La transducción adenoviral de células T CD4 + naïve a estudiar la diferenciación Treg

Resumen

Adenoviral la transferencia génica en células T con la expresión transgénica del receptor de adenovirus Coxsackie ingenuo CD4 permite el análisis molecular de la diferenciación de células T reguladoras In vitro.

Resumen

Las células T reguladoras (Treg) son esenciales para proporcionar la tolerancia inmune a auto, así como a ciertos antígenos extraños. Tregs puede ser generada a partir ingenuas CD4 en las células T in vitro con TCR-y co-estimulación en presencia de TGF y la IL-2. Esto tiene un enorme potencial para las terapias futuras, sin embargo, las moléculas y vías de señalización que la diferenciación de control son en gran parte desconocidos.

Las células T primarias se pueden manipular a través de la expresión del gen ectópico, pero los métodos comunes no atacan el estado ingenua más importante de la célula T antes del reconocimiento al antígeno primario. Aquí, ofrecemos un protocolo para expresar genes ectópicos de células T naive CD4 in vitro antes de inducir la diferenciación de Treg. Se aplica la transducción con el adenovirus de replicación deficiente y explica su generación y producción. El adenovirus puede tardar hasta grandes inserciones (hasta 7 kb) y se puede equipar con los promotores para lograr una alta y transitorios Sobreexpresión en las células T. Se transduce eficazmente las células T de ratones ingenuos si expresan un receptor de adenovirus Coxsackie transgénico (CAR). Es importante destacar que, después de la infección las células T permanecen ingenua (CD44 ^bajo, CD62L ^alta) y en reposo (CD25 ^-, CD69 ^-) y se pueden activar y diferenciarse en células T reguladoras similares a las células no infectadas. Por lo tanto, este método permite la manipulación de la diferenciación de células T CD4 desde sus inicios. Se asegura de que la expresión del gen ectópico ya está en su lugar cuando los eventos de señalización temprana de la estimulación inicial TCR induce cambios celulares que finalmente conducen a la diferenciación de Treg.

Introducción

Tregs son cruciales para mantener la tolerancia inmunológica y para amortiguar la respuesta inmune rebasamiento. Treg suprimen la activación de células T espectador. En consecuencia, la ablación de células T reguladoras conduce a la autoinmunidad fatal y la autodestrucción impulsado por las células T activadas ^1. Desarrollar células T reguladoras en el timo durante la selección negativa de células CD4-positivas precursores sola, pero también puede diferenciar en la periferia de las células T naive CD4 tras la estimulación de antígeno con dosis baja subóptima ^1,2 co-estimulación. Tímico células T reguladoras parece suprimir la autoinmunidad tejido contra antígenos propios, mientras que periférica células T reguladoras han sido implicados en el suministro de la tolerancia en el intestino o el pulmón. Estos inducida por células T reguladoras potentemente prevenir la activación de células T tras el reconocimiento de los antígenos extraños en la mucosa, incluyendo antígenos ambientales de los alimentos y el aire, las bacterias comensales, y los alérgenos ^3,4. Además, células T reguladoras son cruciales para establecer la tolerancia materna a la fetal péptidos ⁵ y preventilación de la enfermedad de injerto contra huésped ^6. Al mismo tiempo, células T reguladoras también median efectos no deseados mediante la atenuación de la vigilancia inmune de las células tumorales ^7,8. La característica más distintiva de células T reguladoras es la expresión del subconjunto-especificando Foxp3 factor de transcripción, un factor de transcripción que contiene el dominio tenedor-cabeza que es necesario y suficiente para conferir función ^9,10 Treg. Se sabe que algunas vías de señalización que pueden inducir la expresión de Foxp3. Sin embargo, los procesos moleculares que controlan, regulan o modulan Treg diferenciación en respuesta a la activación del receptor de células T son menos conocidos.

Tregs puede ser inducida de manera muy eficaz in vitro a través de la estimulación de las células T ingenuas CD4 con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 en la presencia de TGF y la IL-2 ^11. A medida que el Tregs emergentes son funcionales in vivo, la manipulación de moléculas que promueven la diferenciación Treg lleva un enorme potencial para el futuro therapies, por ejemplo, el tratamiento del asma, la enfermedad de Crohn, y el trasplante ^11,12. Por el contrario, la modulación terapéutica de las moléculas para bloquear la diferenciación de Treg puede proporcionar beneficio para futuros enfoques de tratamiento combinado de pacientes con tumores.

En ensayos de diferenciación in vitro han sido instrumentales para la descripción de los cambios moleculares que están asociados con T diferenciación subconjunto de células. Por el momento, los intentos experimentales para buscar en pantalla o para los productos de genes que controlan la diferenciación de células T se ve obstaculizada por el hecho de que los métodos más comunes de la expresión génica ectópico no en las células T vírgenes. Por ejemplo, la electroporación y la transducción retroviral sólo son eficaces en las células T activadas. En contraste con las expectativas iniciales, la transducción lentiviral, que es normalmente eficaz en las células en reposo, requiere pre-activación de las células T ingenuas por citocinas ^13. Además, la transferencia de ADNc o ARNm durante la electroporaciónimplica la despolarización de la membrana plasmática, que a su vez confiere características de activación de células T e incluso puede movilizar Ca ^{2 +} señalización y activar las proteínas NFAT (observaciones no publicadas y ref. ^14). Del mismo modo, para la transducción retroviral, las células T vírgenes tienen que activarse para 18 - 40 horas. Durante este tiempo, la ruptura de la membrana nuclear en el curso de la división celular se produce y permite la integración genómica posterior del vector retroviral ^15. Estos métodos por lo tanto no son capaces de hacer frente a la temprana regulación molecular de encuentro de células T con el antígeno inicial, que es la fase decisiva de la diferenciación de células T ayudante.

Transducción adenoviral es conocido para conferir expresión génica ectópica transitoria en un número de tipos de células humanas que expresan el receptor de adenovirus Coxsackie humano (CAR). Se procede sin requisito para la activación de las células o la progresión del ciclo celular. La expresión en la superficie de CAR es esencial para la fijación del virus y la internalización eficiente, y la expresión transgénica de la versión truncada CARΔ1 bajo un promotor de células T específica fue encontrado para hacer timocitos de ratón y células T susceptibles a la infección adenoviral ^16. Es importante destacar que, el transgén no altera desarrollo de los timocitos o en la diferenciación in vitro de células T CD4 + naïve en diferentes subconjuntos (datos no mostrados; ¹⁷ ref.). Adenovirus mediada por la transducción de las células T se utilizó anteriormente para la sobreexpresión ^17,18 y knock-down enfoques ^19,20. Las células T transgénicas pueden purificarse a partir comercialmente disponible DO11.10 tg; CARΔ1 tg (Taconic, Inc. y ¹⁷ ref.). Es importante destacar que, transducción adenoviral permite una alta expresión de un gen de interés en células T vírgenes sin inducir signos evidentes de activación. Las células T permanecen ingenua (CD44 ^baja, CD62L ^alta) y descanso (CD25 ^-, CD69 ^-) después infectien y se puede activar y diferenciado en Treg similares a las células no infectadas.

La producción de adenovirus recombinantes se puede lograr después de la transfección de las células con plásmidos HEK293A adenovirales (Figura 1). Estos plásmidos contienen típicamente el genoma del adenovirus tipo 5 humano con genes E1 y E3 eliminados para hacer que los adenovirus recombinantes de replicación incompetente ^21. Células HEK293A complementan la deficiencia de replicación, ya que han sido inmortalizados a través de la integración estable de adenovirus cortado ^22. Desde vectores adenovirales son grandes (~ 40 kb) y por lo tanto no es apropiado para la enzima de restricción mediada por clonación tradicional, empleamos el sistema de puerta de enlace. El gen de interés se clonó inicialmente en un vector de entrada más pequeña, de la que se pueden transferir fácilmente en el vector adenoviral de destino a través de reacción de recombinación lambda (LR) ^23. Hemos construido el vector pCAGAdDumediante la combinación del promotor CAG (promotor de actina de pollo y el potenciador de CMV) con un casete de expresión que contiene sitios LR que flanquean el marcador de selección ccdB procariota ^24. Este casete de expresión está fusionado a un sitio de entrada interna del ribosoma (IRES) elemento que permite la coexpresión de la proteína eucariota infección marcador verde fluorescente mejorada (eGFP), que está fusionado a una secuencia que contiene la hormona de crecimiento bovino poli (A)-señal. Elegimos los CAG cis-secuencias reguladoras, ya que se encontró que el promotor de CMV prototípico para ser altamente dependiente de la activación y por lo tanto, desfavorable para la expresión génica en las células T vírgenes.

Aquí, proporcionamos un protocolo para la eficiente en la diferenciación de Treg in vitro y un método para transducir células naive T CD4 sin activación (Figura 2). El método permite la expresión génica ectópico o derribar CD4 precedentes diferenciación de las células T en el estado ingenuo. Se permite probar el efecto de un overexpressed gen de interés durante los primeros eventos de señalización a la estimulación TCR inicial hasta el compromiso de T subconjunto de células. Nuestros experimentos de validación también proporcionan la base para establecer la aplicación de adenovirus similar en la diferenciación de otros subconjuntos de células T tales como Th1, Th2, Th9, Th17, Th22, o células Tfh.

Protocolo

1. La clonación de un gen de interés en un vector de entrada

1. Clonar el gen de interés en un vector de entrada. Amplificación por PCR del gen seguido por ligación de extremos romos en un vector de la topoisomerasa-acoplado (por ejemplo pENTR / D-TOPO) o la enzima de restricción mediada por clonación puede ser usada para este procedimiento.

2. Transferencia del gen de interés en la pCAGAdDu Destino vectorial

1. La transferencia del gen de interés a partir del vector de entrada en el vector de destino por LR recombinación (por ejemplo, puerta de enlace LR Clonase II mezcla de enzimas). Esto creará el vector de expresión adenoviral (Figura 1).
2. Alineado de 10 ug del vector de expresión adenoviral en una digestión de restricción PacI, precipitar el ADN y se resuspende en agua a una concentración de 3 g por 100 l. Linealización libera las repeticiones invertidas virales (ITR), que son necesarios para la replicación y encapsidación de la VDNA iral en partículas virales.

3. Generación del lisado de virus primaria

1. Semilla 1 x 10 ⁵ células HEK293A en 2 ml de medio de cultivo celular (DMEM, FBS al 10%, 5% PenStrep) en un pocillo de una placa de 6 pocillos y se incuban las células durante 6 - 14 horas a 37 ° C en un 10% CO ₂ incubadora para permitir que se adhieran. Las células deben ser entonces en aproximadamente 50% de confluencia.
2. La lipofección: Transferencia de 6 l de reactivo jetPEI en 94 l de 50 mM de NaCl, agitar brevemente. Añadir la solución mixta a 100 l vector de adenovirus linealizado mientras agitación e incubar esta mezcla de transfección durante 15 - 30 min a temperatura ambiente.

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3. Dispensar la solución gota a gota sobre la célula que contiene así HEK293A y se incuban las células a 37 ° C y CO ₂ al 10%. Cuando se utiliza un marcador de fluorescencia, evaluar la transfeeficiencia cción visualmente después de 12 a 36 horas utilizando un microscopio de fluorescencia invertido. Añadir 0,5 ml de medio fresco cada 3 días.
4. Compruebe cada 2 - 3 días con un microscopio de luz o fluorescencia para efectos citopáticos (CPE), que son áreas con células alargadas y redondeadas que comienzan a desprenderse. Esto es indicativo de la generación eficiente de virus. Tras la aparición de zonas más amplias de la CPE (Figura 3), que se llevará a 24-72 horas antes de que todas las células están infectadas.
5. Cuando todas las células muestran signos de ECP, pero antes de que se produce un desprendimiento total de las células, separar las células por pipeteo suave y de transferencia de las células con el sobrenadante (SN, 3 - 5 ml) a un tubo de poliestireno de 15 ml.
6. Congelar las células en el SN en hielo seco durante 15 - 20 min y descongelar rápidamente a 37 ° C después de la ruptura de las células. Repita este-y--ciclo de congelación-descongelación (C / TC) dos veces más. Mantenga el lisado de virus de la primaria en hielo para el uso dentro de un día o congelar a -80 ° C para almacenamiento a largo plazo. Cualquier F adicional/ TC reducirá el título del virus por 30 - 50%.

4. Virus Amplification

1. Semilla y crecer células HEK293A a 90% de confluencia en una placa de cultivo de 14 cm de tejido.
2. Infectar las células con medio de lisado de virus de la primaria (1.5 - 2,5 ml) y se incuban las células durante al menos 36 horas. Casi todas las células deben ser infectados a continuación, que puede determinarse por microscopía de fluorescencia. Para la re-amplificación de un stock de virus ya amplificada (es decir, más concentrada), HEK293A infectar a una multiplicidad de infección (MOI) de 50 (véase el apartado 6.3).
3. Las células deben ser cosechados cuando todos ellos muestran CPE, pero antes de la separación. Con la producción eficiente del virus este estado se alcanza dentro de las 48 horas después de la infección. (Si se tarda hasta una semana, considerar otra ronda de amplificación mediante el aumento de la cantidad de acciones adenovirus utilizado para la infección se ha descrito en el punto 4.2.)
4. Separar las células por pipeteo suave y células de transferencia y SN a un tubo de poliestireno de 50 ml. Girar las células hacia abajo a 300 xg durante 10 min a 4 ° C.
5. Retire el SN y resuspender el sedimento en un volumen adecuado de medio o SN (aprox. 1 ml).
6. Realizar 3 F / CT para romper las células y centrifugar a 800 xg durante 15 min a 4 ° C. Quítese la SN que contiene las partículas de virus (es decir, el lisado de virus concentrado), y alícuota del lisado de virus para almacenarlo a -80 ° C.

5. El título de virus Determinación

1. Semillas 10 ⁵ A549 células por pocillo en 5 pozos de una placa de 12 pocillos en 1 ml de medio y dejar que las células se adhieran durante 6 horas.
2. Usar 1 l de adenovirus concentrada (descongelado en hielo) para realizar una dilución en serie en medio (1:5.000, 1:10.000, 1:50.000, 1:100.000) y añadir 10 l por pocillo. Deja un pozo sin infectar para ajustar la compuerta en la citometría de flujo.
3. Después de 36 horas, quite la SN, lavar con PBS y las células de desconexión (por ejemplo, mediante tratamiento con tripsina). Para las precauciones de seguridad, se recomienda fijar cells en 100 l de paraformaldehído al 4% en PBS durante 10 min a temperatura ambiente y lavado con PBS una vez.
4. Realizar un análisis FACS de la expresión de marcadores infección. Parcela 'l de lisado viral aplica' contra el número absoluto de células infectadas (Figura 4). Determinar el intervalo lineal de la infección y calcular el título por ml de virus de la sin diluir de la curva estándar por encima del intervalo lineal con x = 1000 l.

6. T infección de la célula

1. Aislar las células T CD4 naive / reposo de DO11.10 tg; tg CARΔ1 utilizando MACS (T celda de aislamiento Kit II ingenuo CD4 +) o FACS clasificación (CD4 + CD25-CD62L + CD44-).
2. Para los experimentos a pequeña escala, una pipeta un volumen apropiado de lisado viral para alcanzar una MOI de 50 en un pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo redondo.
3. Añadir hasta 10 ⁵ células T 4 x en un volumen final de la infección de 50 l en medio de células T (RPMI 1640, FBS al 10%, 5% PenStrep, 5% NaPyruvate, NEAA 1x, 1x MEM esencialvitamina, 1x L-glutamina, 1:250.000 mercaptoetanol, 10 mM de HEPES).
   Ejemplo:
   El Ministerio del Interior de 50 se utilizará para infectar 3 10 ⁵ células T x; el título viral es 3 x 10 ⁹ ml ^-1
   Volumen Virus MOI = x número de células T / título viral = 50 x (3 x 10 ⁵⁾ / (3 x 10 ⁹ ml ^-1) = 0.005 ml

Nota: para la infección del número de células grandes, escala hasta el uso de una MOI de 50 en un volumen infección de 165 l por 10 ⁶ células T ingenuas en un tubo de poliestireno con la taza floja (hasta tp 3 ml por tubo).

4. Se incuban las células durante 90 minutos a 37 ° C en el 5% de CO ₂ incubadora.
5. Centrifugar las células a 300 xg durante 5 minutos a temperatura ambiente, quite SN, resuspender en 200 l de PBS. Se centrifuga de nuevo y quitar SN.

(Opcional: las células se pueden lavar de nuevo para eliminar el virus de la manera más eficiente)

6. Resuspender las célulasen 200 l de medio de células T sin anticuerpos estimulantes y sin IL-2 o de otras citoquinas y descanse durante 40 horas a 37 ° C en un 5% de CO ₂ incubadora para permitir la expresión del gen de interés antes de la activación.

7. Activación de las células T y la polarización

1. Pipeta un volumen de anti-CD3 y anti-CD28 bolas acoplados a que es igual al número de células (por ejemplo, 4 x 10 ⁵⁾ en una taza pequeña reactivo, añadir el volumen 10 veces mayor de PBS y ponerlos en un imán durante 2 minutos . Retirar el sobrenadante y resuspender las perlas en 200 medio de polarización l (para células T reguladoras: medio de células T + 1 ng / ml de TGF, 100 U / ml de IL-2).

Nota: Las células también se pueden activar utilizando placas de cultivo tisular recubiertas con anti-CD28 y anti-CD3 anticuerpos, o de una manera específica del receptor de células T DO11.10 usando irradiados esplenocitos BALB / c pulsadas con péptido antígeno ovoalbúmina 323-339.

2. Centrifuge la apoyó las células como antes, quitar la Resuspender las células SN y en 200 l de medio de polarización que contiene anti-CD3 y anti-CD28 de anticuerpos acoplados a perlas. Incubar durante 72 horas a 37 ° C en el 5% de CO ₂ incubadora sin cambiar medio.

8. T fijación de células y tinción para citometría de flujo

1. Lavar las células: Centrifugar las células a 300 xg durante 5 minutos a temperatura ambiente, quite SN, resuspender en 200 l de PBS. Se centrifuga de nuevo y quitar SN. Realice todas las siguientes etapas de lavado en consecuencia.
2. Resuspender las células en 100 l solución de tinción de células muertas puede arreglar y se incuba durante 30 min a 4 ° C.
3. Lavar las células, se resuspenden en 100 l de PBS, añadir 100 ml de paraformaldehído al 4% en PBS, incubar 15 min a TA.
4. Lavar las células, resuspender en 200 l de metanol enfriado con hielo 70% en PBS y se incuba durante 30 min en hielo.

Nota: Las celdas pueden ser tratados a partir de ahora sin precaución biohazard!

5. Preparar 60 l master-mix de 60 l de PBS + 10 mg / ml Fc-block (anti-FCR3 para bloquear la unión inespecífica). Lavar las células, resuspender en 40 l de PBS + anti-FCR3 e incubar 15 min a TA.
6. Añadir 20 l de PBS + anti-FCR3 que contiene 1 g de PE-junto anticuerpo anti-Foxp3, mezclar bien y se incuba a 4 ° C durante la noche.
7. Lavar las células dos veces en PBS y analizar las células en un citómetro de flujo.

Resultados

Producción Virus

Para la generación de altos títulos de virus, el tiempo de cosecha de células HEK293A en la producción de virus primario o amplificación del virus es crucial. Representativos imágenes de contraste de fase fluorescentes y con signos visuales de la producción de virus se muestran en la Figura 3. El CPE se observaron 10 días después de la transfección de células HEK293A con pCAGAdDu vector de control sin inserto. CPE se caracteriza por la aparición de...

Discusión

Virus Generación y Titulación

Para obtener resultados óptimos de transfección, la calidad y la cantidad de vector linealizado parecen más importantes. No se observaron efectos negativos en la producción primaria de lisado de un crecimiento excesivo inicial del cultivo ya que la infección se procederá rápidamente una vez que se produce la producción de virus eficiente. Sin embargo, la producción de virus por las células HEK293A puede verse afectado por las inserciones largas que dism...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
pENTR/D-TOPO Cloning Kit	Invitrogen	K240020
Gateway LR Clonase II Enzyme mix	Invitrogen	11791020
PacI	New England Biolabs	R057S
jetPEI	Polyplus-transfection	101-10N
HEK293A Cell Line	Invitrogen	R705-07
A549	ATCC	CCL-185
6-well plates	BD Falcon	353046
14 cm tissue culture dish	Nunc	168381
BALB/cJ-Tg(DO11.10)10Dlo Tg(CARΔ1)1Jdgr	Taconic Farms	Model Nr. 4285
Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II	Miltenyi Biotech	130-094-131
DMEM	Invitrogen	41966-052
FBS	PAN Biotech	1502-P110704
PenStrep	Invitrogen	15140-122
RPMI 1640	Lonza	BE12-167F
NaPyruvate	Lonza	BE13-115E
NEAA 100x	Lonza	BE13-114E
L-Glutamine	Invitrogen	25030
HEPES Buffer Solution (1 M)	Invitrogen	15630-056
β-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M-7522
MEM Essential vitamin mixture (100x)	Lonza	13-607C
Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28 for Cell Expansion and Activation	Invitrogen	114-56D
Recombinant Human TGF-beta 1	R&D Systems	240B
Proleukin S (18 x 106IE)	Novartis
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit	Invitrogen	L-23105
Mouse BD Fc BlockT	BD Pharmingen	553141
Anti-Mouse/Rat Foxp3 PE	eBioscience	12-5773-82
Mmu-miR-155 TaqMan MicroRNA Assay	Roche Applied Biosystems	4427975
LightCycler 480 Probes Master	Roche Applied Biosystems	04902343001
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit	Roche Applied Biosystems	4366596