Un approccio comparato alla caratterizzano il paesaggio di ospite-patogeno interazioni proteina-proteina

Riepilogo

Questo articolo si concentra sulla identificazione di alta fiducioso set di dati di interazione tra ospite e patogeno proteine ​​usando una combinazione dei due metodi ortogonali: lievito di doppio ibrido seguita da un saggio di interazione high-throughput in cellule di mammifero chiamato HT-GPCA.

Abstract

Notevoli sforzi sono stati raccolti per produrre proteina-proteina mappe di rete di interazione su larga scala globale. Questo è fondamentale per comprendere le relazioni patogeno-ospite ed è stata eseguita essenzialmente da screening genetico nei lieviti sistemi a due ibridi. Il recente miglioramento della rilevazione interazione proteina-proteina da una luciferasi-based test di complementazione frammento Gaussia offre ora l'opportunità di sviluppare approcci comparativi interactomic integrativi necessari per confrontare rigorosamente profili di interazione di proteine ​​provenienti da diverse varianti di ceppo patogeno nei confronti di un insieme comune di fattori cellulari.

Questo documento si concentra in particolare sulla utilità di combinare due metodi ortogonali per generare proteina-proteina set di dati di interazione: lievito di due ibridi (Y2H) e un nuovo saggio, high-throughput Gaussia princeps saggio di complementazione proteica (HT-GPCA) eseguita in cellule di mammifero. nt "> A identificazione su larga scala di partner cellulari di una proteina patogeno viene eseguita con l'accoppiamento a base di lievito proiezioni doppio ibrido di librerie di cDNA utilizzando molteplici varianti ceppo patogeno. Un sottoinsieme di partner interagenti selezionati su un punteggio alto confidenza statistica è ulteriormente convalidato in cellule di mammifero per le interazioni pair-wise con l'intero insieme di proteine ​​varianti patogeni utilizzano HT-GPCA. Questa combinazione di due metodi complementari migliora la robustezza del set di dati di interazione, e consente l'esecuzione di una rigorosa analisi di interazione comparativa. Tali intergenomica comparativi costituire una strategia affidabile e potente per decifrare eventuali interazioni patogeno-ospite.

Introduzione

La crescente quantità di dati raccolti per generare mappe di interazione proteina-proteina apre prospettive per comprendere ulteriormente infezioni da patogeni. Poiché la comprensione globale di infezioni patogeno comincia ad emergere, fornisce accesso alla gamma delle perturbazioni indotte dalle proteine ​​patogeni quando si collega il proteoma umano ^1. E 'in tal modo offre un modo per capire come gli agenti patogeni manipolano il macchinario della cellula ospite. In particolare, la mappatura delle diverse reti di interazione virus-ospite ha rivelato che le proteine ​​virali preferenzialmente proteine ​​bersaglio host che sono fortemente connessi alla rete cellulare (hub), o che sono al centro di molti percorsi in una rete (proteine ​​colli di bottiglia) ^2-4. Queste interazioni consentono ai virus di manipolare importanti processi cellulari, che è strumentale per replicare e produrre progenie infettiva. Mappatura interazioni comparativi sono stati recentemente condotto sul virus collegati con l'obiettivo di estrarre le informazioni relative alpatogenesi ^4. Inoltre, gli studi di host-patogeni interazioni paesaggio sono stati estesi a molti agenti patogeni ^5. La cella di identificazione fattori mirata fornisce approfondimenti sulle strategie utilizzate da agenti patogeni di infettare le cellule e permette di individuare i potenziali marcatori patogeni.

Il sistema di doppio ibrido di lievito è il metodo più popolare per identificare interazioni binarie poiché lo screening genetico è uno strumento efficace e sensibile per la mappatura ad alta velocità di interazioni proteina-proteina. L'approccio qui proposto migliora ulteriormente le singole proiezioni Y2H valutando una proteina di molteplici agenti patogeni varianti di deformazione, fornendo così accesso ad una panoramica comparativa delle interazioni proteina-proteina patogeno-ospite. Inoltre, una limitazione importante di lievito di screening del doppio ibrido giace in un alto tasso di falsi negativi, poiché recupera circa il 20% delle interazioni totale ^6. Ciò implica che le interazioni rilevate con solo un sottoinsieme di patogens varianti potrebbero essere sfuggiti al rilevamento con gli altri. Pertanto, i singoli partner emergenti di tutte le proiezioni di due ibridi sono ulteriormente sfidati per l'interazione con l'intera gamma di ceppi studiati, fornendo serie di dati comparativi di interazione. Poiché è stato dimostrato che la combinazione di differenti metodologie fortemente aumenta la robustezza di interazione proteina-proteina set di dati ^7, questa convalida viene eseguita in cellule di mammifero mediante un saggio di complementazione proteina-frammento di recente sviluppato chiamato HT-GPCA ^8. Questo sistema a base di cellule permette il rilevamento di interazioni proteina dalla complementazione del Gaussia princeps diviso luciferasi ed è stato progettato per essere compatibile con un formato ad alta produttività. Grazie alla sua tecnologia di luminescenza-based e il suo basso rumore di fondo rispetto ad altre analisi basato sulla fluorescenza, HT-GPCA mostra una sorprendentemente elevata sensibilità.

In generale, questo approccio costituisce un efficientestrumento per generare una mappatura completa delle interazioni ospite-patogeno, che rappresenta il primo passo verso una comprensione globale della cellula ospite dirottamento.

Protocollo

1. Lievito Screenings doppio ibrido

1. Effettuare le seguenti soluzioni richieste:
   1. Completa Out Goccia sintetico (SD): sciogliere 26,7 g di minima base di deviazione standard con il glucosio in 1 L di acqua. Aggiungere 2 g di miscela di aminoacidi preparato come segue: 2 g hemisulfate adenina, 2 g Arginina HCl, 2 g di HCl Istidina, Isoleucina 2 g, 4 g Leucina, Lisina HCl 2 g, 2 g Metionina, Fenilalanina 3 g, 2 g L -Serina, 2 g L-treonina, 3 g Triptofano, Tirosina 2 g, 1.2 g Uracile, 9 g Valina.
   2. Selective Cada Fuori SD-L/-W/-H: SD contenente ogni aminoacidi essenziali ad eccezione di quelli specificati (-L:-leucina;-W:-triptofano;-H:-istidina).
   3. YPGLU: Per 1 L, peso 10 g di estratto di lievito, 10 g di Bacto peptone e 20 g di glucosio. Completo di 25 g Bacto agar per terreni solidi.
   4. YCM: come YPGLU, ma pH regolato a 4,5.
2. Accoppiamento e la diffusione
   1. Usare aliquote congelate di pre-trasformazionendr Y187 ceppo di lievito (tipo di accoppiamento α) che contiene una libreria di cDNA clonato in pACT2. Verificare la vitalità cellulare del placcatura diluizioni seriali su piastre SD-L.
   2. Clonare il patogeno ORF in pGBKT7 vettore, e trasformare il plasmide ricombinante utilizzando una procedura standard in AH109 ceppo di lievito (tipo di accoppiamento a).
   3. Diffusione pGBKT7-trasformata AH109 lievito su piastre SD-W. Incubare almeno due giorni 30 ° C in un incubatore umidificato. Piastre possono essere conservati a 4 ° C finché lo screening del doppio ibrido.
   4. Usare 3-amminotriazolo (3-AT), un inibitore competitivo dell'enzima HIS3, per contrastare il potenziale di auto-transattivazione del gene reporter HIS3 dalle proteine ​​dei patogeni. Eseguire un test di auto-attivazione determinando la concentrazione di 3-AT, che impedisce la crescita del lievito pGBKT7-trasformate su piastre SD-W/-H.
   5. Seed 30 ml di SD-W con poche colonie di pGBKT7-trasformato AH109. Incubare 30 ore a 30 ° C con rotazione.
   6. Seed 200 ml di SD-W con il 30 mldelle AH109 culture. Incubare con rotazione attorno 20 hr a 30 ° C.
   7. Incubare scongelati cDNA library-Y187 trasformato in 20 ml YPGLU, incubare 10 minuti a 30 ° C con rotazione.
   8. Centrifugare un volume di pGBKT7-trasformato AH109 cultura corrispondente ad una quantità equivalente di cellule di lievito Y187 vitali per 5 min a 3500 rpm a 20 ° C. Rimuovere con attenzione il surnatante e risospendere pellet in 10 ml YPGLU.
   9. Mescolate il lievito con risospeso AH109 Y187 biblioteca contiene. Trasferire in un tubo da 50 ml. Centrifugare per 5 min a 3500 rpm a 20 ° C, accuratamente ritirare surnatante (fragile pellet).
   10. Risospendere il pellet in YPGLU per ottenere un totale di 1,5 ml.
   11. Diffusione lievito a 3 YCM-Agar 150 piastre mm, 0,5 ml / piastra. Incubare 4,5 ore a 30 ° C.
   12. Raccogliere lievito accoppiò da piastre YCM raschiando con un bicchiere rastrello in 10 ml di SD-L/-W/-H. Lavare i piatti due volte con 5 ml SD-L/-W/-H medio e piscina.
   13. Centrifugare 5 min a 3.500 giri, 20° C. Gettare il surnatante e risospendere il lievito pellet in 5 ml SD-L/-W/-H medie.
   14. Stendere lievito accoppiato a 10 piastre (0,5 ml / piastra) di Agar SD-L/-W/-H integrate con la concentrazione appropriata di 3-amminotriazolo (3-AT) determinato nella prova di auto-attivazione. Incubare a 30 ° C in atmosfera umidificata per 6-10 giorni.
   15. Determinare l'(2n) tasso diploide per valutare l'efficienza di accoppiamento, diffondendo 250 microlitri di diluizioni seriali (10 ^-4 a 10 ^-6) della sospensione di lievito accoppiato su piastre SD-L/-W. Incubare le piastre a 30 ° C per due giorni. Contare le colonie cresciute su SD-L/-W, e dedurre il numero totale diploide presente nel volume iniziale di lievito accoppiati. Segnala questo numero diploide di vitale numero lievito biblioteca contenente per calcolare il tasso diploide. Dovrebbe variare del 10-25% circa.
   16. 6-10 giorni dopo incubazione a 30 ° C, raccogliere colonie di lievito accoppiate in SD-L/-W/-H fresco + 3-AT piatti. [Suggerimento: per il lievito in un sistema di 8corsie di 12 pozzetti riproducenti una piastra da 96 pozzetti in modo che sia più facile per il sequenziamento seguito]. Lasciate colonie di lievito crescere per 4-5 giorni a 30 ° C in atmosfera umidificata.
3. Proiezione del HIS3 cloni positivi mediante PCR e sequenziamento
   L'obiettivo è di PCR amplificare la ORF contenuta nei pACT2 vettori di lievito colonie cresciute su piastre selettive SD-L/-H/-W.
   1. Mettete un piatto ben 96 PCR in ghiaccio.
   2. Per lisare cellule di lievito, aggiungere 50 microlitri per pozzetto di una soluzione 20T Zymolase (2,5 mg / ml in 10 mM tampone HEPES pH 7.7).
   3. Risospendere delicatamente una colonia per pozzetto.
   4. Incubare 15 minuti a 37 ° C e 15 min a 95 ° C.
   5. Mettere la piastra posteriore sul ghiaccio. Aggiungere 50 ml di acqua distillata per pozzetto. Mescolare bene pipettando su e giù.
   6. Centrifugare per 5 min a 3500 rpm e 4 ° C.
   7. PCR amplificano 10 microlitri di rilevare un inserto utilizzando primer ricottura entrambi i lati della ORF derivati ​​da cDNA in vettori pACT2. Il protocollo è gato per l'amplificazione di 96 lisati colonie di lievito con la polimerasi ExTaq. Preparare la seguente miscela: 525 microlitri di buffer 10X ExTaq, 420 microlitri dNTP mix (2,5 mm), 10,5 ml Primer Forward (1 mg / mL), 10,5 ml Primer Indietro (1 mg / mL), 31,5 ml ExTaq (5 U / mL ) e 3202,5 ​​ml H ₂ 0. Distribuire 40 microlitri della miscela per pozzetto in una piastra PCR 96. Aggiungere 10 ml di lisato di lievito per pozzetto. Eseguire amplificazione come segue: 94 ° C per 3 min, quindi 35 cicli a 94 ° C per 30 sec, 60 ° C per 1 min, 72 ° C per 4 min, e terminano con 72 ° C per 7 minuti. Eseguire 3 pl di prodotti di PCR su un gel di agarosio 1,2% per rilevare cloni PCR-positivi. Si noti che l'utilizzo di pre-fusione 96 e si raccomanda gel di agarosio.
      [Suggerimento: piastra può essere conservato a -20 ° C per pochi mesi e riutilizzato per la nuova PCR]
   8. Sequenza dei frammenti di PCR amplificati isolati da HIS3 cloni positivi. Eseguire un'analisi BLAST per identificare cellulare ORF. Allineamenti bassa confidenza (E Valore > 10 ^-10, identità <80%, lunghezza peptide <20 aminoacidi) vengono scartati e frameshifted e premature codone di STOP contenente sequenze.

2. Matrix edificio per HT-GPCA

HT-GPCA è un saggio basato su cellule di mammifero in cui entrambe le proteine ​​patogeno e l'ospite sono transitoriamente espressi fusi a frammenti complementari della divisione Gaussia princeps luciferasi. Seguito all'interazione dei partner, questo enzima viene ricostituito permettendo la misura della sua attività enzimatica. L'intensità dell'interazione è quindi dedotta da un Rapporto di luminescenza Normalizzato (vedi sotto e Figura 1)

4. La scelta dei partner della cellula ospite
   1. Selezionare le proteine ​​che vengono identificati più di tre volte nelle proiezioni Y2H di ulteriore validazione in cellule di mammifero per aumentare la fiducia dei set di dati ^9.
   2. Aggiungi note partner interagenti delle proteine ​​patogeno come positive controlli.
5. Trasferire in vettori compatibili HT-GPCA
   1. Clonare ogni agente patogeno proteina ORF in un vettore pSPICA-N2 per generare proteine ​​patogene con aminoacidi 110-185 delle umanizzati princeps Gaussia luciferasi fusi a loro N-terminale della proteina (fusioni GL2-patogeno).
   2. PCR amplifica proteina cellulare ORF direttamente dai cloni positivi Y2H o da altre risorse ORF (umano ORFeome http://horfdb.dfci.harvard.edu/ ) e trasferirli in vettori pSPICA-N1 per generare proteine ​​fuse all'estremità N-terminale con gli amminoacidi 18-109 di umanizzato Gaussia princeps luciferasi (fusioni proteiche GL1-host).
      [Suggerimento: per la clonazione di grandi dimensioni, si consiglia il sistema di clonazione Gateway. In tal caso, per l'amplificazione PCR, utilizzare primer disegnati per contenere siti compatibili Gateway].
   3. Sequenza tutti vettori di espressione. Sequenze del pSPICA-N1-N2 e pSPICApuò essere trovato in riferimento 8.

Si noti che i costrutti plasmidici possono essere invertiti, cioè proteine ​​agenti patogeni in pSPICA-N1 e proteina ospite in pSPICA-N2.

3. High-Throughput Gaussia princeps luciferasi-Based Protein Assay complementazione (HT-GPCA)

6. Trasfezione delle cellule
   1. Seed 293T cellule a 350.000 cellule / ml di DMEM con 10% di siero fetale bovino (FBS) senza antibiotico. Distribuire 100 l / pozzetto in piastre di coltura sterili bianco. Non superare i 10 piatti in un singolo esperimento. Lasciate che le cellule crescono per 24 ore a 37 ° C con 5% di CO _2.
      [Tip:. Poiché i plasmidi pSPICA contengono una origine SV40, l'uso di cellule 293T permette loro replicazione in cellule trasfettate e quindi porta alla sovraespressione dei due frammenti luciferasi]
   2. Il giorno seguente, le cellule trasfezione utilizzando qualsiasi protocollo di trasfezione adatto. Si noti che per alcuni reagenti di trasfezione, il number di cellule testa di serie può essere adattato. Utilizzare 100 ng per bene sia del patogeno e l'ospite ORF costrutti plasmidici. Co-trasfezione 10 ng per pozzetto di una di CMV-lucciola luciferasi plasmide per normalizzare per efficienza di trasfezione. Ciascun punto è testato in triplicato.
      [Tip:. Miscele di DNA possono essere eseguite il giorno prima della transfezione e conservati a -20 ° C con guarnizioni adesive]
   3. Trasferire miscela di trasfezione alle piastre di coltura cellule 293T. Fare attenzione a depositare dolcemente la miscela DNA sulle cellule, come 293T non sono fortemente aderente e facilmente staccare dal fondo del pozzo. Incubare in un incubatore per colture cellulare per 24-30 ore a 37 ° C con 5% di CO _2.

7. La lisi cellulare e Gaussia dosaggio luciferasi
   1. Lavare le cellule con PBS (100 pl / pozzetto). Aggiungere 40 microlitri di buffer di lisi Renilla 1X. Incubare per 30 min a temperatura ambiente sotto agitazione.
   2. Risparmia il 10 microlitri di lisato cellulare in un altro plat biancoe per successivo dosaggio dell'attività di luciferasi lucciola. Conservare a 4 ° C o in alternativa a -20 ° C con tenuta.
   3. Misurare l'attività Gaussia sui rimanenti 30μl di lisati cellulari mediante l'aggiunta di 100 pl di reagente di saggio luciferasi Renilla e conteggio luminescenza per 10 sec con un luminometro. Dosaggio di una piastra a 96 prende circa mezz'ora. Eseguire la misurazione con estratti di cellule fresche dal congelamento o conservazione a lungo termine può influenzare l'attività Gaussia interazione mediata.

8. Misurazione dell'attività Firefly
   1. Misurare l'attività lucciola sulla salvato 10 microlitri di lisato cellulare aggiungendo 50 ml di reagente di saggio luciferasi lucciola e conteggio luminescenza per 10 sec. Dosaggio di una piastra a 96 prende circa mezz'ora. [Suggerimento: Il dosaggio di lucciola luciferasi può essere eseguita il giorno dopo su lisati congelati.]

9. Calcoli NLR
   1. Per ogni interazione, calcolare il rapporto tra l'attività di luciferasi lucciola Gaussia e attività di luciferasi per ottenere un valore normalizzato luminescenza Gaussia tenendo conto dell'efficienza di transfezione e vitalità cellulare. Calcolare la media dei triplicato.
   2. Per monitorare l'interazione, stimare un rapporto di luminescenza Normalizzato (NLR) per ogni coppia patogeno-ospite. Per fare ciò, dividere il normalizzato attività luminescenza Gaussia rilevata in presenza sia patogeno e proteine ​​ospite dalla somma delle attività misurate in pozzetti di controllo (Figura 1 adattato da riferimento 8). Il valore di cut-off NLR per le interazioni positive è stato stimato in circa 3,5 ^8.

10. Analisi dei dati
    1. Eseguire il clustering gerarchico utilizzando il pacchetto statistico R. Prima, raggruppare i dati NLR in categorie, quindi calcolare un dendrogramma un'interazione con il metodo linkage completo. Visualizza questodendrogramma con JavaTreeView ^10. Calcolare la distanza tra interazione dendrogramma e albero filogenetico con un coefficiente di correlazione di Pearson.
    2. Per generare reti di interazione, selezionare le interazioni positive dal dataset HT-GPCA e utilizzare il software Cytoscape ^1. Estrarre i gradi delle proteine ​​ospite e tracciare la loro distribuzione per accedere alle dinamiche locali di rete. Reti host-agenti patogeni possono essere sovrapposti alla interattoma ospite di fornire una valutazione dell'impatto globale delle proteine ​​patogene nella rete cellulare host.
    3. Estrarre il GO (Gene Ontology) termini associati con i fattori cellulari mirati con il DAVID database di bioinformatica ¹² per valutare l'arricchimento funzionale del dataset.

Risultati

Un punto di forza di HT-GPCA risiede nella sua elevata sensibilità, come illustrato dalla valutazione di tassi positivi e falsi negativi falsi per la proteina E2 di HPV nella Figura 2 (adattato dal riferimento 13). Per determinare il tasso di falsi negativi, note interazioni di E2 da HPV16 sono state valutate da HT-GPCA (Figura 2A). Quattro su 18 interazioni non sono stati recuperati (corrispondente ad un tasso di falso negativo 22%). Le interazioni falsi positivi sono stati misurati a...

Discussione

Indipendentemente, lievito-due saggi di interazione ibridi e mammiferi, come il GST pull-down, LUMIER o MAPPIT, hanno dimostrato di essere strumenti efficaci per individuare le interazioni proteina-proteina, ma sono limitati dal tasso elevato di falsi positivi e falsi negativi interazioni associate con queste tecniche ^15. Inoltre, vi è sempre maggiore che combinando metodi ortogonali aumenta l'affidabilità dell'interazione dataset ottenuto ^7. Il recente sviluppo della tecnica HT-GPCA desc...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Yeast strains	Clontech
Minimal SD base	US biological	D9500
Amino acids	Sigma
3-amino-1,2,4-Triazole (3-AT)	Acros organics	264571000
Zymolase	Seikagaku	120491
DMEM	Gibco-Life Technologies	31966
Fetal bovine serum	BioWest	S1810
Phosphate buffer Saline (PBS)	Gibco-Life Technologies	14190
Penicillin-Streptomycin	Gibco-Life Technologies	15140
Trypsin-EDTA	Gibco-Life Technologies	25300
Renilla luciferase assay	Promega	E2820
White culture plate	Greiner Bio-One	655083
96-wellPCR plates	4titude	4t-i0730/C
Incubator (30 °C)	Memmert
Incubator (37 °C)	Heraeus
Luminometer	Berthold	Centro XS-LB 960