Uma abordagem comparativa para caracterizar a paisagem de Patógeno-Hospedeiro interações proteína-proteína

Resumo

Este artigo centra-se na identificação de conjuntos de dados de interação de alta confiança entre hospedeiro e as proteínas do patógeno usando uma combinação de dois métodos ortogonais: levedura de dois híbridos seguido de um ensaio de interação de alto rendimento em células de mamíferos chamada HT-GPCA.

Resumo

Esforços significativos foram reunidos para gerar mapas de rede de interação grande escala global proteína-proteína. Isso é fundamental para compreender as relações patógeno-hospedeiro e foi essencialmente realizado por exames genéticos em leveduras sistemas de dois híbridos. A recente melhoria da detecção de interação proteína-proteína por um ensaio de complementação fragmento baseado luciferase Gaussia agora oferece a oportunidade de desenvolver abordagens integradoras interactomic comparativas necessárias para comparar rigorosamente perfis de interação de proteínas de diferentes variantes de deformação do patógeno contra um conjunto comum de fatores celulares.

Este trabalho concentra-se especificamente sobre a utilidade de combinar dois métodos ortogonais para gerar conjuntos de dados de interação proteína-proteína: levedura de dois híbridos (Y2H) e um novo ensaio, Gaussia princeps ensaio complementação proteína de alto rendimento (HT-GPCA), realizado em células de mamíferos. nt "> A identificação em larga escala de parceiros celulares de uma proteína patógeno é realizada por meio de cruzamentos de levedura baseado em rastreios de dois híbridos de bibliotecas de cDNA, utilizando múltiplas variantes de deformação do patógeno. Um subconjunto de parceiros que interagem seleccionados numa pontuação maior confiança estatística é maior validado em células de mamíferos para interações de pares com todo o conjunto de proteínas variantes do patógeno usando HT-GPCA. Esta combinação de dois métodos complementares melhora a robustez do conjunto de dados de interação, e permite a realização de uma análise comparativa interação rigoroso. Tais interactomics comparativos constituem uma estratégia confiável e poderoso para decifrar qualquer interplays patógeno-hospedeiro.

Introdução

O aumento da quantidade de dados coletados para gerar mapas de interação proteína-proteína abre perspectivas para entender melhor as infecções do patógeno. A compreensão global das infecções de agentes patogénicos começa a surgir, proporciona acesso à gama de perturbações induzidas por proteínas de agentes patogénicos ao ligar o proteoma humano ^1. É, assim, oferece uma maneira de compreender como patógenos manipular a maquinaria da célula hospedeira. Em particular, o mapeamento de várias redes de interacção hospedeiro-viral revelou que as proteínas virais como alvo proteínas do hospedeiro, preferencialmente, que são altamente ligados em rede celular (cubos), ou que são o centro de muitos caminhos na rede (proteínas estrangulamentos) ^2-4. Essas interações permitem que os vírus para manipular processos celulares importantes, o que é fundamental para reproduzir e produzir descendência infeccioso. Comparada interações mapeamento foram recentemente realizados sobre vírus relacionados com o objetivo de extrair informações relativas àpatogénese ^4. Além disso, estudos do host patógenos interações paisagem foram estendidos para muitos patógenos ^5. A identificação de fatores de célula alvo fornece insights sobre as estratégias utilizadas pelos patógenos para infectar as células e permite a detecção de marcadores potenciais patogênicos.

O sistema de dois híbridos de levedura é o método mais popular para identificar interacções binários desde rastreio genético é uma ferramenta eficiente e sensível para o mapeamento de alto rendimento de interacções proteína-proteína. A abordagem aqui proposta melhora ainda mais a exames Y2H individuais, avaliando uma proteína de patógenos múltiplas variantes de tensão, proporcionando assim o acesso a uma visão comparativa das interações proteína-proteína patógeno-hospedeiro. Além disso, a maior limitação do rastreio de levedura de dois híbridos reside numa elevada taxa de falsos negativos, uma vez que se recupera cerca de 20% do total das interacções ^6. Isto implica que as interacções detectados com apenas um subconjunto dos agentes patogénicosgens variantes podem ter escapado à detecção com os outros. Portanto, parceiros individuais emergentes de todos os exames de dois híbridos são mais desafiados para a interação com a gama completa de cepas estudadas, fornecendo conjuntos de dados de interação comparativos. Uma vez que foi demonstrado que a combinação de diferentes metodologias aumenta fortemente a robustez da interacção proteína-proteína conjuntos de dados ^7, esta validação é realizada em células de mamíferos por um ensaio de complementação da proteína-fragmento recentemente desenvolvido chamado HT-GPCA ^8. Este sistema baseado em células permite a detecção de interacções proteicas por complementação da Gaussia princeps dividir luciferase e foi concebido para ser compatível com um formato de alto rendimento. Graças à sua tecnologia baseada em luminescência e seu baixo ruído de fundo em comparação com outro ensaio baseado em fluorescência, HT-GPCA mostra uma impressionante alta sensibilidade.

No geral, esta abordagem constitui uma eficienteferramenta para gerar um mapeamento abrangente de interplays patógeno-hospedeiro, o que representa o primeiro passo em direção a uma compreensão global da célula hospedeira seqüestro.

Protocolo

1. Levedura Screenings dois híbridos

1. Faça as seguintes soluções necessárias:
   1. Completa Fora gota sintético (SD): Dissolver 26,7 g de base de DP mínimo com glucose em 1 L de água. Adicionam-se 2 g de uma mistura de aminoácidos preparada como se segue: 2 g de hemi-sulfato de adenina, 2 g de arginina HCl, 2 g de histidina HCl, 2 g de isoleucina, leucina 4 g, 2 g de Lisina, 2 g de Metionina, Fenilalanina 3 g, 2 g de L -serina, 2 g de L-Treonina, Triptofano 3 g, 2 g de tirosina, 1,2 g de uracilo, 9 g Valina.
   2. Gota seletiva Out SD-L/-W/-H: SD contendo todos os aminoácidos essenciais, exceto os especificados (-L:-Leucina;-W:-Triptofano;-H:-histidina).
   3. YPGLU: para 1 L, em peso, 10 g de extracto de levedura, 10 g de Bacto-peptona e 20 g de glicose. Completo com 25 g Bacto ágar para meio sólido.
   4. YCM: Igual ao YPGLU, mas o pH ajustado para 4,5.
2. Acasalamento e espalhando
   1. Use aliquotas congeladas de pré-transformed estirpe de levedura Y187 (tipo acasalamento α), contendo uma biblioteca de cDNA clonado em pACT2. Verificar a viabilidade celular por plaqueamento de diluições em série em placas de SD-G.
   2. Clonar o ORF patógeno em pGBKT7 vetor, e transformar o plasmídeo recombinante usando um procedimento padrão em AH109 cepa de levedura (um tipo de acasalamento).
   3. Espalhe pGBKT7 transformada AH109 fermento em placas SD-W. Incubar pelo menos dois dias de 30 ° C num incubador humidificado. As placas podem ser armazenadas a 4 ° C até que o rastreio de dois híbridos.
   4. Utilização de 3-aminotriazole (3-AT), um inibidor competitivo da enzima HIS3, para contrariar o potencial de auto-transactivação do gene repórter HIS3 de proteínas dos agentes patogénicos. Realizar um teste de auto-activação através da determinação da concentração de 3-AT, que impede o crescimento de levedura pGBKT7-transformado em placas SD-W/-H.
   5. Semente 30 ml de SD-W com poucas colônias de pGBKT7 transformada AH109. Incubar 30 horas a 30 ° C com rotação.
   6. Sementes 200 ml de SD-W com o 30 mlAH109 das culturas. Incubar, com rotação a cerca de 20 horas a 30 ° C.
   7. Incubar descongeladas biblioteca de cDNA-Y187 transformada em 20 ml YPGLU, incubar 10 min a 30 ° C com rotação.
   8. Centrifugar um volume de pGBKT7-AH109 cultura transformada correspondente a uma quantidade equivalente de células de levedura Y187 viáveis ​​durante 5 min a 3500 rpm a 20 ° C. Retirar cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender o pellet em 10 ml de YPGLU.
   9. Misture o sedimento de levedura AH109 com Y187 contendo biblioteca. Transferir num tubo de 50 ml. Centrifugar durante 5 minutos a 3500 rpm a 20 ° C, o sobrenadante cuidadosamente retirada (pelete frágil).
   10. Ressuspender o sedimento em YPGLU para obter um total de 1,5 ml.
   11. Espalhe fermento para 3 YCM-Agar placas de 150 mm, 0,5 ml / placa. Incubar 4,5 horas a 30 ° C.
   12. Recolha de levedura acoplado YCM de placas por raspagem com um rodo de vidro em 10 ml de SD-L/-W/-H. Lavar as placas duas vezes com 5 ml de meio e SD-L/-W/-H piscina.
   13. Centrifugar 5 min a 3500 rpm, 20° C. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de levedura em 5 ml de meio SD-L/-W/-H.
   14. Espalhe levedura acoplado em placas de 10 (0,5 ml / placa) de SD-L/-W/-H Agar suplementado com a concentração apropriada de 3-aminotriazole (3-AT), determinada no teste de auto-activação. Incubar a 30 ° C numa atmosfera húmida durante 6-10 dias.
   15. Determinar a taxa diplóide (2n), a fim de avaliar a eficiência de acoplamento por difusão 250 ul de diluições em série (10 ^-4 a 10 ^-6) da suspensão de levedura acoplado em placas SD-L/-W. Incubar as placas a 30 ° C durante dois dias. Contagem das colónias cultivadas em SD-L/-W, e deduzir o número total diplóide presente no volume inicial de levedura acoplado. Denunciar este número diplóide para viável número levedura biblioteca contendo para calcular a taxa diplóide. Ele deve variar de cerca de 10-25%.
   16. 6-10 dias após incubação a 30 ° C, escolher colônias de leveduras acasaladas em SD-L/-W/-H fresco + 3-AT placas. [Dica: para o fermento em um esquema de 8pistas de 12 cavidades que reproduzem uma placa de 96 poços de modo que será mais fácil depois para sequenciação]. Deixe colónias de levedura crescer durante 4-5 dias a 30 ° C numa atmosfera húmida.
3. Triagem de His3 clones positivos por PCR e seqüenciamento
   O objectivo é o de amplificar por PCR a ORF contida nos vectores pACT2 de colónias de leveduras cultivadas em placas SD-L/-H/-W selectivos.
   1. Colocar uma placa de 96 poços de PCR em gelo.
   2. Para lisar as células de levedura, adicionar 50 ul por poço de uma solução Zymolase 20T (2,5 mg / ml em 10 mM de Hepes pH 7,7).
   3. Delicadamente ressuspender uma colônia por poço.
   4. Incubar 15 min a 37 ° C e 15 min a 95 ° C.
   5. Colocar a placa de volta em gelo. Adicionar 50 ul de água destilada por poço. Misture bem por pipetagem cima e para baixo.
   6. Centrifugar durante 5 minutos a 3.500 rpm e 4 ° C.
   7. Amplificar por PCR de 10 jil para detectar uma inserção utilizando iniciadores de recozimento ambos os lados da ORF derivados de ADNc em vectores de pACT2. O protocolo é gada para a amplificação de 96 colónias de leveduras lisadas com a polimerase de ExTaq. Preparar a seguinte mistura: 525 ul de tampão 10X ExTaq, 420 ul da mistura de dNTPs (2,5 mM), 10,5 ul de iniciador directo (1 ug / ul), 10,5 ul de iniciador reverso (1 ug / ul), 31,5 ul ExTaq (5 U / ul ) e 3202,5 ​​ul _de H ₂ 0. Distribuir 40 ul da mistura por poço numa placa de PCR de 96. Adicionar 10 ul de levedura lisada por poço. Realizar a amplificação como se segue: 94 ° C durante 3 min, depois 35 ciclos a 94 ° C durante 30 seg, 60 ° C durante 1 min, 72 ° C durante 4 min, e no final com 72 ° C durante 7 min. Executar 3 ul dos produtos de PCR num gel de agarose a 1,2% para detectar clones de PCR-positivas. Note que a utilização de pré-molde de 96 cavidades de géis de agarose é recomendada.
      [Dica: placa pode ser armazenada a -20 ° C durante alguns meses e reutilizada para nova PCR]
   8. Sequência os fragmentos amplificados de PCR a partir de isolados HIS3 clones positivos. Faça uma análise BLAST para identificar celular ORF. Alinhamentos de baixa confiança (E & valorgt, 10 ^-10, identidade <80%, o comprimento de péptidos <20 aminoácidos) são eliminados, bem como frameshifted e codão de paragem prematuro contendo sequências.

2. Edifício Matriz para HT-GPCA

HT-GPCA é um ensaio à base de células de mamífero em que ambas as proteínas de agentes patogénicos e de acolhimento são transitoriamente expressa fundida com fragmentos complementares da divisão Gaussia princeps luciferase. Após a interacção dos parceiros, esta enzima é reconstituído permitindo a medida da sua actividade enzimática. A intensidade da interacção é assim deduzido a partir de uma Proporção Normalizada luminescência (ver abaixo e na Figura 1)

4. Selecção de parceiros celulares hospedeiras
   1. Escolha proteínas que são identificados mais de três vezes nos rastreios Y2H para validação adicional em células de mamíferos para aumentar a confiança do conjunto de dados ^9.
   2. Adicionar conhecidos parceiros que interagem com as proteínas do patógeno como positive controlos.
5. Transferência em vetores compatíveis HT-GPCA
   1. Clone cada proteína patógeno ORF num vector pSPICA-N2 para gerar proteínas de agentes patogénicos com aminoácidos 110-185 dos princeps Gaussia humanizados luciferase fundidos os seus N-terminus (fusões de proteínas GL2-agente patogénico).
   2. PCR amplificar o ORF da proteína celular directamente a partir dos clones positivos Y2H ou de outros recursos ORF (ORFeome Humano http://horfdb.dfci.harvard.edu/ ) e transferi-los em vectores pSPICA-N1 para gerar proteínas fundidas no terminal N com os aminoácidos 18-109 da humanizado Gaussia princeps luciferase (fusões de proteínas GL1-anfitrião).
      [Dica: Para a clonagem em larga escala, o sistema de clonagem Gateway é recomendado. Nesse caso, para a amplificação por PCR, utilizar iniciadores concebidos para conter locais compatíveis gateway].
   3. Sequência de todos os vetores de expressão. Seqüências do pSPICA-N1 e N2-pSPICApode ser encontrado na referência 8.

Note-se que construções de plasmídeos pode ser invertida, ou seja, proteínas patógenos em pSPICA-N1 e proteína do hospedeiro em pSPICA-N2.

3. High-Throughput Gaussia princeps luciferase à base de proteínas Ensaio de Complementação (HT-GPCA)

6. Transfecção celular
   1. Semente células 293T de 350.000 células / mL de meio DMEM com 10% de soro fetal bovino (FBS) sem nenhum antibiótico. Distribuir 100 ^ l / poço em placas de cultura estéreis branco. Não exceder 10 placas em um único experimento. Deixe as células crescer durante 24 horas a 37 ° C com 5% de CO _2.
      [Dica:. PSPICA Uma vez que os plasmídeos contêm uma origem de SV40, o uso de células 293T permite a sua replicação em células transfectadas e, portanto, conduz a sobre-expressão de dois fragmentos de luciferase]
   2. No dia seguinte, as células transfecção usando qualquer protocolo de transfecção adequado. Note-se que para certos reagentes de transfecção, o number de células semeadas pode ter de ser adaptado. Utilização de 100 ng por poço de ambas hospedeiro do agente patogénico e ORF construções de plasmídeos. A co-transfecção de 10 ng por poço de um de CMV-luciferase do pirilampo plasmídeo para normalizar para a eficiência de transfecção. Cada ponto é testado em triplicata.
      [Dica:. Misturas de ADN pode ser realizada um dia antes da transfecção e armazenadas a -20 ° C, com vedantes adesivas]
   3. Transferir a mistura de transfecção das placas de cultura de células 293T. Ter cuidado para depositar suavemente a mistura de ADN para as células, como 293T não são fortemente aderente e facilmente separar a partir do fundo do poço. Incubar numa incubadora de cultura de células 24-30 horas a 37 ° C com 5% de CO _2.

7. A lise celular e Gaussia luciferase dosagem
   1. Lavar as células com PBS (100 ul / poço). Adicionar 40 de tampão de lise 1X Renilla ul. Incubar durante 30 minutos à temperatura ambiente, sob agitação.
   2. Economize 10 ml de lisados ​​celulares em outra plataforma brancoe para posterior dosagem da atividade da luciferase Firefly. Armazenar a 4 ° C ou, alternativamente, à temperatura de -20 ° C, com vedação.
   3. Medir a actividade Gaussia nos restantes 30 ul de lisados ​​de células por adição de 100 ul de reagente de ensaio de luciferase de Renilla e contando luminescência durante 10 segundos com um luminómetro. Dosagem de uma placa de 96 poços leva cerca de meia hora. Realizar medição com extratos de células frescas desde estocagem ou a longo prazo pode afetar a atividade Gaussia interação mediada.

8. Mensuração da atividade Firefly
   1. Medir a actividade Firefly no salvo 10 ul de lisados ​​de células por adição de 50 uL de reagente de ensaio de luciferase do vaga-lume e contando luminescência durante 10 seg. Dosagem de uma placa de 96 poços leva cerca de meia hora. [Dica: A dosagem de luciferase de pirilampo podem ser realizadas no dia seguinte em lisados ​​congelados.]

9. Cálculos NLR
   1. Para cada interacção, calcular a relação entre Gaussia actividade de luciferase e a actividade da luciferase do vaga-lume para obter um valor normalizado luminescência Gaussia tendo em conta a eficiência de transfecção e da viabilidade celular. Calcule a média dos triplicados.
   2. Para monitorar a interação, estimar uma relação de luminescência Normalizada (NLR) para cada par patógeno-hospedeiro. Para isso, divide a actividade normalizada Gaussia luminescência detectada na presença de ambos, do patógeno e proteínas do hospedeiro pela soma das actividades medidas nos poços de controlo (Figura 1 adaptada de referência 8). O NLR valor de corte para interações positivas foi estimado em cerca de 3,5 ^8.

10. A análise dos dados
    1. Realizar agrupamento hierárquico utilizando o pacote estatístico R. Em primeiro lugar, agrupar os dados em categorias NLR, em seguida, calcular um dendrograma interação utilizando o método de ligação completa. Visualize estedendrograma com JavaTreeView ^10. Calcular a distância entre dendrograma interação e árvore filogenética usando um coeficiente de correlação de Pearson.
    2. Para gerar redes de interação, selecione as interações positivas do conjunto de dados HT-GPCA e usar o software Cytoscape ^1. Extraia os graus das proteínas do hospedeiro e traçar a sua distribuição para acessar as dinâmicas locais de rede. Redes Host-patógenos pode ser sobreposto ao interactome host para fornecer uma avaliação do impacto global das proteínas do patógeno na rede de celular do hospedeiro.
    3. Extraia o GO (Gene Ontology) termos associados aos fatores celulares específicos com o banco de dados DAVID bioinformática ¹² para avaliar o enriquecimento funcional do conjunto de dados.

Resultados

Uma grande força de HT-GPCA reside na sua elevada sensibilidade, tal como ilustrado pela avaliação das taxas de falsos positivos e falsos negativos para a proteína E2 de HPV na Figura 2 (adaptado da referência 13). Para determinar a taxa de falsos negativos, interacções conhecidas de E2 de HPV16 foram avaliadas por HT-GPCA (Figura 2A). Quatro dos 18 interacções não foram recuperados (correspondente a uma taxa de falsos negativos de 22%). As interacções de falsos positivos fo...

Discussão

Independentemente, o fermento e dois ensaios de interação híbridos e mamíferos, como GST pull-down, lumier ou MAPPIT, provaram ser ferramentas eficazes para detectar interações proteína-proteína, mas são limitados pela alta taxa de falso-positivos e falso-negativos interacções associadas com estas técnicas ^15. Além disso, a evidência crescente de que a combinação de métodos ortogonais aumenta a confiabilidade do conjunto de dados de interação obtidas ^7. O desenvolvimento recente ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Yeast strains	Clontech
Minimal SD base	US biological	D9500
Amino acids	Sigma
3-amino-1,2,4-Triazole (3-AT)	Acros organics	264571000
Zymolase	Seikagaku	120491
DMEM	Gibco-Life Technologies	31966
Fetal bovine serum	BioWest	S1810
Phosphate buffer Saline (PBS)	Gibco-Life Technologies	14190
Penicillin-Streptomycin	Gibco-Life Technologies	15140
Trypsin-EDTA	Gibco-Life Technologies	25300
Renilla luciferase assay	Promega	E2820
White culture plate	Greiner Bio-One	655083
96-wellPCR plates	4titude	4t-i0730/C
Incubator (30 °C)	Memmert
Incubator (37 °C)	Heraeus
Luminometer	Berthold	Centro XS-LB 960