Komparativen Ansatz, um die Landschaft von Wirt-Pathogen-Protein-Protein-Wechselwirkungen charakterisieren

Zusammenfassung

Dieser Artikel konzentriert sich auf die Identifizierung von High-Interaktion zuversichtlich Datensätze zwischen Wirt und Pathogen-Proteine ​​mit einer Kombination aus zwei orthogonal Methoden: Hefe-Zwei-Hybrid von einem High-Throughput-Assay Interaktion in Säugerzellen namens HT-GPCA gefolgt.

Zusammenfassung

Erhebliche Anstrengungen wurden versammelt, um groß angelegte umfassende Protein-Protein-Interaktion Netzwerk Karten zu erzeugen. Dies ist maßgeblich auf die Erreger-Wirt-Beziehungen verstehen und wurde im Wesentlichen durch genetische Screenings in Hefe-Zwei-Hybrid-Systemen durchgeführt. Die jüngste Verbesserung der Protein-Protein-Wechselwirkung Erfassung durch einen Gaussia Luciferase-basierte Fragment Komplementierung Assay bietet nun die Möglichkeit, integrative Ansätze notwendig vergleichende interactomic entwickeln konsequent vergleichen Interaktion Profile von Proteinen aus verschiedenen Erreger Stammvarianten gegen einen gemeinsamen Satz von zellulären Faktoren.

Dieses Dokument konzentriert sich insbesondere auf die Nützlichkeit der Kombination von zwei orthogonalen Methoden zur Protein-Protein-Wechselwirkung Datensätzen zu generieren: Hefe Zwei-Hybrid (Y2H) und eine neue Assays mit hohem Durchsatz Gaussia princeps Protein Komplementations-Assay (HT-GPCA) in Säugetierzellen durchgeführt. nt "> Eine groß angelegte Identifizierung zellulärer Partner eines Erregers Protein wird durch Kreuzen-basierten Hefe-Zwei-Hybrid-Screenings von cDNA-Bibliotheken mit mehreren Erreger Stammvarianten durchgeführt. Eine Teilmenge der interagierenden Partner auf einem High-Vertrauen statistischen Scoring ausgewählt ist weiter validiert in Säugerzellen für paarweisen Interaktionen mit dem ganze Reihe von Varianten Erreger Proteine ​​mit HT-GPCA. Diese Kombination aus zwei komplementären Methoden verbessert die Robustheit der Interaktion Datenmenge und ermöglicht die Durchführung einer strengen vergleichende Analyse Interaktion. Solche vergleichende Interactomics bilden eine zuverlässige und leistungsstarke Strategie zu entziffern irgendwelche Erreger-Wirt-Wechselspiel.

Einleitung

Die zunehmende Menge an Daten gesammelt, um Protein-Protein-Wechselwirkung Karten erzeugen öffnet Perspektiven weiter zu verstehen Erreger Infektionen. Als globales Verständnis von pathogenen Infektionen beginnt sich abzuzeichnen, bietet es Zugriff auf den Bereich von Störungen durch Erreger Proteine ​​induziert beim Anschließen des menschlichen Proteoms ^1. Es bietet damit einen Weg zu verstehen, wie Krankheitserreger die Wirtszelle Maschinen manipulieren. Insbesondere ergab die Zuordnung von mehreren viralen-Wirt-Interaktion Netzwerke dass virale Proteine ​​bevorzugt Zielrechner Proteine, die stark in das Mobilfunknetz angeschlossen sind (Hubs), oder die von zentraler Bedeutung für viele Pfade in einem Netzwerk (Engpässe Proteine) ^2-4 sind. Diese Wechselwirkungen können Viren auf wichtige zelluläre Prozesse zu manipulieren, was instrumental zu replizieren und infektiöse Nachkommen. Vergleichende Wechselwirkungen Mapping wurden kürzlich auf verwandten Viren mit dem Ziel, Informationen bezüglich extrahieren durchgeführtPathogenese ^4. Darüber hinaus haben Studien der Wirt-Erreger-Interaktionen Landschaft zu viele Krankheitserreger ⁵ erweitert. Die gezielte Zellfaktoren Identifizierung bietet Einblicke in die Strategien, die von Pathogenen verwendet, um Zellen zu infizieren und ermöglicht den Nachweis von pathogenen Potential Marker.

Die Hefe-Zwei-Hybrid-System ist die beliebteste Methode, um binäre Interaktionen zu identifizieren, da genetisches Screening ist eine effiziente und empfindliches Werkzeug für High-Throughput-Mapping von Protein-Protein-Interaktionen. Der hier vorgeschlagene Ansatz weiter verbessert einzelnen Y2H Screenings durch die Beurteilung ein Protein aus mehreren Krankheitserregern Stammvarianten, um so den Zugang zu einem vergleichenden Überblick über Pathogen-Wirt-Protein-Protein-Interaktionen. Darüber hinaus liegt eine große Einschränkung der Hefe-Zwei-Hybrid-Screening in einem hohen falsch-negative Rate, da sie etwa 20% der gesamten Wechselwirkungen ⁶ erholt. Dies bedeutet, dass Interaktionen mit nur einer Teilmenge von patho erkanntgens Varianten könnten Erkennung mit den anderen entgangen sein. Daher werden die einzelnen Partner, die aus allen Zwei-Hybrid-Screenings weiter für die Interaktion mit dem kompletten Sortiment der untersuchten Stämme herausgefordert, vergleichende Interaktion Datensätzen. Da wurde gezeigt, dass die Kombination verschiedener Methoden stark erhöht die Robustheit von Protein-Protein-Wechselwirkung Datensätze ⁷ wird diese Validierung in Säugetierzellen durch ein neu entwickeltes Protein-Fragment Komplementierung Assay genannt HT-GPCA ⁸ durchgeführt. Diese Zell-basierte System ermöglicht die Detektion von Protein-Interaktionen durch Komplementierung des Gaussia princeps aufgeteilt Luciferase und wurde entwickelt, um die Kompatibilität mit einem Hochdurchsatz-Format. Dank seiner Lumineszenz-basierten Technologie und deren geringem Hintergrundrauschen mit anderen Fluoreszenz-basierten Assay verglichen, zeigt HT-GPCA eine auffallend hohe Empfindlichkeit.

Insgesamt stellt dieser Ansatz eine effizienteWerkzeug, um eine umfassende Kartierung von Wirt-Pathogen-Zwischenspiele, die den ersten Schritt in Richtung einer globalen Verständnis der Wirtszelle Entführung repräsentiert.

Protokoll

1. Hefe-Zwei-Hybrid-Screenings

1. Nehmen Sie die folgenden erforderlichen Lösungen:
   1. Komplette Synthetic Drop Out (SD): Man löst 26,7 g minimal SD Basis mit Glucose in 1 l Wasser. 2 g der Aminosäure-Mischung wie folgt hergestellt: 2 g Adenin hemisulfate, 2 g Arginin HCl, 2 g Histidin HCl, 2 g Isoleucin, 4 g Leucin, 2 g Lysin HCl, 2 g Methionin, Phenylalanin 3 g, 2 g L -Serin, 2 g L-Threonin, 3 g Tryptophan, Tyrosin 2 g, 1,2 g Uracil, 9 g Valin.
   2. Selective Drop Out SD-L/-W/-H: SD enthält alle essentiellen Aminosäuren außer den angegebenen (-L:-Leucin;-W:-Tryptophan;-H:-Histidin).
   3. YPGLU: Für 1 L, Gewicht 10 g Hefeextrakt, 10 g Bacto-Pepton und 20 g Glucose. Komplett mit 25 g Bactoagar für feste Medien.
   4. YCM: Wie YPGLU, aber pH-Wert auf 4,5 eingestellt.
2. Passende und Verbreitung
   1. Verwendung eingefroren Aliquots von pre-Transformationed Hefestamm Y187 (Paarungstyp α), die eine cDNA-Bibliothek in pACT2 geklont. Überprüfen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen durch Ausplattieren serielle Verdünnungen auf SD-L-Platten.
   2. Klonen Sie die Erreger in ORF pGBKT7 Vektor, und verwandeln das rekombinante Plasmid mit einem Standard-Verfahren in Hefestamm AH109 (Paarungstyp a).
   3. Spread-pGBKT7 transformierten AH109 Hefe auf SD-W Platten. Inkubieren mindestens zwei Tage 30 ° C in einem befeuchteten Inkubator. Die Platten können bei 4 ° C bis zum Zwei-Hybrid-Screening gespeichert werden.
   4. Mit 3-Aminotriazol (3-AT), einem kompetitiven Inhibitor des HIS3 Enzym, um das Potenzial selbst Transaktivierung des HIS3 Reportergens durch die Erreger 'Proteinen entgegenwirken. Führen Sie eine automatische Aktivierung Test durch die Bestimmung der Konzentration von 3-AT, die das Wachstum von pGBKT7-transformierten Hefezellen verhindert auf SD-W/-H Platten.
   5. Seed 30 ml SD-W mit wenigen Kolonien pGBKT7 transformierten AH109. Inkubation 30 h bei 30 ° C mit einer Drehung.
   6. Seed 200 ml SD-W mit 30 mlder AH109 Kulturen. Inkubation mit Drehung um 20 h bei 30 ° C.
   7. Aufgetaut cDNA-transformierten Y187 in 20 ml YPGLU, Inkubation 10 min bei 30 ° C unter Rotation inkubiert.
   8. Zentrifuge ein Volumen von pGBKT7 transformierten AH109 Kultur entsprechend einer äquivalenten Menge von lebensfähigen Hefezellen Y187 für 5 min bei 3500 UpM bei 20 ° C. Vorsichtig zurückziehen den Überstand und Pellet in 10 ml YPGLU.
   9. Mischen Sie die resuspendierten AH109 Hefe mit Y187 enthaltende Bibliothek. Übertragen in einer 50 ml Tube. Zentrifuge für 5 min bei 3.500 rpm bei 20 ° C, vorsichtig zurückziehen Überstand (fragile Pellet).
   10. Pellet in YPGLU um insgesamt 1,5 ml.
   11. Spread-Hefe auf 3 YCM-Agar 150 mm Platten, 0,5 ml / Platte. Inkubation 4,5 h bei 30 ° C.
   12. Sammeln gepaart Hefe YCM Platten durch Abkratzen mit einem Rechen Glas in 10 ml SD-L/-W/-H. Spülen Sie die Platten zweimal mit 5 ml Medium SD-L/-W/-H und Pool.
   13. Zentrifuge 5 min bei 3.500 rpm, 20° C. Überstand verwerfen und Pellet resuspendieren die Hefe in 5 ml Medium SD-L/-W/-H.
   14. Verbreiten gepaart Hefe auf 10 Platten (0,5 ml / Platte) von SD-L/-W/-H Agar mit der entsprechenden Konzentration von 3-Aminotriazol (3-AT) in der Auto-Aktivierung Test bestimmt ergänzt. Inkubation bei 30 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre für 6-10 Tage.
   15. Bestimmen Sie die diploid (2n)-Rate um Paarungseffizienz durch die Verbreitung 250 ul serielle Verdünnungen (10 ^-4 bis 10 ^-6) der gesteckten Hefesuspension auf SD-L/-W Platten bewerten. Platten bei 30 ° C für zwei Tage. Graf Kolonien auf SD-L/-W gewachsen, und daraus die gesamte diploide Zahl in der anfänglichen Volumen gepaart Hefe. Melden diploide Zahl lebensfähiger Bibliothek enthaltende Hefe, um den diploiden zu berechnen. Es sollte reichen um 10-25%.
   16. 6-10 Tage nach Inkubation bei 30 ° C, holen gepaart Hefekolonien in frischen SD-L/-W/-H + 3-AT-Platten. [Tipp: Um die Hefe in einem Schema von 8Gassen von 12 Wells Wiedergabe eines 96-Well-Platte, so dass es einfacher sein wird später für die Sequenzierung]. Lassen Hefekolonien wachsen für 4-5 Tage bei 30 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre.
3. Screening von his3 positive Klone durch PCR und Sequenzierung
   Das Ziel ist, die PCR zu amplifizieren ORF in den pACT2 Träger Hefekolonien auf selektiven Platten gezüchtet SD-L/-H/-W enthalten.
   1. Legen Sie eine 96-Well-PCR-Platte auf Eis.
   2. Um Hefezellen lysieren, fügen Sie 50 ul pro Well einer Zymolase 20T Lösung (2,5 mg / ml in 10 mM HEPES-Puffer pH 7.7).
   3. Vorsichtig resuspendieren eine Kolonie pro Vertiefung.
   4. Inkubieren 15 min bei 37 ° C und 15 min bei 95 ° C.
   5. Setzen Sie die Platte wieder auf Eis. In 50 ul destilliertem Wasser pro Vertiefung. Gut mischen durch Auf-und Abpipettieren.
   6. Zentrifuge für 5 min bei 3.500 rpm und 4 ° C.
   7. PCR amplifizieren 10 ul eines Einsatzes unter Verwendung der Primer Annealing beiden Seiten des ORF von cDNA in pACT2 abgeleitete Vektoren zu detektieren. Das Protokoll ist gIven zur Amplifikation von 96 lysierte Hefe Kolonien mit dem ExTaq Polymerase. Bereiten Sie die folgende Mischung: 525 ul 10x ExTaq Puffer, 420 ul dNTPs Mix (2,5 mm), 10,5 ul Forward Primer (1 ug / ul), 10,5 ul Reverse Primer (1 ug / ul), 31,5 ul ExTaq (5 U / ul ) und 3202,5 ​​ul H ₂ 0. Verteilen Sie 40 ul der Mischung pro Vertiefung in einer 96-Well PCR-Platte. In 10 ul lysierte Hefe pro Vertiefung. Für die Amplifikation wie folgt: 94 ° C für 3 min, dann 35 Zyklen bei 94 ° C für 30 sec, 60 ° C für 1 min, 72 ° C für 4 min, und am Ende mit 72 ° C für 7 min. Lauf 3 ul der PCR-Produkte auf einem 1,2% Agarosegel der PCR-positive Klone zu detektieren. Beachten Sie, dass mit pre-cast 96 gut Agarosegelen empfohlen.
      [Tipp: Platte kann bei -20 ° C für ein paar Monate gelagert werden und für neue PCR wieder verwendet]
   8. Sequence die PCR-Fragmente aus HIS3 positive Klone isoliert. Führen Sie eine BLAST-Analyse der zellulären ORF zu identifizieren. Low-Vertrauen Ausrichtungen (E & Wertgt; 10 ^-10, Identität <80%, Peptidlänge <20 Aminosäuren) werden verworfen sowie frameshifted und vorzeitiges Stopp-Codon Sequenzen enthält.

2. Matrix Gebäude für HT-GPCA

HT-GPCA eine Säugerzelle-basierten Test, bei dem beide Erreger und Wirt transient exprimierte Proteine ​​fusioniert sind, um komplementäre Fragmente des geteilten Gaussia princeps Luciferase. Nach Interaktion der Partner wird dieses Enzym rekonstituiert so das Maß der Enzymaktivität. Die Wechselwirkung Intensität wird so von einer normalisierten Lumineszenz-Wert (siehe unten und Abbildung 1) abgeleitet

4. Auswahl der Wirtszelle Partner
   1. Wählen Proteine, die mehr als drei Mal in den Y2H Screenings zur weiteren Validierung in Säugerzellen identifiziert werden, um die Datenmenge Vertrauen ⁹ erhöhen.
   2. In bekannten Interaktionspartner der Erreger Proteine ​​als positive Kontrollen.
5. Übertragen in HT-GPCA kompatiblen Vektoren
   1. Klonen jeden Erreger Protein ORF in einer pSPICA-N2 Vektor um Erreger Proteine ​​mit Aminosäuren 110-185 der humanisierten Gaussia princeps Luciferase an ihrem N-Terminus (GL2-Pathogen-Protein-Fusionen) fusioniert zu generieren.
   2. PCR amplifizieren zelluläre Protein ORF direkt von den Y2H positive Klone oder aus anderen Quellen ORF (Human ORFeome http://horfdb.dfci.harvard.edu/ ) und sie in pSPICA-N1-Vektoren, Proteine ​​am N-Terminus fusioniert mit erzeugen die Aminosäuren 18 bis 109 der humanisierte Gaussia princeps Luciferase (GL1-Host-Protein-Fusionen).
      [Tipp: Für großangelegte Klonen, die Gateway-Klonen wird empfohlen. In diesem Fall für die PCR-Amplifikation, verwenden Primer entwickelt, um Gateway-kompatible Websites enthalten].
   3. Sequence alle Expressionsvektoren. Sequenzen des pSPICA-N1-N2 und pSPICAkönnen in Bezug 8 gefunden werden.

Beachten Sie, dass Plasmidkonstrukte umgekehrt werden kann, dh Erreger Proteine ​​in pSPICA-N1-und Host-Protein in pSPICA-N2.

3. High-Throughput Gaussia princeps Luciferase-Based Protein Komplementierung Assay (HT-GPCA)

6. Zelltransfektion
   1. Seed 293T-Zellen bei 350.000 Zellen / ml von DMEM mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), die kein Antibiotikum. Verteilen Sie 100 ul / Vertiefung in sterile weiße Kultur Platten. Nicht mehr als 10 Platten in einem einzigen Experiment. Lassen Zellen für 24 h wachsen bei 37 ° C mit 5% CO _2.
      [Tip:. Da die pSPICA Plasmide einen SV40 enthalten, ermöglicht die Verwendung von 293T-Zellen, die die Replikation in transfizierten Zellen und führt so zu Überexpression der beiden Luciferase-Fragmente]
   2. Am folgenden Tag, transfizierbaren Zellen unter Verwendung eines geeigneten Transfektionsprotokoll. Beachten Sie, dass für bestimmte Transfektionsreagenzien, die nuahl von Zellen ausgesät müssen möglicherweise angepasst werden. Mit 100 ng pro Vertiefung sowohl der Erreger und Wirt ORF Plasmidkonstrukte. Co-Transfektion von 10 ng pro Vertiefung einer von CMV-Glühwürmchenluciferase Plasmid für Transfektionseffizienz zu normalisieren. Jeder Punkt wird in dreifacher Ausführung getestet.
      [Tip:. DNA Mischungen können den Tag vor der Transfektion durchgeführt werden und bei -20 ° C mit Klebedichtungen]
   3. Übertragen Transfektionsgemisch zu den Platten kultivierten 293T-Zellen. Seien Sie vorsichtig, um sanft die Hinterlegung der DNA-Gemisch auf die Zellen, wie 293T nicht stark haftend und leicht aus dem Boden des Bohrlochs zu lösen. Inkubation in einer Zellkultur-Inkubator für 24-30 Stunden bei 37 ° C mit 5% CO _2.

7. Zelllyse und Gaussia Luciferase Dosierung
   1. Waschen der Zellen mit PBS (100 ul / well). In 40 ul 1X Renilla Lysepuffer. Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur unter Rühren.
   2. Sparen Sie 10 ul Zelllysaten in einem anderen weißen plate für die nachfolgende Dosis der Firefly-Luciferase-Aktivität. Lagerung bei 4 ° C oder alternativ bei -20 ° C mit Dichtung.
   3. Messen Sie die Gaussia Aktivität auf den verbleibenden 30 ul Zelllysaten durch Zugabe von 100 ul Renilla Luciferase Assay-Reagenz und Zählen Lumineszenz für 10 sec mit einem Luminometer. Dosierung einer 96-Well-Platte dauert etwa eine halbe Stunde. Führen Sie eine Messung mit frischem Zellextrakten seit Einfrieren oder Langzeitlagerung Interaktion vermittelte Gaussia Aktivität beeinflussen können.

8. Messung der Firefly-Aktivität
   1. Messen Sie die Firefly-Aktivität auf die gespeicherte 10 ul Zelllysaten durch Zugabe von 50 ul Firefly Luciferase Assay-Reagenz und Zählen Lumineszenz für 10 sec. Dosierung einer 96-Well-Platte dauert etwa eine halbe Stunde. [Tipp: Die Dosierung der Firefly Luciferase durchgeführt am Tag nach der auf gefrorenen Lysate werden.]

9. NLR Berechnungen
   1. Für jede Interaktion, wird das Verhältnis zwischen Gaussia Luciferaseaktivität und Firefly Luciferaseaktivität um eine normalisierte Gaussia Lumineszenz Wert unter Berücksichtigung Transfektionseffizienz und die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten. Berechnen Sie den Mittelwert der dreifach.
   2. Um die Interaktion zu überwachen, schätzen eine normalisierte Lumineszenz Ratio (NLR) für jedes Pathogen-Wirt-Paar. Um dies zu tun, teilen die normierte Gaussia Lumineszenz-Aktivität in Anwesenheit von Erreger und Wirt-Proteine ​​durch die Summe der Aktivitäten in Kontroll-Wells gemessen (Abbildung 1 von 8 Referenz angepasst) erkannt. Die NLR cut-off Wert für positive Wechselwirkungen wurde geschätzt auf rund 3,5 ⁸ sein.

10. Datenanalyse
    1. Führen hierarchisches Clustering unter Verwendung der R-Statistik-Paket. Erstens, die Gruppe NLR Daten in Kategorien, berechnen dann eine Interaktion mit Dendrogramms die komplette Verknüpfung Verfahren. Visualisieren Sie dieseDendrogram mit JavaTreeView ^10. Berechnen Sie den Abstand zwischen Interaktion Dendrogramm und phylogenetische Baum mit einem Pearson Korrelationskoeffizient.
    2. Um die Interaktion Netzwerke generieren, wählen Sie die positiven Wechselwirkungen von der HT-GPCA Datenmenge und verwenden Sie die Software Cytoscape ^1. Extrahieren Sie den Grad der Host-Proteine ​​und zeichnen ihre Verteilung auf die lokale Dynamik Netzwerk zugreifen. Host-Erreger Netzwerke können an den Host interactome überlagert werden, um eine Beurteilung der globalen Auswirkungen der Erreger Proteine ​​in den Host zellulären Netzwerk bereitzustellen.
    3. Entpacken Sie die GO (Gene Ontology) Begriffe mit den gezielten zellulären Faktoren mit dem DAVID Bioinformatik Datenbank ^12, um die funktionelle Bereicherung des Datensatzes beurteilen verbunden.

Ergebnisse

Eine große Stärke von HT-GPCA liegt in seiner hohen Empfindlichkeit, durch die Bewertung der falsch-positiven und falsch negativen Ergebnisse für die HPV E2-Protein in Abbildung 2 (nach Lit. 13) dargestellt. Um die falsch-negative Rate zu bestimmen, wurden von bekannten Wechselwirkungen von HPV16 E2 von HT-GPCA (2A) beurteilt. Vier von 18 Wechselwirkungen wurden nicht wiederhergestellt (entspricht einer 22% falsch-negative Rate). Die falsch positive Interaktionen wurden gemessen, um ...

Diskussion

Unabhängig, Hefe-Zwei-Hybrid-und Säugetierzellen Interaktionsassays wie GST-Pulldown, LUMIER oder Mappit, haben sich als effektive Werkzeuge, um Protein-Protein-Wechselwirkungen zu erkennen sein, aber durch die hohe Rate der falsch-positiven und falsch-negativen beschränkt Wechselwirkungen mit diesen Techniken ¹⁵ verbunden. Darüber hinaus ist Beweis wächst, dass die Kombination von orthogonal Verfahren erhöht die Zuverlässigkeit der erhaltenen Wechselwirkung Datensatz ^7. Die jüngste Entwick...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Yeast strains	Clontech
Minimal SD base	US biological	D9500
Amino acids	Sigma
3-amino-1,2,4-Triazole (3-AT)	Acros organics	264571000
Zymolase	Seikagaku	120491
DMEM	Gibco-Life Technologies	31966
Fetal bovine serum	BioWest	S1810
Phosphate buffer Saline (PBS)	Gibco-Life Technologies	14190
Penicillin-Streptomycin	Gibco-Life Technologies	15140
Trypsin-EDTA	Gibco-Life Technologies	25300
Renilla luciferase assay	Promega	E2820
White culture plate	Greiner Bio-One	655083
96-wellPCR plates	4titude	4t-i0730/C
Incubator (30 °C)	Memmert
Incubator (37 °C)	Heraeus
Luminometer	Berthold	Centro XS-LB 960