腺病毒转导朴素的CD4 T细胞调节性T细胞分化研究

摘要

腺病毒基因转移到幼稚的CD4 T细胞与柯萨奇腺病毒受体的转基因表达，使调节性T细胞分化的分子分析在体外。

摘要

调节性T细胞（Treg细胞）是必不可少的，提供自我以及某些外来抗原的免疫耐受。调节性T细胞可产生从幼稚的CD4 T细胞在体外与T细胞受体和TGF-β和IL-2的存在下的共刺激。承担巨大的潜力，未来的治疗，但是，分子和信号通路，控制分化在很大程度上是未知。

原发性T细胞可以通过操纵异位基因表达，但常用的方法没有针对前最重要的幼稚状态的T细胞抗原识别初级。在这里，我们提供了一个协议异位基因表达在幼稚的CD4 T细胞在体外诱导调节性T细胞的分化之前。它适用于复制缺陷型腺病毒转导和解释它的产生和生产。腺病毒可以占用大量插入（最多7 KB），并可以配备促销员实现高瞬态曝光过度在T细胞ression。它有效传导天真的小鼠T细胞，如果他们表达的转基因柯萨奇腺病毒受体（CAR）。重要的是，感染后T细胞仍然幼稚（CD44，CD62L ^的高点 ）和休息（CD25 ^- CD69 ^{- ），}并且可以被激活和调节性T细胞分化成类似的非感染的细胞。因此，该方法从一开始使CD4 + T细胞分化的操纵。确保异位基因表达已经到位，当早期信号事件的初始TCR刺激诱导细胞的变化，最终导致Treg细胞分化。

引言

调节性T细胞是维持免疫耐受，抑制过度的免疫反应的关键。调节性T细胞抑制T细胞活化的旁观者。因此，调节性T细胞的消融导致致命的自身免疫和自我毁灭的驱动由活化的T细胞^1。调节性T细胞在胸腺中发展CD4单阳性前体的阴性选择过程中，但他们也可以从幼稚后，低剂量的抗原刺激的CD4 + T细胞具有次优的协同刺激^1,2分化的周围。胸腺调节性T细胞似乎抑制组织对自身抗原的自身免疫性疾病，而周边有牵连的调节性T细胞在肠道或肺部提供宽容。这些诱导Tregs的有效阻止T细胞活化后在粘膜外来抗原的识别，包括环境抗原的食物和空气，共生细菌，过敏原^3,4。此外，调节性T细胞是关键，建立孕产妇胎儿肽的耐受性^和预先发泄移植物抗宿主病^。与此同时，调节性T细胞介导不良影响肿瘤细胞的免疫监视^7,8衰减。调节性T细胞的共同特征，是指定的子集转录因子Foxp3，叉头域的转录因子，是必要的，足以赋予Treg细胞功能^9,10的表达。一些信号转导通路，可诱导Foxp3的表达是众所周知的。然而，分子的过程控制，调节，或调节调节性T细胞分化的T细胞受体触发的了解较少。

调节性T细胞可以非常有效地在体外诱导幼稚的CD4 + T细胞与抗-CD3和抗CD28抗体的存在下，TGF-β和IL-2 ¹¹通过刺激。由于新兴的调节性T细胞在体内的功能，促进调节性T细胞分化的分子操纵承担巨大的潜力，未来的therapi上课，例如，治疗哮喘，克罗恩病，移植^11,12。相反，治疗调制阻止Treg细胞分化的分子可能在未来的肿瘤患者的综合治疗方法中受益。

一直在体外诱导分化实验的描述都与T细胞亚群分化的分子变化。在此刻，实验尝试搜索或基因产物的屏幕控制T细胞分化异位基因表达的最常用的方法失败，在幼稚T细胞的事实而受到阻碍。例如，电穿孔，逆转录病毒转导是唯一有效的活化的T细胞中。与此相反的最初预期的慢病毒转导，这是通常在静息细胞中有效，需要预活化幼稚T细胞的细胞因子是^13。此外，在电穿孔过程中的cDNA或mRNA的转移涉及质膜的去极化，其本身赋予T细胞活化的功能，甚至可能动员的Ca ^{2 +}信号 并且激活NFAT蛋白（未发表的观察和参考文献^14）。类似地，对于逆转录病毒转导，幼稚T细胞被激活为18 - 40小时。在这段时间内，在细胞分裂过程中，核膜破裂的发生，并允许为随后的基因组整合的逆转录病毒载体^15。因此，这些方法是不能够解决早期的分子调控初始T细胞与抗原相遇，这是辅助性T细胞分化的决定性阶段。

腺病毒转导是已知的，赋予短暂异位基因表达的人类细胞类型中表达的人柯萨奇腺病毒受体（CAR）的一些。进行没有要求细胞活化或细胞周期进程。表面表达的CAR是必不可少的有效的病毒附件和内在，发现转基因表达的截断版本CARΔ1的T细胞特异性启动子下使小鼠胸腺细胞和T细胞受到腺病毒感染^16。重要的是，转基因不改变胸腺细胞发育或在体外分化幼稚的CD4 T细胞分成不同的子集（数据未显示;文献^17）。以前使用的腺病毒介导的转导T细胞过表达^17,18和击倒方法^19,20。的转基因T细胞可被纯化从市售的DO11.10的TG;：CARΔ1的TG（Taconic公司，Inc。和参考文献^17）。重要的是，腺病毒转导允许在幼稚T细胞中感兴趣的基因的高表达而诱导激活的明显迹象。 T细胞保持天真（CD44 ^低 ，CD62L ^高 ），休息（CD25 ^- ，CD69 ^{- ）}后infecti和可以被激活和调节性T细胞分化成类似的非感染的细胞。

腺病毒介导的生产可以实现HEK293A细胞转染后，腺病毒载体（图1）。这些质粒通常含有E1和E3基因删除，以使重组病毒无法复制的²¹人5型腺病毒基因组。 HEK293A细胞补充不足，因为他们已经通过稳定整合剪切腺病毒²²永生复制。由于腺病毒载体是大的（〜40 kb的），因此不适合于传统的限制性内切酶介导的克隆，我们采用的网关系统。感兴趣的基因的最初克隆到一个较小的输入矢量，从它可以很容易地转移到腺病毒的目标向量通过拉姆达重组反应^{（LR）23。}我们构建了pCAGAdDu载体相结合的的CAG启动（鸡肌动蛋白启动子和CMV增强）的表达盒含有LR网站侧翼原核CCDB选择标记^24。此表达盒的一个内部核糖体进入位点（IRES）元件，允许共表达真核感染标记增强型绿色荧光蛋白（EGFP），这是含有牛生长激素多聚（A）信号序列融合到融合。我们选择的CAG顺式调控序列，由于原型的CMV启动子被认为是高度活化相关的，因此不利于在幼稚T细胞的基因表达。

在这里，我们提供了一个协议，用于高效在体外调节性T细胞的分化和幼稚的CD4 T细胞转导方法，无需激活（图2）。该方法使异位基因表达或击倒前面的CD4 T细胞分化的幼稚状态。它允许测试一个overexpresse的效果d基因的兴趣在早期信号事件在初始TCR刺激，直到T细胞亚群的承诺。我们的验证实验也提供了基础，建立类似的腺病毒应用程序在其他T细胞亚群，如Th1细胞和Th2，TH9，Th17细胞，TH22，或TFH细胞的分化。

研究方案

1。感兴趣的基因的克隆到入门载体

1. 感兴趣的基因的克隆到一个条目载体。 PCR扩增的基因，然后通过平末端连接到一个拓扑异构酶耦合向量（ 例如载体pENTR / D-TOPO）或限制性内切酶介导的克隆可以用于此过程。

2。感兴趣的基因转移到的pCAGAdDu目标向量

1. 从输入矢量的兴趣基因转移到目标向量由LR重组（ 例如网关LR克隆酶II酶混合物）。这将创建的腺病毒表达载体（图1）。
2. 10微克线性化的腺病毒表达载体中的PacI位限制性内切酶消化，沉淀DNA，并重新悬浮在水中的浓度为3微克每100微升。线性化会释放病毒的反向重复序列（ITR），复制和包壳的V所必需的到病毒颗粒中的iral DNA。

3。生成的主要病毒裂解液

1. 种子1×10 ⁵ HEK293A细胞在2ml的细胞培养基（DMEM，10％胎牛血清，5％PenStrep）以及一个6孔板中于室温孵育6 - 14小时，在37℃下在10％的CO ₂培养箱，让他们坚持。然后，细胞应在约50％汇合。
2. 脂质体：转让6微升jetPEI转染试剂50μM的氯化钠，涡简要成94微升。的混合溶液添加至100μl，线性化的腺病毒载体在涡旋和15 - 30分钟，在室温下孵育当前转染混合物。

执行以下步骤，在适当的生物安全条件，腺病毒感染！

3. HEK293A细胞以及含有分配溶液的溶液，并于室温孵育在37℃和10％的CO _2。当使用荧光标记，评估transfe的CTION效率视觉后12 - 36小时，使用倒置荧光显微镜。添加0.5毫升的新鲜培养基，每3天。
4. 细胞病变效应（CPE），这是放大和圆润的细胞开始分离领域具有光或荧光显微镜检查，每2 - 3天。这是表示高效的病毒的产生。一旦发生更广泛的区域CPE（图3），它会需要24 - 72小时之前，所有的细胞被感染。
5. 当所有的细胞出现CPE，但前整体支队细胞时，细胞分离轻柔吹打和转让细胞上清（SN，3 - 5毫升），15毫升聚苯乙烯管。
6. 冻结细胞在干冰上15 - 20分钟的SN和快速解冻，在37℃后，破裂的细胞。重复冷冻和解冻周期（F / TC）两次以上。保持主病毒裂解液在冰上，在一天之内的使用，或冻结，在-80℃下长期存储。任何的其它F/ TC会降低病毒滴度30 - 50％。

4。病毒扩增

1. 种子和HEK293A细胞成长14厘米的组织培养皿90％汇合。
2. 感染细胞的主要病毒裂解液（1.5 - 2.5毫升）的一半，室温孵育至少36小时。几乎所有的细胞被感染，然后，通过荧光显微镜观察，可确定。对于已经放大（ 即较为集中）的病毒库存再度放大，感染HEK293A感染复数（MOI）为50（见6.3）。
3. 当所有的人都显示CPE，但支队前，应收获细胞。高效的病毒产量达到这种状态是在感染后48小时内。 （如果需要长达一个星期，考虑另一轮扩增通过增加用于4.2中描述感染腺病毒库存量。）
4. 轻柔吹打和转移细胞和SN 50毫升聚苯乙烯管分离细胞。自旋细胞以300×g，10分钟，在4℃下
5. 取出的SN和悬浮颗粒介质或SN（ 约 1毫升）在合适的音量。
6. 执行3 F / TC破碎细胞并在4℃下以800×g离心15分钟脱掉的SN包含该病毒颗粒（ 即浓缩的病毒溶胞产物），和病毒裂解物等分将其存储于-80℃。

5。病毒滴度测定

1. 种子10 ⁵ A549细胞，每孔为5个孔的12孔板，1毫升培养基，让细胞附着6小时。
2. 使用1微升浓腺病毒（冰解冻）进行连续稀释介质（1:5000 1:10000 1:50000 1:100000），每加10微升。留一井未受感染的调整浇注流式细胞。
3. 36小时后，脱下的SN，用PBS及分离细胞（ 如胰蛋白酶）。对于生物危害的预防措施，建议修复C在100μl的PBS中的4％多聚甲醛在室温和10分钟，用PBS洗涤一次，细胞l。
4. 执行一个感染标记表达的流式细胞仪分析。剧情μl病毒裂解应用于对感染的细胞的绝对数量（图4）。确定感染的线性范围内，并从标准曲线中计算出每毫升未稀释的病毒滴度在用x = 1,000微升的线性范围。

6。 T细胞病毒感染

1. 隔离天真/静息CD4 + T细胞DO11.10 TG，TGCARΔ1小鼠使用MACS（幼稚的CD4 + T细胞分离试剂盒II）或FACS分类（CD4 + CD25-CD62L + CD44-）。
2. 对于小规模的实验中，吸液管适当体积的病毒的溶胞产物，实现到一个良好的96孔圆底板的MOI为50。
3. 最多可添加4×10 ⁵个T细胞，在最终体积为50μl感染T细胞的培养基（RPMI1640，10％胎牛血清，5％PenStrep，5％NaPyruvate，1×NEAA，1个MEM本质维生素，1个L-谷氨酰胺，1:25万巯基乙醇，10毫米HEPES）。
   例如：
   MOI为50，应使用3×10 ⁵ T细胞感染; 病毒滴度为3×10 ⁹毫升^-1
   病毒量= MOI x厚的细胞数/病毒滴度= 50×（3×10 ^{5）/（3×10 9}毫升^-1）=0.005毫升

注：较大的细胞数量，规模达宽松杯（可达3毫升，每管）165微升每10 ⁶幼稚T细胞的感染量在聚苯乙烯管使用MOI为50的感染。

4. ，在5％CO ₂培养箱_中 ，在37℃下孵育90分钟。
5. 降速细胞在300 XG在室温下5分钟，起飞SN，在200μLPBS重悬。再次离心，脱下SN。

（可选：细胞可能被再次洗涤更有效地清除病毒）

6. 悬浮细胞加入200μlT细胞介质无刺激抗体和无IL-2或其它细胞因子，休息40小时，在37℃下，在5％CO ₂培养箱_中 ，以允许激活之前的感兴趣的基因的表达。

7。 T细胞活化和极化

1. 移液管取一定体积的抗-CD3和抗CD28耦合等于成一个小的试剂杯的细胞数（ 例如，4×10 ^5）的有孔玻璃珠，加入10倍体积的PBS，并把它们放在一个磁铁2分钟。起飞上清，重悬珠200微升偏光介质（调节性T细胞培养基+ 1 ng / ml的TGF-β，100 U / ml的IL-2）。

注意：使用涂有抗CD28和抗CD3抗体的组织培养皿的细胞，也可以激活，或者在一个DO11.10 T细胞受体特异性的方式，使用脉冲照射的BALB / c小鼠的脾细胞与卵清蛋白的323-339肽抗原。

2. 离心机e为休息的细胞和以前一样，取下SN和重悬细胞，在200微升的偏振介质中含有抗-CD3和抗CD28抗体偶联有孔玻璃珠。不改变培养基，在5％CO ₂培养箱_中在37℃下孵育72小时。

8。 T细胞固定和染色流式细胞仪

1. 洗涤细胞：细胞离心5分钟，在室温下在300 XG，脱下SN，在200μLPBS重悬。再次离心，脱下SN。执行以下相应的洗涤步骤。
2. 在100μl可固定死细胞染色溶液重悬细胞，并温育30分钟，在4℃。
3. 洗涤细胞，重新悬浮于100μlPBS中，加入100微升4％多聚甲醛的PBS中孵育15分钟，在RT。
4. 洗涤细胞，重悬在200μl冰冷的70％甲醇的PBS，并在冰上孵育30分钟。

注：细胞可以治疗无生物危害的预防措施，从现在开始！

5. 准备60μL主混合60微升PBS + 10微克/毫升块（FC-抗FCR3阻断非特异性结合）。洗涤细胞，重悬在40μl的PBS +抗FCR3，并在室温孵育15分钟。
6. 加入20μlPBS +抗FCR3含有1微克PE耦合抗Foxp3抗体，拌匀和孵化，在4℃过夜。
7. 在PBS中洗涤细胞两次，流式细胞仪分析细胞。

结果

病毒生产

新一代的病毒滴度高，在初级生产病毒或病毒扩增HEK293A细胞收获的时机是至关重要的。代表荧光和相位与病毒生产的视觉迹象的对比度的图像如图3所示。 CPE观察转染的HEK293A细胞与控制pCAGAdDu向量没有插入后10天。 CPE的特点是外观方面扩大和圆形细胞开始分离，并表现出高表达的感染标记GFP。 CPE的程度是表示高效的病毒的产生。细胞培养板，显示类似CPE可...

讨论

病毒生成和滴定

为了获得最佳的转染结果，线性化载体的质量和数量的出现最重要的。我们并没有观察到初级裂解生产的负面影响，从最初的文化繁茂，因为感染会迅速进行一次高效的病毒生产发生。然而，HEK293A细胞的病毒产量可受长的插入效率下降。一些的开放阅读框架，实际上发现干扰病毒生产。这些病毒的股票通常可以通过几轮的扩增获救，只有少数的开放阅读框被认?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
pENTR/D-TOPO Cloning Kit	Invitrogen	K240020
Gateway LR Clonase II Enzyme mix	Invitrogen	11791020
PacI	New England Biolabs	R057S
jetPEI	Polyplus-transfection	101-10N
HEK293A Cell Line	Invitrogen	R705-07
A549	ATCC	CCL-185
6-well plates	BD Falcon	353046
14 cm tissue culture dish	Nunc	168381
BALB/cJ-Tg(DO11.10)10Dlo Tg(CARΔ1)1Jdgr	Taconic Farms	Model Nr. 4285
Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II	Miltenyi Biotech	130-094-131
DMEM	Invitrogen	41966-052
FBS	PAN Biotech	1502-P110704
PenStrep	Invitrogen	15140-122
RPMI 1640	Lonza	BE12-167F
NaPyruvate	Lonza	BE13-115E
NEAA 100x	Lonza	BE13-114E
L-Glutamine	Invitrogen	25030
HEPES Buffer Solution (1 M)	Invitrogen	15630-056
β-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M-7522
MEM Essential vitamin mixture (100x)	Lonza	13-607C
Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28 for Cell Expansion and Activation	Invitrogen	114-56D
Recombinant Human TGF-beta 1	R&D Systems	240B
Proleukin S (18 x 106IE)	Novartis
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit	Invitrogen	L-23105
Mouse BD Fc BlockT	BD Pharmingen	553141
Anti-Mouse/Rat Foxp3 PE	eBioscience	12-5773-82
Mmu-miR-155 TaqMan MicroRNA Assay	Roche Applied Biosystems	4427975
LightCycler 480 Probes Master	Roche Applied Biosystems	04902343001
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit	Roche Applied Biosystems	4366596