호스트 병원체 단백질 - 단백질 상호 작용의 풍경의 특성을 비교 접근

요약

이 문서에서는 호스트와 두 개의 직교 방법의 조합을 사용 병원균의 단백질 사이의 높은 자신감 상호 작용 집합의 식별에 초점을 맞추고 효모 두 하이브리드 HT-GPCA이라는 포유 동물 세포에서 높은 처리량의 상호 작용 분석에 의해 따랐다.

초록

상당한 노력은 대규모의 종합 단백질 - 단백질 상호 작용 네트워크의지도를 생성하기 위해 모였다. 이 병원체 호스트 관계를 이해하는 수단이며, 본질적으로 효모 두 하이브리드 시스템을 유전 검사에 의해 수행되었다. Gaussia 루시 페라 기반의 파편 보완 분석에 의한 단백질 - 단백질 상호 작용 검출의 최근 개선은 이제 엄격 세포 요소의 공통 집합에 대해 서로 다른 병원체 변형 변종 단백질의 상호 작용 프로파일을 비교하기 위해 필요한 통합 비교 interactomic 방법을 개발하는 기회를 제공합니다.

이 논문은 특히 단백질 - 단백질 상호 작용 데이터 세트를 생성하는 두 개의 직교 방법을 결합하는 유틸리티에 초점을 맞추고 효모 두 하이브리드 (Y2H)과 새로운 분석, 포유 동물 세포에서 수행 높은 처리량 Gaussia 프린 단백질 보완 분석 (HT-GPCA). NT는 "병원체 단백질의 세포 파트너>의 대규모 식별은 여러 병원체 변형 변형을 사용하여 cDNA를 라이브러리의 두 하이브리드 상영 짝짓기 기반 효모에 의해 수행됩니다. 높은 신뢰도 통계 득점에서 선택한 상호 작용하는 파트너의 하위 집합이 더 있습니다 HT-GPCA을 사용 병원균의 변종 단백질의 전체 세트와 짝 상호 작용 포유 동물 세포에 확인. 두 개의 보완적인 방법이 조합은 상호 작용 데이터 집합의 견고성을 향상하고, 엄격한 비교의 상호 작용 분석의 성능을 할 수 있습니다. 이러한 비교 interactomics은 해독하는 병원체 호스트 interplays에 신뢰할 수있는 강력한 전략을 구성합니다.

서문

단백질 - 단백질 상호 작용지도를 생성하기 위해 수집 된 데이터의 양이 증가 더욱 병원체 감염을 이해하는 관점을 엽니 다. 병원균 감염의 글로벌 이해가 등장하기 시작, 그것은 인간 프로테옴 ¹ 연결할 때 병원균의 단백질에 의해 유도 교란의 범위에 대한 액세스를 제공합니다. 그것은 따라서 병원균이 숙주 세포의 기계를 조작하는 방법을 이해하는 방법을 제공합니다. 특히, 여러 가지 바이러스 호스트 상호 작용 네트워크의 매핑은 바이러스 성 단백질이 우선적으로 고 (허브) 셀룰러 네트워크에 연결되어 있거나 네트워크 (병목 단백질) ^2-4 여러 경로의 중심되는 호스트 단백질을 표적으로 나타났습니다. 이러한 상호 작용은 전염성 자손을 복제하고 생산 수단이되는 바이러스는 중요한 세포 프로세스를 조작 할 수 있습니다. 비교 상호 작용을 매핑은 최근을 기준으로 정보를 추출하는 것을 목표로 관련 바이러스에 실시되었다발병 ^4. 또한, 호스트 병원체 상호 작용 풍경의 연구는 많은 병원체 ⁵ 확장되었습니다. 대상 셀 요인 식별 세포를 감염하는 병원체에 의해 사용되는 전략에 대한 통찰력을 제공하고 잠재적 인 병원성 마커를 감지 할 수 있습니다.

효모 두 하이브리드 시스템은 유전자 검사는 단백질 - 단백질 상호 작용의 높은 처리량 매핑을위한 효율적이고 중요한 도구이기 때문에 바이너리 상호 작용을 확인하는 가장 인기있는 방법입니다. 접근 방식은 더함으로써 병원체 호스트 단백질 - 단백질 상호 작용의 비교 개요에 대한 액세스를 제공, 여러 병원균 변형 변형 단백질을 평가하여 개별 Y2H 검진을 향상 여기에 제안했다. 그것은 전체의 상호 작용 ^6의 약 20 %를 복구 있기 때문에 또한, 효모 두 하이브리드 심사의 주요 제한은, 높은 위음성 율에 자리 잡고 있습니다. 이 병리의 부분 집합만을 감지하는 상호 작용을 의미씨족의 변형은 다른 사람과 감지를 탈출 할 수도 있습니다. 따라서 모든 두 하이브리드 검진에서 나오는 각각의 파트너는 더욱 비교 상호 작용 데이터 세트를 제공하는 연구 균주의 전체 범위의 상호 작용을 위해 도전하고 있습니다. 그것은 다른 방법을 결합하여 강력하게 단백질 - 단백질 상호 작용 데이터 세트 ^7의 견고성을 증가한다는 것을 증명 되었기 때문에,이 검증은 HT-GPCA ^8이라는 새로 개발 된 단백질 조각 보완 분석하여 포유 동물 세포에서 수행됩니다. 이 셀 기반 시스템은 Gaussia 프린의 보완에 의한 단백질 상호 작용의 검출 루시 페라 제를 분할하고 높은 처리량 형식과 호환되도록 설계되었습니다 수 있습니다. 의 발광 기반 기술에 대한 감사의 낮은 배경 소음이 다른 형광 기반의 분석과 비교, HT-GPCA이 현저하게 높은 감도를 보여줍니다.

전반적으로,이 방법은 효율적 구성납치 숙주 세포의 세계 이해를 향한 첫 단계를 나타냅니다 호스트 병원체의 interplays의 포괄적 인 매핑을 생성하는 도구입니다.

프로토콜

1. 효모 두 하이브리드 스크리닝

1. 다음의 필수 솔루션을 만들기 :
   1. 완전한 합성 드롭 아웃 (SD)는 : 물 1 L의 포도당 최소 SD베이스의 26.7 g을 용해. 다음과 같이 준비 아미노산 혼합물 2g을 추가 2g 아데닌 hemisulfate, 2g 아르기닌 HCL에, 2g 히스티딘 염산, 2g 이소류신, 4g 류신, 2g 리진 염산, 2g 메티오닌, 3g 페닐알라닌, 2g L -세린, 2g L-트레오닌, 트립토판 3g, 2g 티로신 1.2 g 우라실, 9g 발린.
   2. SD-L/-W/-H 아웃 선택 드롭 : SD가 그 지정된 제외한 모든 필수 아미노산을 포함하는 (-L :-류신,-W :-트립토판,-H :-히스티딘).
   3. YPGLU : 1 L, 무게 효모 추출물, Bacto 펩톤 10 g와 포도당 20g의 10g하십시오. 고체 미디어 25g Bacto 한천로 작성합니다.
   4. YCM : YPGLU과 동일하지만, pH를 4.5로 조정.
2. 짝짓기 및 확산
   1. 사전 변환 냉동 분주을 사용하여pACT2에서 복제 된 cDNA의 라이브러리를 포함 ED Y187 효모 균주 (연결 타입 α). SD-L 플레이트에 시리얼 희석 도금하여 세포 생존을 확인합니다.
   2. pGBKT7 벡터에 병원체 ORF를 복제하고, AH109 효모 균주 (연결 유형)에 표준 절차를 사용하여 재조합 플라스미드를 변환 할 수 있습니다.
   3. 확산 SD-W 플레이트에 AH109 효모 pGBKT7는 변환 된. 가습 배양기에서 적어도 두 일 30 ° C를 품어. 접시는 4 ° C에서 두 하이브리드 심사까지 저장할 수 있습니다.
   4. 병원균 '단백질에 의해 HIS3 리포터 유전자의 자기 transactivati​​on 잠재력을 방해하는 3 aminotriazole (3-AT), HIS3 효소의 경쟁적 억제제를 사용합니다. SD-W/-H 접시에 pGBKT7 변환 된 효모의 성장을 방지 3-AT의 농도를 측정하여 자동으로 정품 인증 테스트를 수행합니다.
   5. pGBKT7 변환 된 AH109 몇 식민지와 SD-W의 씨앗 30 ML. 회전 30 ° C에서 30 시간을 품어.
   6. 30 mL로 SD-W의 씨앗 200 MLAH109 문화. 30에서 20 시간 정도 회전 품어 ° C.
   7. 20 ML YPGLU, 30 품어 10 분 ° 회전 C에서 cDNA를 라이브러리 변환 Y187를 해동 품어.
   8. 20 ℃에서 3,500 rpm으로 5 분 동안 가능한 Y187 효모 세포의 상당 금액에 해당하는 pGBKT7 - 변환 AH109 문화의 볼륨을 원심 분리기 조심스럽게 10 ML YPGLU에서 뜨는을 Resuspend 펠렛을 철회.
   9. Y187 포함하는 라이브러리를 재 부유 AH109 효모를 혼합합니다. 50 ML 튜브에 전송합니다. 20 3,500 rpm으로 5 분 ° C, 원심 분리주의 깊게 상층 철회 (깨지기 쉬운 펠렛).
   10. YPGLU의 펠렛을 Resuspend 1.5 ML의 총을 얻을 수 있습니다.
   11. 확산 효모 YCM-한천 3에 150mm 격판 덮개, 0.5 ML / 판. 30에 4.5 시간을 품어 ° C.
   12. SD-L/-W/-H 10 ㎖에있는 레이크 유리로 긁어 YCM 판에서 성관계 효모를 수집합니다. 5 ML SD-L/-W/-H 매체와 풀과 접시를 두 번 헹구십시오.
   13. 20, 3,500 rpm에서 5 분간 원심 분리° C. 뜨는을 취소하고 5 ML SD-L/-W/-H 배지에서 효모 펠렛을 resuspend을.
   14. 자동 정품 인증 시험에서 측정 3 aminotriazole의 적절한 농도 (3-AT)와 보충 SD-L/-W/-H 한천의 10 판 (0.5 ML / 플레이트)에 어울리게 효모를 확산. 6-10일을위한 배양기에서 30 ° C에서 알을 품다.
   15. SD-L/-W 접시에 어울리게 효모 현탁액의 연속 희석 250 μL (10 ^-6 ~ 10 ^-4) 확산에 의해 결합 효율을 평가하기 위하여 배체 (2N) 속도를 결정합니다. 이틀 동안 30 ° C에서 번호판을 품어. SD-L/-W에 성장 식민지를 계산하고 성관계 효모의 초기 볼륨에 존재하는 총 배체 번호를 추론. 배체 속도를 계산하기 위해 실행 가능한 라이브러리를 포함하는 효모 숫자로 배체 번호를보고합니다. 그것은 10-25 % 정도 범위한다.
   16. 6-10일 30 부화 후 ° C, 신선한 SD-L/-W/-H의 성관계 효모 식민지 + 플레이트 3-AT를 선택합니다. [팁 : 주문 효모 8 구성표가]를 시퀀싱 이후 쉬울 것이다 그래야 96 웰 플레이트를 재현 12 우물의 차선. 효모 식민지 배양기에서 30 4-5일 ° C에 대한 성장하자.
3. PCR 및 시퀀싱에 의해 HIS3 긍정적 인 클론의 선별
   목표는 PCR은 ORF가 선택 SD-L/-H/-W 접시에 성장 효모 식민지의 pACT2 벡터에 포함 된 증폭하는 것입니다.
   1. 얼음에 96 잘 PCR 플레이트를 넣습니다.
   2. 효모 세포를 용해하기 위해, 50 μL 당 잘 Zymolase 20T 솔루션 (10 MM의 HEPES 버퍼 pH가 7.7에서 2.5 밀리그램 / ML)를 추가합니다.
   3. 부드럽게 잘 당 하나의 식민지를 resuspend을.
   4. 37 95 ° C 및 15 분 ° C.에 15 분 알을 품다
   5. 얼음에 다시 접시를 넣어. 잘 당 증류수 50 μl를 추가합니다. 아래로 피펫에 의해 잘 섞는다.
   6. 3,500 rpm을 4에서 5 분 동안 원심 분리기 ° C.
   7. PCR은 pACT2 벡터에서의 cDNA에서 파생 된 ORF의 어느 측면을 어닐링 프라이머를 사용하여 삽입을 감지하는 10 μl를 증폭. 프로토콜은 g입니다ExTaq 중합 효소와 함께 96 용해 효모 식민지의 증폭 iven. 다음 혼합 준비 525 μL 10X ExTaq 버퍼 420 μL dNTPs 믹스 (2.5 ㎜), 10.5 μL 앞으로 프라이머 (1 ㎍ / ㎕의), 10.5 μL 역방향 프라이머 (1 ㎍ / ㎕의), 31.5 μL ExTaq를 (5 U / μL ) 및 3202.5 μL H ₂ 0. 96 잘 PCR 플레이트에 잘 당 믹스의 40 μl를 배포 할 수 있습니다. 당 잘 용해 효모의 10 μl를 추가합니다. 7 분 1 4 분 분, 72 ° C, 72로 끝나는 ° C를위한 30 초, 60 ° C에 대해 94에서 다음 3 분, 35주기 ° C에 대해 94 ° C : 다음과 같이 증폭을 수행합니다. PCR 양성 클론을 감지하는 1.2 % 아가로 오스 겔에 PCR 제품의 3 μl를 실행합니다. 사용하여 프리 캐스트 96도 아가 로스 젤을 권장합니다.
      [팁 : 플레이트가 몇 달 동안 -20 ° C에 저장하고 새로운 PCR을 위해 다시 사용할 수 있습니다]
   8. HIS3 긍정적 인 클론에서 분리 PCR 증폭 단편 시퀀스입니다. 휴대 ORF를 식별하기 위해 BLAST 분석을 수행합니다. 낮은 신뢰 정렬 (E 값 >, 10 ^-10, ID가 <80 %, 펩타이드 길이 <20 아미노산)뿐만 아니라 frameshifted 무시하고 서열을 포함하는 조기 정지 코돈.

2. HT-GPCA을위한 매트릭스 건물

HT-GPCA 모두 병원체와 호스트 단백질이 일시적으로 분할 Gaussia 프린 루시 페라 제의 보완 조각에 융합 표현되는 포유 동물 세포 기반 분석이다. 파트너의 상호 작용에 따라,이 효소는 효소 활성의 측정을 허용 재구성합니다. 상호 작용 강도는 따라서 표준화 된 발광 비율 (아래 참조 및 그림 1)에서 추론된다

4. 숙주 세포 파트너의 선택
   1. 데이터 집합의 신뢰 ^구를 높이기 위해 포유 동물 세포에서 추가 검증을 위해 Y2H 검사에서 3 회 이상 확인하는 단백질을 선택합니다.
   2. positi의 같은 병원체 단백질의 알려진 상호 작용 파트너를 추가컨트롤 VE.
5. HT-GPCA 호환 벡터로 전송
   1. 아미노산 루시 페라 제 자신의 N-말단 (GL2 병원체 단백질 융합)에 융합 인간 답게 Gaussia의 프린의 110-185과 병원체 단백질을 생성하는 pSPICA-N2 벡터의 각 병원체 단백질 ORF를 복제합니다.
   2. PCR은 ORF 직접 Y2H 긍정적 인 클론이나 다른 ORF 자원 (인적 ORFeome의에서 세포 단백질을 증폭 http://horfdb.dfci.harvard.edu/ 와 N-말단에 융합 단백질을 생성하는)와 pSPICA-N1 벡터로 전송할 아미노산 인간 답게 Gaussia 프린 루시 페라 제 (GL1 호스트 단백질 융합)의 18-109.
      [팁 : 대규모 복제의 경우, 게이트웨이 복제 시스템이 권장됩니다. 이 경우, PCR 증폭을위한 게이트웨이와 호환 사이트를 포함하도록 디자인 된 프라이머를 사용]을 클릭합니다.
   3. 시퀀스 모두 발현 벡터합니다. pSPICA-N1과 pSPICA-N2의 순서참고 8에서 찾을 수 있습니다.

플라스미드 구조가 pSPICA-N1에서, 즉 병원체 단백질을 반전 및 호스트 단백질 pSPICA-N2로 할 수 있습니다.

3. 높은 처리량 Gaussia 프린 루시 페라 기반 단백질 보완 분석 실험 (HT-GPCA)

6. 세포 형질
   1. 항생제없이 10 % 태아 소 혈청 (FBS)와 DMEM의 35 세포 / ㎖에서 종자 293T 세포. / 잘 멸균 화이트 배양 접시에 100 μl를 배포 할 수 있습니다. 한 실험에서 10 판을 초과하지 마십시오. 세포는 5 % CO _2와 37 ° C에서 24 시간 동안 성장하자.
      [팁 :. pSPICA 플라스미드는 SV40 기원을 포함되기 때문에, 293T 세포의 사용은 형질 전환 세포에서의 복제를 허용하고 따라서 두 루시 페라 조각의 발현에 이르게]
   2. 다음 날, 임의의 적절한 형질 프로토콜을 사용하여 형질 세포. 뉴 특정 형질 시약을 위해 그것을 참고세포 시드의 mber가 적응해야 할 수도 있습니다. 100 NG 당 잘 병원체와 호스트 ORF 플라스미드 구조를 모두 사용합니다. 형질 전환 효율 정상화 플라스미드 CMV-반딧불 루시 페라 제의 잘 당 공동 형질 10 NG. 각 점은 세중의에서 테스트합니다.
      [팁 :. DNA 혼합물은 접착 씰 형질 전날 수행하고 -20 ° C에 저장할 수 있습니다]
   3. 배양 293T 세포의 접시에 형질 믹스를 전송합니다. 293T 강력하게 접착되지 않고 쉽게 잘 바닥에서 분리로 부드럽게 세포에 DNA 믹스를 입금주의하십시오. 5 % CO _2와 37 ° C에서 24-30 시간 동안 배양 세포 배양기에서 배양한다.

7. 세포 용해 및 Gaussia 루시 페라 제의 투여
   1. PBS (물론 100 μL /)로 세포를 씻어. 40 μL 1X Renilla의 용해 버퍼를 추가합니다. 교반 실온에서 30 분 동안 품어.
   2. 다른 흰색 플랫폼에서 세포 용 해물의 10 μl를 저장반딧불 루시 페라 제 활동의 다음 복용량을위한 전자. 4에서 보관 ° C 또는 양자 택일 -20 ° 씰링 C.
   3. Renilla의 루시 페라 제 분석 시약 100 μL를 추가하고 luminometer로 10 초 동안 발광을 계산하여 세포 용 해물의 나머지 30μl에 Gaussia 활동을 측정합니다. 96 잘 플레이트의 용량은 절반 정도 시간이 소요됩니다. 냉동 또는 장기 보관 상호 작용 매개 Gaussia 활동에 영향을 미칠 수 있기 때문에 신선한 세포 추출물 측정을 수행합니다.

8. 반딧불 활동의 측정
   1. 반딧불 루시 페라 제 분석 시약 50 μL를 추가하고 10 초 동안 발광을 계산하여 세포 용 해물의 저장 10 μL에 반딧불 활동을 측정합니다. 96 잘 플레이트의 용량은 절반 정도 시간이 소요됩니다. [팁 : 반딧불 루시 페라 제의 투여는 냉동 해물에 다음날 수행 할 수 있습니다.]

9. NLR 계산
   1. 각 상호 작용, Gaussia 루시 페라 제 활동과 계정의 transfection 효율과 세포 생존 능력을 고려하여 표준화 된 Gaussia 발광 값을 얻기 위해 반딧불 루시 페라 제 활동 사이의 비율을 계산합니다. triplicates의 평균을 계산합니다.
   2. 상호 작용을 모니터링하려면, 각 병원체 호스트 쌍에 대한 표준화 발광 비율 (NLR)를 추정한다. 이렇게하려면, 제어 우물에서 측정 활동의 합 (참고 8에서 적응 그림 1)에 의해 병원체와 호스트 단백질 양의 면전에서 발견 정규화 Gaussia 발광 활동을 나눕니다. 긍정적 인 상호 작용 NLR 컷오프 값은 3.5 약 ⁸ 할 것으로 추정하고있다.

10. 데이터 분석
    1. R 통계 패키지를 사용하여 계층 적 클러스터링을 수행합니다. 첫째, 그룹 범주로 NLR 데이터는 다음 완전한 결합 방법을 사용하여 상호 작용 dendrogram을 계산합니다. 이 시각화JavaTreeView ^10로 dendrogram. 피어슨 상관 계수를 사용하여 상호 작용 dendrogram 및 계통 사이의 거리를 계산합니다.
    2. 상호 작용 네트워크를 생성하려면 HT-GPCA 데이터 집합의 긍정적 인 상호 작용을 선택하고 Cytoscape 소프트웨어 사용 ^1. 호스트 단백질의 정도를 추출하고 네트워크 지역 역학에 액세스하기 위해 배포를 플롯. 호스트 병원체 네트워크는 호스트 셀룰러 네트워크에서 병원체 단백질의 글로벌 영향 평가를 제공하는 호스트 interactome에 중첩 할 수 있습니다.
    3. GO (유전자 온톨로지) 데이터 집합의 기능 농축을 평가하는 DAVID 생물 정보학 데이터베이스 ^{12 개} 대상 세포 요인과 관련된 용어를 추출합니다.

결과

그림 2의 HPV E2 단백질 (참고 13 일부터 적용)에 대한 거짓 긍정과 거짓 부정 비율의 평가에 의해 그림과 같이 HT-GPCA의 주요 장점은, 높은 감도에있다. 음성률을 확인하려면, HPV16에서 E2의 알려진 상호 작용은 HT-GPCA (그림 2A)에 의해 평가 하였다. 18의 상​​호 작용 중 네 가지가 (22 % 위음성 율에 해당) 복구되지 않았다. 거짓 긍정적 인 상호 작용은 세포 단백질의 임의의 집?...

토론

독립적으로, 효모 이러한 두 GST 풀다운 Lumier의 또는 MAPPIT으로 하이브리드 및 포유류의 상호 작용 분석은 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출하는 효과적인 도구로 입증했지만, 양성과 거짓 음성의 높은 속도에 의해 제한됩니다 상호 작용은 이러한 기술 ^15과 관련된. 또한, 증거가 직교 방법을 결합하여 얻어진 상호 작용 데이터 세트 ^7의 신뢰성을 증가 시킨다는 성장하고있다. HT-GPCA...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Yeast strains	Clontech
Minimal SD base	US biological	D9500
Amino acids	Sigma
3-amino-1,2,4-Triazole (3-AT)	Acros organics	264571000
Zymolase	Seikagaku	120491
DMEM	Gibco-Life Technologies	31966
Fetal bovine serum	BioWest	S1810
Phosphate buffer Saline (PBS)	Gibco-Life Technologies	14190
Penicillin-Streptomycin	Gibco-Life Technologies	15140
Trypsin-EDTA	Gibco-Life Technologies	25300
Renilla luciferase assay	Promega	E2820
White culture plate	Greiner Bio-One	655083
96-wellPCR plates	4titude	4t-i0730/C
Incubator (30 °C)	Memmert
Incubator (37 °C)	Heraeus
Luminometer	Berthold	Centro XS-LB 960