשובטת בpACT2. בדקו כדאיות תא על ידי ציפוי דילולים סדרו על צלחות SD-L.
   2. לשכפל ORF הפתוגן לתוך pGBKT7 וקטור, ולהפוך את פלסמיד רקומביננטי באמצעות הליך סטנדרטי לזן שמרי AH109 (סוג הזדווגות).
   3. מורחים pGBKT7-שינו AH109 שמרים על צלחות SD-W. דגירה לפחות יומיים 30 ° C בחממת humidified. ניתן לאחסן צלחות על 4 מעלות צלזיוס עד להקרנת שתי ההיברידית.
   4. השתמש 3-aminotriazole (3-AT), מעכב תחרותי של אנזים HIS3, כדי לנטרל את transactivation עצמי הפוטנציאל של גן הכתב HIS3 על ידי החלבונים של פתוגנים. בצע בדיקה אוטומטי הפעלה על ידי קביעת הריכוז של 3-AT, אשר מונע צמיחה של שמרי pGBKT7-הופכים על צלחות SD-W/-H.
   5. מיליליטר זרע 30 של SD-W עם כמה מושבות של AH109 pGBKT7-טרנספורמציה. דגירה 30 שעות ב 30 ° C עם רוטציה.
   6. זרעים 200 מ"ל של SD-W עם 30 מ"למAH109 התרבויות. דגירה עם סיבוב סביב 20 שעות ב 30 ° C.
   7. דגירה מופשר Y187-ספרייה הפך cDNA ב20 מ"ל YPGLU, דגירה 10 דקות בשעה 30 ° C עם רוטציה.
   8. צנטריפוגה נפח pGBKT7-שינתה AH109 התרבות מקבילה לסכום שווה ערך של תאי שמרי Y187 קיימא עבור 5 דקות ב 3500 סל"ד ב 20 ° C. למשוך את supernatant ו resuspend גלולה ב 10 מ"ל YPGLU בזהירות.
   9. מערבבים את שמרי AH109 המושעים עם Y187 ספרייה ובה. להעביר בצינור 50 מ"ל. צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 3500 סל"ד ב 20 ° C, לסגת בזהירות supernatant (גלולה שבירה).
   10. Resuspend גלולה בYPGLU כדי לקבל סכום כולל של 1.5 מ"ל.
   11. שמרים מורחים על 3 YCM-אגר 150 צלחות מ"מ, 0.5 מ"ל / צלחת. דגירה 4.5 שעות ב 30 ° C.
   12. לאסוף שמרי הזדווגו מצלחות YCM על ידי גירוד עם כוס לגרוף 10 מ"ל של SD-L/-W/-H. יש לשטוף את הצלחות שתי פעמים עם מדיום SD-L/-W/-H 5 מ"ל ובריכת.
   13. צנטריפוגה 5 דקות ב -3,500 סל"ד, 20° C. בטל supernatant ו resuspend את השמרים בגלולה 5 בינוניות SD-L/-W/-H מ"ל.
   14. מורחים שמרי הזדווגו על 10 צלחות (0.5 מ"ל / צלחת) של אגר SD-L/-W/-H השלימו עם הריכוז המתאים של 3-aminotriazole (3-AT) נקבע בבדיקה אוטומטית ההפעלה. לדגור על 30 מעלות צלזיוס באווירת humidified עבור 6-10 ימים.
   15. לקבוע דיפלואידי (2n) השיעור על מנת להעריך את יעילות הזדווגות על ידי הפצת 250 μl של דילולים סדרתי (10 ^-4 עד 10 ^-6) של ההשעיה שמרי הזדווגו על צלחות SD-L/-W. דגירה צלחות על 30 מעלות צלזיוס במשך יומיים. לספור מושבות גדלו על SD-L/-W, ולהסיק המספר הכולל דיפלואידי ההווה בהיקף הראשוני של שמרי הזדווגו. דווח על מספר דיפלואידי זה למספר שמרים המכיל ספרייה בת קיימא כדי לחשב את שיעור דיפלואידי. זה צריך לנוע סביב 10-25%.
   16. 6-10 ימים לאחר דגירה על 30 מעלות צלזיוס, לבחור מושבות שמרי הזדווגו בSD-L/-W/-H הטרי + 3-AT צלחות. [טיפ: כדי השמרים בערכה של 8נתיבים של 12 בארות המתרבות בצלחת 96 היטב, כדי שיהיה קל יותר אחר כך עבור סידור]. בואו מושבות שמרים לגדול במשך 4-5 ימים ב30 ° C באווירת humidified.
3. הקרנה של HIS3 שיבוטים חיוביים על ידי PCR וסדר
   המטרה היא PCR להגביר ORF כלול בpACT2 וקטורים של מושבות שמרים שגדלו על צלחות SD-L/-H/-W סלקטיבית.
   1. לשים היטב PCR צלחת 96 על קרח.
   2. לlyse תאי שמרים, להוסיף 50 μl לכל טוב של פתרון 20T Zymolase (2.5 מ"ג / מ"ל ​​ב10 מ"מ המאגר pH HEPES 7.7).
   3. בעדינות resuspend מושבה אחת בכל טוב.
   4. דגירה 15 דקות בשעה 37 ° C ו 15 דקות ב 95 ° C.
   5. שים את הצלחת בחזרה על קרח. הוסף 50 μl של מים מזוקקים בכל טוב. מערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה.
   6. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 3500 סל"ד ו 4 ° C.
   7. PCR להגביר 10 μl לזהות באמצעות הוספת פריימרים חישול או צדדים של ORF נגזרים מcDNA בpACT2 וקטורים. הפרוטוקול הוא GIven להגברה של 96 מושבות שמרי lysed עם פולימראז ExTaq. מכין את התערובת הבאה: 525 חיץ μl 10X ExTaq, 420 תמהיל dNTPs μl (2.5 מ"מ), 10.5 פריימר קדימה μl (1 מיקרוגרם / μl), 10.5 פריימר ההפוך μl (1 מיקרוגרם / μl), 31.5 ExTaq μl (5 U / μl ) ו3202.5 H ₂ 0 μl. הפץ 40 μl של התערובת לכל גם בצלחת 96-PCR היטב. הוסף 10 μl של שמרי lysed בכל טוב. לבצע הגברה כדלקמן: 94 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות, ולאחר מכן 35 מחזורים ב 94 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 60 מעלות צלזיוס במשך דקות 1, 72 מעלות צלזיוס במשך 4 דקות, וסופו של דבר עם 72 מעלות צלזיוס במשך 7 דקות. הפעלת 3 μl של מוצרי ה-PCR על 1.2% ג'ל agarose כדי לזהות שיבוטים PCR-חיוביים. שים לב שהשימוש טרום יציקה 96 גם agarose ג'לי מומלץ.
      [טיפ: ניתן לאחסן צלחת ב -20 מעלות צלזיוס במשך כמה חודשים ושימוש חוזרת לPCR החדש]
   8. רצף שברי PCR מוגברים בודדו מHIS3 שיבוטים חיוביים. לבצע ניתוח תפציץ לזהות הסלולרי ORF. מערכים נמוך ביטחון (E & ערךGT; 10 ^-10, זהות <80%, אורך הפפטיד <20 חומצות אמינו) מבוטלות, כמו גם frameshifted והמוקדם קודון STOP המכיל רצפים.

2. מטריקס בניין לHT-GPCA

HT-GPCA הוא assay מבוסס תאי יונקים שבו שני חלבוני הפתוגן ומארח transiently הביעו התמזגו ברים משלימים של פיצול לוציפראז Princeps Gaussia. על האינטראקציה של בני הזוג, אנזים זה מחדש ומאפשר מידה של הפעילות האנזימטית שלה. עוצמת האינטראקציה היא להסיק מכך יחס הארה מנורמל (ראה להלן ואיור 1)

4. בחירה של שותפי תא מארח
   1. בחר חלבונים שמזוהים יותר משלוש פעמים בהקרנות Y2H עבור אימות נוספת בתאי יונקים להגדיל את מערך הביטחון ^9.
   2. הוסף שותפים באינטראקציה ידועה של חלבוני הפתוגן כpositive פקדים.
5. העבר לוקטורים תואמים HT-GPCA
   1. לשכפל כל חלבון ORF הפתוגן בוקטור pSPICA-N2 לייצר חלבוני הפתוגן עם חומצות אמינו 110-185 של Princeps Gaussia מואנשים התמזגו לוציפראז ב( fusions חלבון GL2 לפתוגן) N-סופית.
   2. PCR להגביר חלבון תאי ORF ישירות מהשיבוטים החיוביים Y2H או ממקורות אחרים ORF (ORFeome אנוש http://horfdb.dfci.harvard.edu/) ולהעביר אותם לוקטורי pSPICA-N1 כדי לייצר חלבונים התמזגו בN-הסופית עם חומצות אמינו של 18-109 האנושי Gaussia Princeps לוציפראז (fusions חלבון GL1-מארחת).
      [עצה: לשיבוט בקנה מידה גדול, מערכת שיבוט השער מומלצת. במקרה זה, להגברת PCR, השתמש פריימרים נועדו להכיל אתרים תואמים Gateway].
   3. רצף כל וקטורי הביטוי. רצפים של pSPICA-N1 ו-N2 pSPICAניתן למצוא בהתייחסות 8.

שים לב שניתן inversed בונה פלסמיד, חלבונים פתוגנים כלומר בpSPICA-N1 ומארח חלבון לתוך pSPICA-N2.

3. Assay תפוקה גבוהה Gaussia Princeps מבוסס לוציפראז חלבון שלמה (HT-GPCA)

6. Transfection הסלולרי
   1. 293T תאי זרע ב350,000 תאים / מ"ל ​​של DMEM עם סרום 10% שור עוברי (FBS) ללא אנטיביוטיקה. הפץ 100 μl / היטב בתרבות צלחות לבנות סטרילי. לא יעלה על 10 צלחות בניסוי יחידה. בואו תאים לגדול במשך 24 שעות ב 37 ° C עם 5% CO _2.
      [טיפ:. מאז פלסמידים pSPICA מכילים המוצא SV40, השימוש בתאי 293T מאפשר השכפול שלהם בתאי transfected ובכך מוביל לביטוי יתר של שני שברי לוציפראז]
   2. למחרת, תאי transfect באמצעות כל פרוטוקול transfection מתאים. שימו לב כי לריאגנטים transfection מסוימים, נוmber של תאים שנזרעו אולי צריך להיות מותאם. השתמש 100 ננוגרם לכל גם הן את הפתוגן ומארח ORF בונה פלסמיד. שיתוף transfect 10 ng לכל גם של CMV-Firefly לוציפראז פלסמיד לנרמל ליעילות transfection. כל נקודה היא נבדק בשלושה עותקים.
      [טיפ:. ניתן לבצע תערובות DNA היום לפני transfection ומאוחסנות ב -20 ° C עם חותמות דבק]
   3. העבר את תערובת transfection לצלחות של תאי 293T תרבית. להיות זהיר כדי להפקיד את התערובת בעדינות על ה-DNA בתאים, כמו 293T הם לא מאוד חסיד ולנתק בקלות מתחתית הבאר. דגירה בתא תרבות חממה עבור 24-30 שעות ב 37 ° C עם 5% CO _2.

7. תמוגה תא ומינון לוציפראז Gaussia
   1. שטוף תאים עם PBS (100 μl / טוב). הוסף 40 מאגר תמוגה Renilla 1X μl. דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת חדר תחת תסיסה.
   2. חסוך 10 μl של lysates התא בפלאט הלבן אחרדואר למינון הבא של פעילות לוציפראז Firefly. החנות ב 4 מעלות צלזיוס או לחלופין ב -20 ° C עם איטום.
   3. למדוד את פעילות Gaussia על 30μl הנותרים של lysates תא על ידי הוספת 100 μl של מגיב assay לוציפראז Renilla וספירת הארה עבור 10 שניות עם luminometer. המינון של 96 צלחת גם לוקח בערך חצי שעה. לבצע מדידה עם תמציות תאי אחסון טריות מאז הקפאה או לטווח ארוך עשוי להשפיע על פעילות Gaussia אינטראקציה בתיווך.

8. מדידה של פעילות Firefly
   1. למדוד את הפעילות בגחלילית הציל 10 μl של lysates תא על ידי הוספת 50 μl של מגיב assay לוציפראז Firefly וספירת הארה עבור 10 שניות. המינון של 96 צלחת גם לוקח בערך חצי שעה. [טיפ: המינון של Firefly לוציפראז יכול להתבצע ביום שאחרי על lysates קפוא.]

9. חישובי NLR
   1. לכל אינטראקציה, לחשב את היחס בין פעילות לוציפראז Gaussia ופעילות לוציפראז Firefly להשיג ערך הארה Gaussia מנורמל תוך לקיחה בחשבון של היעילות transfection וכדאיויות תא. לחשב את הממוצע של triplicates.
   2. כדי לפקח על האינטראקציה, מעריך יחס הארה מנורמל (NLR) עבור כל זוג הפתוגן-מארח. לשם כך, יש לחלק את פעילות הארה Gaussia המנורמלת זוהתה בנוכחותם של שני חלבוני הפתוגן ומארח בסכום של הפעילות שנמדדה בשליטת בארות (איור 1 מותאם מהתייחסות 8). ערך חתך NLR לאינטראקציות חיוביות כבר מוערך כ 3.5 ^8.

10. ניתוח נתונים
    1. בצע אשכולות היררכי באמצעות חבילת נתון R. ראשית, קבוצה את נתוני NLR לקטגוריות, ואז לחשב dendrogram אינטראקציה תוך שימוש בשיטת ההצמדה המלאה. דמיינו את זהdendrogram עם JavaTreeView ^10. לחשב את המרחק בין dendrogram אינטראקציה ועץ פילוגנטי באמצעות מקדם מתאם פירסון.
    2. כדי ליצור אינטראקציה רשתות, בחר את האינטראקציות חיוביות מבסיס נתוני HT-GPCA ולהשתמש בתוכנת Cytoscape ^1. חלץ את מעלות של החלבונים המארחים ולהתוות ההפצה שלהם כדי לגשת לדינמיקה המקומית ברשת. ניתן גבי רשתות Host-פתוגנים לinteractome המארח כדי לספק הערכה של ההשפעה הגלובלית של חלבוני הפתוגן ברשת הסלולרית המארחת.
    3. לחלץ GO (אונטולוגיה ג'ין) מונחים הקשורים לגורמים הסלולריים הממוקדים עם דוד מסד הנתונים ביואינפורמטיקה ¹² להעריך את ההעשרה התפקודית של בסיס הנתונים.

תוצאות

כוח עיקרי של HT-GPCA טמון ברגישות הגבוהה שלו, כפי שמודגם על ידי ההערכה של שיעורים שליליים שווא ושקר חיובי לחלבון HPV E2 באיור 2 (עיבוד ההתייחסות 13). כדי לקבוע את השיעור השלילי הכוזב, אינטראקציות ידועות של E2 מHPV16 הוערכו על ידי HT-GPCA (איור 2 א). ארבעה מתוך 18 אינטר?...

Discussion

באופן עצמאי, שמרים, שני מבחני אינטראקציה היברידיים ויונקים, כגון GST הנפתח, LUMIER או MAPPIT, הוכיחו להיות כלים יעילים לאיתור חלבונים אינטראקציות, אבל מוגבלים על ידי השיעור הגבוה של חיובית שגוי וכוזב שליליים אינטראקציות קשורות לטכניקות אלה ^15. יתר על כן, ראיות הולכות וג?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Yeast strains	Clontech
Minimal SD base	US biological	D9500
Amino acids	Sigma
3-amino-1,2,4-Triazole (3-AT)	Acros organics	264571000
Zymolase	Seikagaku	120491
DMEM	Gibco-Life Technologies	31966
Fetal bovine serum	BioWest	S1810
Phosphate buffer Saline (PBS)	Gibco-Life Technologies	14190
Penicillin-Streptomycin	Gibco-Life Technologies	15140
Trypsin-EDTA	Gibco-Life Technologies	25300
Renilla luciferase assay	Promega	E2820
White culture plate	Greiner Bio-One	655083
96-wellPCR plates	4titude	4t-i0730/C
Incubator (30 °C)	Memmert
Incubator (37 °C)	Heraeus
Luminometer	Berthold	Centro XS-LB 960