ホスト病原体のタンパク質 - タンパク質相互作用の風景を特徴づけるために比較的アプローチ

要約

この記事では、ホストと二つの直交の方法を組み合わせて使用​​して病原体のタンパク質間の高い自信インタラクションデータセットの識別に焦点を当てています：酵母ツー​​ハイブリッドHT-GPCA呼ばれる哺乳動物細胞におけるハイスループット相互作用アッセイが続く。

要約

多大な努力は、大規模な総合タンパク質 - タンパク質相互作用ネットワークマップを生成するために集まっていた。これは、病原体 - 宿主の関係を理解することが尽力され、本質的に、酵母ツーハイブリッドシステムを遺伝的スクリーニングにより行った。 ガウルシフェラーゼベース断片相補アッセイによるタンパク質間相互作用検出の最近の改善は今厳格細胞因子の共通のセットに対して異なる病原体の歪み変種からのタンパク質の相互作用プロファイルを比較するために必要な統合的な比較interactomicアプローチを開発する機会を提供しています。

本稿では、具体的には、タンパク質-タンパク質相互作用データセットを生成するために2つの直交方法を組み合わせるの有用性に焦点を当て酵母ツーハイブリッド（Y2H）と新しいアッセイ、哺乳動物細胞において行わハイスループットガウヨモギタンパク質相補アッセイ（HT-GPCA）。 NTが "病原体タンパク質の細胞パートナーの>大規模同定は、複数の病原体の歪みバリアントを使用してcDNAライブラリーの交配ベース酵母ツーハイブリッドスクリーニングによって実行されます。高い信頼統計的スコアで選択パートナー相互作用のサブセットがさらにあるHT-GPCAを用いた病原体の変異体タンパク質のセット全体でペアワイズ相互作用のため、哺乳動物細胞で検証。二つの相補的な方法の組み合わせは、相互作用データセットの堅牢性を向上させ、厳格な比較相互作用解析のパフォーマンスが可能になります。このような比較interactomicsは解読任意の病原体 - 宿主interplaysに信頼性が高く、強力な戦略を構成する。

概要

タンパク質 - タンパク質相互作用マップを生成するために収集されるデータ量の増加はさらに、病原体感染を理解するための視点を開く。病原体感染症の世界的な理解が出現し始めると、それは人間のプロテオーム^1を接続する場合は病原タンパク質によって誘導された摂動の範囲へのアクセスを提供します。それにより病原体が宿主細胞機械を操作する方法理解する方法を提供します。特に、いくつかのウイルス宿主相互作用ネットワークのマッピングは、ウイルスタンパク質が優先的に非常に（ハブ）セルラーネットワークに接続されている、またはネットワーク（ボトルネックタンパク質^）2-4の多くのパスの中心とその宿主タンパク質を標的とすることを明らかにした。これらの相互作用は、感染性の子孫を複製し、生成する楽器である、ウイルスが重要な細胞プロセスを操作することができます。比較の相互作用のマッピングは最近に関連する情報を抽出することを目標に関連したウイルスで実施されました病因^4。さらに、ホスト病原体の相互作用の風景の研究は、多くの病原体⁵に拡張されました。標的細胞因子の同定は、細胞に感染する病原体によって使用される戦略に洞察を提供し、潜在的な病原性マーカーの検出を可能にする。

酵母ツーハイブリッドシステムは、遺伝スクリーニングがタンパク質 - タンパク質相互作用のハイスループットマッピングのための効率的かつ高感度なツールであるため、バイナリの相互作用を同定するための最も一般的な方法である。さらにここで提案手法は、このようにして、病原体宿主タンパク質 - タンパク質相互作用の比較概要へのアクセスを提供する、複数の病原菌株変異体の蛋白質を評価することによって、個々のY2Hの上映を向上させることができる。それは全体の相互作用⁶の約20％を回収するため、また、酵母ツーハイブリッドスクリーニングの主な制限は、高い偽陰性率にある。これは、相互作用が病態のサブセットのみで検出されたことを意味します氏族バリアントは他の人と検出を免れたかもしれない。したがって、すべてのツーハイブリッドスクリーニングから出てくる個々のパートナーは、さらに比較の相互作用データセットを提供し、研究した株の完全な範囲との相互作用のために挑戦されています。それは別の手法を組み合わせることが強くタンパク質-タンパク質相互作用データセット⁷のロバスト性を増加させることが実証されたので、この検証は、HT-GPCA ⁸と呼ばれる新しく開発されたタンパク質断片相補アッセイにより、哺乳動物細胞中で行われる。このセルベースのシステムでは、 ガウヨモギの補完によるタンパク質相互作用の検出はルシフェラーゼを分割し、ハイスループットフォーマットと互換性があるように設計されていることができます。その発光ベースの技術のおかげで、その低バックグラウンドノイズは、他の蛍光ベースのアッセイと比較して、HT-GPCAは著しく高い感度を示しています。

全体として、このアプローチは、効率的となるハイジャックされた宿主細胞の国際理解の第一歩を表しホスト病原体のinterplaysの包括的なマッピングを生成するツール。

プロトコル

1。酵母ツーハイブリッドスクリーニング

1. 次の必要なソリューションを行います。
   1. 完全合成ドロップアウト（SD）は：水1 Lのグルコースと最小限のSDベースの26.7グラムを溶かす。 2グラムアデニンヘミ硫酸塩、2グラムアルギニン塩酸、2グラムヒスチジンHClで 、2グラムイソロイシン、4グラムロイシン 、2グラムリジン塩酸、2メチオニングラム、3グラムフェニルアラニン、2グラムL：次のように調製したアミノ酸混合物2gを追加する-セリン、2グラムのL-スレオニン、 トリプトファン 3グラム、2グラムのチロシン、1.2グラムのウラシル、9グラムバリン。
   2. SD-L/-W/-Hアウト選択ドロップ：SDは、指定されたものを除き、すべての必須アミノ酸が含まれている（-L：-ロイシン、-W：-トリプトファン、-H：-ヒスチジン）。
   3. YPGLU：L 1、重量酵母エキス、バクトペプトン10g及びグルコース20gを10gのために。固形培地のため25グラムバクト寒天で完了。
   4. YCM：YPGLUと同じですが、pHを4.5に調整した。
2. 交配と拡散
   1. プレ変換の凍結アリコートを使用pACT2にクローニングしたcDNAライブラリーを含むED Y187酵母株（交配型α）。 SD-Lプレート上に連続希釈液をメッキすることによって、細胞の生存を確認してください。
   2. pGBKT7ベクターに病原体ORFのクローンを作成し、AH109酵母株（交配型）に標準的な手順を使用して組換えプラスミドを変換します。
   3. スプレッドSD-Wプレート上AH109酵母pGBKT7形質。加湿インキュベーター内で少なくとも2日30℃でインキュベートする。プレートを4℃で保存できますツーハイブリッドスクリーニングまでC。
   4. 病原 'タンパク質によってHIS3レポーター遺伝子の潜在的な自己トランスを打ち消すために3 - アミノトリアゾール（3-AT）、HIS3酵素の競合的阻害剤を使用します。 SD-W/-Hプレート上pGBKT7形質転換酵母の生育を妨げる3-ATの濃度を決定することにより、オートアクティベーションテストを実行します。
   5. pGBKT7形質AH109数コロニーとSD-Wのシード30ミリリットル。回転と30℃で30時間インキュベートする。
   6. 30mlでSD-Wの種子200ミリリットルAH109文化の。 30℃で20時間を中心とした回転でインキュベート℃に
   7. 20ミリリットルYPGLU、30℃でインキュベート10分°回転、CでcDNAライブラリー形質転換Y187を解凍インキュベートする。
   8. 20℃で3,500 rpmで5分間実行可能なY187酵母細胞に相当量に対応pGBKT7形質AH109文化の音量を遠心慎重に10ミリリットルYPGLUで上清とペレットを再懸濁しを撤回。
   9. Y187含むライブラリで再懸濁したAH109酵母を混ぜる。を50mlチューブに移します。 20℃で3,500 rpmで5分間遠心°Cは、慎重に上清を取り下げる（壊れやすいペレット）。
   10. 1.5ミリリットルの合計を取得するYPGLUでペレットを再懸濁します。
   11. スプレッド酵母YCM-寒天3〜上の150ミリメートルプレート、0.5ミリリットル/プレート。 30℃で4.5時間インキュベートする℃に
   12. SD-L/-W/-H 10mlにすくいガラスを削ってYCMプレートからの交配酵母を収集します。 5ミリリットルSD-L/-W/-H媒体とプールでプレートを2回すすいでください。
   13. 20、3,500 rpmで5分間遠心℃の上清を捨て、5ミリリットルSD-L/-W/-H培地で酵母ペレットを再懸濁します。
   14. オートアクティベーション試験で測定3 - アミノトリアゾール（3-AT）の適切な濃度で補充SD-L/-W/-H寒天の10プレート（0.5ミリリットル/プレート）の上に交配酵母を広げた。 6-10日間加湿雰囲気中30℃でインキュベートする。
   15. SD-L/-Wプレート上交配酵母懸濁液の連続希釈液を250μl（10 ^{-6〜10 -4）を}広めることで交配の効率性を評価するために、二倍体（2n個）比率を決定します。二日間30℃でプレートをインキュベートする。 SD-L/-Wに生育したコロニーをカウントし、交配酵母の初期体積中に存在する全二倍の数を推測する。二倍の速度を算出する実行可能なライブラリーを含有する酵母番号にこの二倍体番号を報告する。それは10-25％程度の範囲にする必要があります。
   16. 6-10日30℃インキュベーション後°C、新鮮SD-L/-W/-Hで交配酵母コロニー+プレート3-ATを選ぶ。 [ ヒント：オーダー酵母8のスキームでそれは]を配列するためのその後容易になりますように12ウエルのレーンは、96ウェルプレートを再現。酵母コロニー加湿雰囲気中30℃で4-5日°Cのために成長しましょう​​。
3. PCRおよび配列決定によりHIS3陽性クローンのスクリーニング
   目標は、選択的なSD-L/-H/-Wプレート上で増殖させた酵母コロニーのpACT2ベクトルに含まれるORFをPCR増幅することです。
   1. 氷の上に96ウェルPCRプレートを置く。
   2. 酵母細胞を溶解する、ザイモラーゼ20T溶液（10mMリンHEPES緩衝液pH 7.7で2.5 mg / ml）でのウェルあたり50μLを加える。
   3. 優しくウェルあたり1コロニーを懸濁します。
   4. 37℃で15分間インキュベート℃、95℃で15分
   5. 氷の上にバックプレートを置く。ウェルあたりの蒸留水50μLを加える。ピペッティングでよく混ぜる。
   6. 3,500回転と4で5分間遠心℃、
   7. PCRは、pACT2ベクトル中のcDNA由来のORFのいずれかの側面をアニーリングするプライマーを使用して、挿入を検出するために、10μLを増幅する。プロトコルはgであるExTaqポリメラーゼで96溶解した酵母コロニーの増幅のためのiven。 525μlの10X ExTaqバッファー、420μLのdNTPミックス（2.5 mM）を、10.5μlのフォワードプライマー（1μgの/μL）、10.5μlのリバースプライマー（1μgの/μL）、31.5μlのExTaq（5 U /μL以下のミックスを調製）と3202.5μlのH ₂ 0。 96ウェルPCRプレートのウェルあたり40μlのミックスを配布します。ウェルあたり溶解酵母液10μlを追加します。 7分間の1で4分間分、72℃、および72で終わる℃で30秒、60℃で94℃で、その後3分、35サイクル°C、94°C以下のように増幅を行う。 PCR陽性クローンを検出するために、1.2％アガロースゲル上でPCR産物の3μLを実行します。使用してプレキャスト96ウェルアガロースゲルが推奨されることに注意してください。
      [ヒント板は、数ヶ月間-20℃で保存して、新しいPCRのために再使用することができる]
   8. HIS3陽性クローンから単離し、PCR増幅断片の配列。細胞のORFを同定するためにBLAST分析を実行します。低信頼アライメント（E値＆GT、10 ^-10、アイデンティティ<80％、ペプチド長<20アミノ酸）が同様frameshiftedと配列を含む未成熟終止コドンとして破棄されます。

2。 HT-GPCAためのマトリックスビル

HT-GPCAは両方の病原体と宿主のタンパク質を一過スプリットガウヨモギルシフェラーゼの相補的な断片に融合発現している哺乳類の細胞ベースのアッセイである。パートナーの相互作用時に、この酵素は、その酵素活性の測定を可能にする再構成される。相互作用の強さは、このように正規化された発光比（下記参照、 図1）から推定される

4. 宿主細胞パートナーの選択
   1. データセットの信頼^9を高めるために、哺乳動物細胞におけるさらなる検証のためY2Hスクリーニング以上の三回識別されたタンパク質を選択する。
   2. POSITIとして病原体タンパク質の既知の相互作用パートナーを追加コントロールをVEの。
5. HT-GPCA互換ベクターに移す
   1. アミノ酸ルシフェラーゼそれらのN末端 ​​（GL2-病原体タンパク質融合）で融合ヒトガウのヨモギの110から185と病原体のタンパク質を生成するpSPICA-N2ベクトルの各病原体タンパク質ORFのクローンを作成します。
   2. PCRは、ORF直接Y2H陽性クローンからまたは他のORFのリソース（ヒトORFeomeのから細胞タンパク質を増幅http://horfdb.dfci.harvard.edu/とN末端 ​​に融合したタンパク質を生成する）とpSPICA-N1ベクターに移すアミノ酸はヒトガウヨモギルシフェラーゼ（GL1ホストタンパク質融合）の18から109。
      [ヒント：大規模クローニングについては、ゲートウェイクローニングシステムが推奨されます。その場合、PCR増幅のために、ゲートウェイと互換性部位を含むように設計されたプライマーを使用し]。
   3. シーケンスのすべての発現ベクターを。 pSPICA-N1とpSPICA-N2の配列文献8に記載されています。

プラスミド構築がpSPICA-N1で、 すなわち病原体タンパク質を反転し、ホストタンパク質pSPICA-N2にできることに注意してください。

3。ハイスループットガウヨモギルシフェラーゼベースのタンパク質相補アッセイ（HT-GPCA）

6. 細胞トランスフェクション
   1. 抗生物質なしで、10％ウシ胎児血清（FBS）を含むDMEM 35万細胞/ mlでシード293T細胞。を100μl/ウェル無菌白培養プレートで配布します。単一の実験で10皿を超えないようにしてください。細胞は5％CO ₂で37℃で24時間成長させて。
      [ ヒント：pSPICAプラスミドは、SV40起点を含んでいるので、293T細胞の使用は、トランスフェクションした細胞での複製を可能にするため、2ルシフェラーゼ断片の過剰発現につながる]
   2. 翌日、任意の適切なトランスフェクションのプロトコルを用いてトランスフェクト細胞。 NU、特定のトランスフェクション試薬のためにあることに注意してください播種した細胞のmberは、適合させる必要があります。 100ngのウェル当たりの病原体と宿主ORFプラスミド構築の両方を使用します。コ·トランスフェ10 ngのウェルあたりのトランスフェクション効率のために正規化するプラスミドCMV-ホタルルシフェラーゼの。各点は3回テストされます。
      [ ヒント：DNAミックスを粘着シールでトランスフェクションの前日を行い、-20℃で保存することができます]
   3. 培養された293T細胞のプレートにトランスフェクション混合物を転送します。 293Tは強く付着ではなく、簡単に井戸の底から切り離すように、優しく細胞にDNAミックスを堆積するように注意してください。 5％CO _2、37℃で24-30時間、細胞培養インキュベーター中でインキュベートする。

7. 細胞溶解とガウルシフェラーゼ用量
   1. PBS（100μL/ウェル）で細胞を洗浄します。 40μlの1X ウミ溶解バッファーを追加します。撹拌しながら室温で30分間インキュベートする。
   2. 別の白のプラットフォームで細胞溶解液10μlを救うホタルルシフェラーゼ活性を、その後の投与量の電子。 4℃で保存または代わりに-20℃で密閉したC。
   3. ウミシイタケルシフェラーゼアッセイ試薬100μlのを追加し、ルミノメーターで10秒間の発光をカウントすることによって、細胞溶解物の残りの30μlの上のガウの活性を測定する。 96ウェルプレートの用量は、半時間ほどかかります。凍結または長期保管は、インタラクション媒介ガウの活動に影響を及ぼす可能性があるので、新鮮な細胞抽出と測定を行います。

8. ホタル活性の測定
   1. ホタルルシフェラーゼアッセイ試薬を50μlを添加し、10秒間の発光をカウントすることにより細胞溶解物の保存された10μlの上ホタル活性を測定する。 96ウェルプレートの用量は、半時間ほどかかります。 [ ヒント：ホタルルシフェラーゼの投与量は、凍結したライセートた日後に行うことができます。]

9. NLRの計算
   1. 各相互作用のために、アカウントトランスフェクション効率と細胞生存率を考慮して正規化されたガウの発光値を得るためにガウルシフェラーゼ活性およびホタルルシフェラーゼ活性の比を算出する。三重の平均値を計算します。
   2. 相互作用を監視するには、それぞれの病原体 - 宿主ペアの正規ルミネッセンス比（NLR）を推定。そうするには、コントロールウェルで測定された活動の和（参照8から適応図1）により、病原体と宿主タンパク質の両方の存在下で検出され、正規化ガウの発光活性を分割。肯定的な相互作用のためNLRカットオフ値は、3.5 ⁸の周囲と推定されている。

10. データ分析
    1. R統計パッケージを使用して階層的クラスタリングを実行します。まず、カテゴリにグループNLRデータは、その後、完全な連携方式を使用して相互作用系統樹を計算します。これを視覚化JavaTreeView ¹⁰と樹。ピアソンの相関係数を用いた相互作用系統樹と系統樹の間の距離を計算します。
    2. 相互作用ネットワークを生成するには、HT-GPCAデータセットからの肯定的な相互作用を選択して、Cytoscapeソフトウェア^1を使用しています。宿主タンパク質の程度を抽出し、ネットワークのローカルダイナミクスにアクセスし、その分布をプロットします。ホスト病原体ネットワークはホスト、セルラーネットワークにおける病原体タンパク質の世界的な影響の評価を提供するために、ホストのインタラクトームに重ね合わせることができる。
    3. GO（遺伝子オントロジー）データセットの機能の充実を評価するDAVIDバイオインフォマティクスデータベース¹²と、標的細胞因子に関連付けられている用語を抽出。

結果

図2のHPV E2タンパク質（参照13から適応）が偽陽性と偽陰性率の評価で示されるようにHT-GPCAの主要な強さは、その高感度にある。偽陰性率を決定するために、HPV16からE2の既知の相互作用は、HT-GPCA（ 図2A）により評価した。 18の相互作用のうち、4つは（22％偽陰性率に相当）を回収していませんでした。偽陽性の対話は、細胞タンパク質のランダムセット（ 図2B...

ディスカッション

独立して、例えば、GSTプルダウンLUMIER又はMAPPITなどの酵母ツーハイブリッドおよび哺乳類相互作用アッセイは、タンパク質 - タンパク質相互作用を検出するための効果的なツールであることが証明されているが、偽陽性および偽陰性率の高さによって制限される相互作用は、これらの技術¹⁵に関連付けられている。また、証拠は直交の方法を組み合わせると得られた相互作用データセ...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Yeast strains	Clontech
Minimal SD base	US biological	D9500
Amino acids	Sigma
3-amino-1,2,4-Triazole (3-AT)	Acros organics	264571000
Zymolase	Seikagaku	120491
DMEM	Gibco-Life Technologies	31966
Fetal bovine serum	BioWest	S1810
Phosphate buffer Saline (PBS)	Gibco-Life Technologies	14190
Penicillin-Streptomycin	Gibco-Life Technologies	15140
Trypsin-EDTA	Gibco-Life Technologies	25300
Renilla luciferase assay	Promega	E2820
White culture plate	Greiner Bio-One	655083
96-wellPCR plates	4titude	4t-i0730/C
Incubator (30 °C)	Memmert
Incubator (37 °C)	Heraeus
Luminometer	Berthold	Centro XS-LB 960