ナイーブCD4のアデノウイルス形質導入Tregの分化を研究するためにT細胞

要約

ナイーブCD4コクサッキーアデノウイルス受容体のトランスジェニック発現とT細胞へのアデノウイルス遺伝子導入は、制御性T細胞分化の分子解析を可能に in vitroで。

要約

制御性T細胞（Tregの）自己にと同様、特定の外来抗原に対する免疫寛容を提供することが不可欠です。 Tregのは、TGFβとIL-2の存在下でのTCRと共刺激を用いたin vitroにおけるナイーブCD4 T細胞から生成することができる。これは、将来の治療のための巨大な潜在力を負担するが、制御分化その分子とシグナル伝達経路は不明な点が多い。

一次T細胞を異所性遺伝子発現を介して操作するが、一般的な方法は、一次抗原認識の前にT細胞の最も重要なナイーブ状態を標的に失敗することができる。ここでは、Tregの分化を誘導する前に、ナイーブCD4における異所性遺伝子のin vitroでのT細胞を表現するためのプロトコルを提供する。これは、複製欠損アデノウイルスで形質導入を適用し、その生成と生産を説明します。アデノウイルスは、大規模な挿入（最大7キロバイト）を取ることができ、高いと過渡overexpを達成するためにプロモーターを装備することができますT細胞におけるression。それらは、トランスジェニックコクサッキーアデノウイルス受容体（CAR）を発現する場合、それは効果的にナイーブマウスのT細胞を伝達する。重要なのは、感染後のT細胞はナイーブ（CD44 ^低 、CD62L ^高い ）と安静時のまま（CD25 ^- 、CD69 ^{- ）}と非感染細胞に類似したTregに活性化し、分化させることができる。したがって、この方法は、初めからCD4 T細胞分化の操作を可能にする。これは、初期のTCR刺激の初期シグナル伝達事象が結局Tregの分化につながる細胞の変化を誘導するとき。その異所性遺伝子発現が既にあることを保証

概要

Tregは、免疫寛容を維持し、シュート免疫応答を抑制することが重要である。 Tregのは、バイスタンダーT細胞活性化を抑制する。これにより、Tregのアブレーションは、活性化T細胞¹により駆動致命的な自己免疫および自己破壊につながる。 Tregのは、CD4シングルポジティブ前駆体の負の選択時に胸腺で開発が、彼 ​​らはまた、次善の共刺激^1,2と低用量の抗原刺激によるナイーブCD4 T細胞から周囲に区別することができます。周辺Tregのが腸や肺の許容範囲を提供することに関与しているのに対し、胸腺Tregのは、自己抗原に対する組織の自己免疫を抑制するように見える。これらの誘導されたTregは強力に食品や空気からの環境抗原、共生細菌、およびアレルゲン^3,4含む粘膜における外来抗原の認識後にT細胞活性化を防ぐ。また、Tregのは⁵胎児のペプチドに母性寛容を確立すると、事前に重要であるベント移植片対宿主病^6。同時に、Tregはまた^、7,8腫瘍細胞の免疫監視を減衰させることによって不要な効果を媒介する。 Tregの特徴的な機能は、サブセット指定型転写因子Foxp3は、必要かつ機能^9,10 Treg細胞^を付与するのに十分であるフォークヘッドドメイン含有転写因子の表現である。 Foxp3の発現を誘導することができるいくつかのシグナル伝達経路が知られている。制御、調節、またはトリガするT細胞受容体に応答してTreg細胞分化を調節はあまり理解されているが、分子プロセス。

Tregのは非常に効果的にTGFβとIL-2の存在下で^、11抗CD3および抗CD28抗体を用いたナイーブCD4 T細胞の刺激を介してin vitroで誘導することができる。新興Tregのは、生体内で機能しているように、Tregの分化を促進する分子の操作は、将来のための巨大な潜在力therapiを負担エス、例えば、喘息、クローン病、および移植^11,12の治療。逆に、Tregの分化を阻止する分子の治療的変調は、腫瘍患者の併用治療の将来のアプローチにおいて利点を提供することができる。

in vitroでの分化アッセイにおいて T細胞サブセットの分化に関連付けられている分子の変化の説明については、尽力してきました。現時点では、検索や制御性T細胞の分化は、異所性遺伝子発現の最も一般的な方法は、ナイーブT細胞で失敗するという事実によって妨げられていることを遺伝子産物をスクリーニングするための実験的な試み。例えば、エレクトロポレーションおよびレトロウイルス形質導入は、活性化T細胞でのみ有効です。当初の予想、休止細胞において、通常効果的であるレンチウイルス形質導入、とは対照的に、サイトカイン¹³によりナイーブT細胞のプレ活性化が必要です。さらに、エレクトロポレーション時のcDNAまたはmRNAの移転それ自体がT細胞活性化の特徴を付与してものCa ^{2 +}シグナル伝達を動員することができる形質膜の脱分極を含む とNFATタンパク質（未発表の観察とref ^14）活性化する。 40時間 - 同様に、レトロウイルス形質導入のために、ナイーブT細胞が18のために活性化されなければならない。この間、細胞分裂の過程で核膜の崩壊が発生し、レトロウイルスベクター¹⁵のその後のゲノムに統合することができます。これらのメソッドは、したがって、ヘルパーT細胞分化の決定的な段階である抗原との初期T細胞出会い、初期の分子の規制に対処することはできません。

アデノウイルス形質導入は、ヒトコクサッキーアデノウイルス受容体（CAR）を発現するヒト細胞型の数の一時的な異所性遺伝子発現を付与することが知られている。それは、細胞の活性化または細胞周期の進行を必要とせずに進行する。 Cの表面発現ARは、アデノウイルス感染¹⁶の影響を受けやすく、マウス胸腺細胞とT細胞をレンダリングするために発見されたT細胞特異的プロモーターの下で効率的なウイルスの添付ファイルとナリ、と切り捨てバージョンCARΔ1のトランスジェニック発現に必須である。重要なのは、導入遺伝子は胸腺細胞の開発を変更したり、ナイーブCD4 のin vitroでの分化の異なるサブセットにT細胞（示されていないデータ。REF ^17） ではありません。 T細胞のアデノウイルス媒介形質導入は、以前に過剰発現^17,18とノックダウンアプローチ^19,20のために使用された。トランスジェニックT細胞は、市販のDO11.10 TGから精製することができる;CARΔ1TG（タコニック社とref ^17）。重要なのは、アデノウイルス形質導入は活性化の明らかな兆候を誘発することなく、ナイーブT細胞での目的遺伝子の高発現を可能にします。 T細胞は、ナイーブなまま（CD44 ^低 、CD62L ^高い ）と休息（CD25 ^- 、CD69 ^{- ）}の後infecti上と非感染細胞に類似Treg細胞に活性化し、分化させることができる。

組換えアデノウイルスの製造は、アデノウイルスプラスミド（図1）HEK293A細胞のトランスフェクション後に達成することができる。これらのプラスミドは通常複製無能な組換えアデノウイルス^21をレンダリングするために削除されたE1およびE3遺伝子と人間の5型アデノウイルスゲノムを含んでいます。彼らはせん断アデノウイルス²²の安定した統合により不死化されたとしてHEK293A細胞が複製欠乏を補完する。アデノウイルスベクターは、大（〜40キロバイト）、その結果、十分に伝統的な制限酵素媒介クローニングに適していないので、我々は、ゲートウェイシステムを採用。目的の遺伝子は、最初に、簡単にラムダ組換え反応^（LR）23を介して宛先アデノウイルスベクターに転送することができ、そこから小さいエントリーベクターにクローニングされる。我々はpCAGAdDuベクトルを構築し原核CCDB選択マーカー^24に隣接LR部位を含む発現カセットでCAGプロモーター（ニワトリアクチンプロモーター及びCMVエンハンサー）を組み合わせることにより。この発現カセットは、ウシ成長ホルモンポリAシグナルを含有する配列に融合される真核生物の感染症マーカー強化緑色蛍光タンパク質（EGFP）の共発現を可能にする内部リボソーム侵入部位（IRES）エレメントに融合される。原型CMVプロモーターがナイーブT細胞における遺伝子発現のための非常に活性化に依存するので、不利であることが見出されたので、我々は、CAGシス調節配列を選んだ。

ここで、我々は、in vitro Tregの分化と活性化（図2）ことなく、ナイーブCD4 T細胞を形質導入する方法で効率的にするためのプロトコルを提供します。方法は、異所性遺伝子発現を可能にしたり、素朴な状態で前のCD4のT細胞分化をノックダウン。それはoverexpresseの効果を試験することができT細胞サブセットのコミットメントまで初期のTCR刺激により早期にシグナル伝達事象の間に利害のD遺伝子。当社の検証実験もTh2のようなTh1細胞など他のT細胞サブセット、チューブ内径、Th17細胞、Th22、またはTFH細胞の分化における類似のアデノウイルスアプリケーションを確立するための基礎を提供する。

プロトコル

1。エントリーベクターへの目的遺伝子のクローニング

1. エントリーベクターに目的の遺伝子のクローンを作成します。トポイソメラーゼ結合ベクター（ 例えば、pENTR / D-TOPO）、または制限酵素媒介によるクローニングに平滑末端ライゲーション、続いて遺伝子のPCR増幅は、この手順のために使用することができる。

2。 pCAGAdDuのデスティネーションベクタに目的の遺伝子を転送

1. LR組換え（ 例えばゲートウェイLRクロナーゼII酵素ミックス）によるデスティネーションベクタにエントリーベクターから目的の遺伝子を転送します。これは、アデノウイルス発現ベクター（図1）を作成します。
2. DNAを沈殿させるのPacI制限消化、中にアデノウイルス発現ベクター10μgのを線形化し、100μl当たり3μgのの濃度で水に懸濁します。線形は、Vの複製とキャプシドに必要とされるウイルスの逆方向反復（ITR）は、解放ウイルス粒子にDNA iral。

3。プライマリウイルス溶解物の生成

1. シード1 6ウェルプレートの1ウェルに2ミリリットル細胞培養培地（DMEM、10％FBS、5％PenStrep）のx 10 ⁵ HEK293Aセルおよび6細胞をインキュベート- 37℃で14時間°10％Cそれらが付着することを可能にするCO ₂インキュベーター。細胞はその後、密集度約50％であるべきである。
2. リポフェクション：転送のNaCl 50μM、渦短時間の94μlのにjetPEI試薬の6μlの。ボルテックスしながら100μlの線形化されたアデノウイルスベクターへの混合溶液を加え、15のために、このトランスフェクション混合インキュベート - 室温で30分。

アデノウイルス感染症のための適切なバイオセーフティの条件の下で、以下のすべての手順を実行します！

3. HEK293Aセル含有十分に滴下してソリューションを分注し、37℃で細胞をインキュベート℃、10％CO _2。蛍光マーカを使用する場合は、transfeを評価視覚的に12後ction効率 - 倒立蛍光顕微鏡を用いて36時間。 3日ごとに新鮮な培地を0.5mlを加える。
4. デタッチし始める拡大と丸みを帯びた細胞を用いた領域である細胞変性効果（CPE）、のための光や蛍光顕微鏡で3日間 - 毎に2をチェックします。これは、効率的なウイルスの生成を示す。全ての細胞が感染される前に72時間- CPEの広範なゾーン（図3）が発生すると、それが24になります。
5. すべてのセルは、CPEの兆しを見せたが、細胞の全体的な剥離が発生する前に、（SN、3 - 、5ml）を上清と穏やかにピペッティングし、転送細胞によって細胞を剥離すると15ミリリットルのポリスチレンチューブに。
6. 15ドライアイスでSNで細胞を凍結 - 20分と破裂細胞℃にその後37℃ですばやく解凍。この凍結と融解サイクル（F / TC）をさらに2回繰り返します。日以内の使用のために氷の上で主要なウイルス溶解物を維持するか-80℃で長期保存のためにそれを凍結。任意の追加F/ TCは30でウイルス力価が減少します - 50％。

4。ウイルス増幅

1. シードと14センチメートルの組織培養皿に90％コンフルエントになるまでHEK293A細胞を成長させる。
2. 主要なウイルス溶解物の半分（1.5〜2.5ミリリットル）で細胞に感染し、少なくとも36時間、細胞をインキュベートする。ほぼ全ての細胞を蛍光顕微鏡により決定することができるし、感染されるべきである。すでに（より濃縮IE）増幅ウイルスストックの再増幅のため、50の感染多重度（MOI）（6.3参照）でHEK293Aに感染。
3. それらのすべてがCPEを示しますが、剥離前時に細胞を回収しなければならない。効率的なウイルス産生と、この状態は、感染後48時間以内に到達する。 （それは一週間程かかる場合には、4.2で説明感染に使用アデノウイルスストックの量を増やすことによって増幅の別のラウンドを考えてみましょう。）
4. 50ミリリットルのポリスチレンチューブに穏やかにピペッティングし、転送細胞とSNにより細胞を切り離す。 4℃で10分、300×gで、細胞をスピンダウン
5. SNを取り外し、培地またはSN（ 約 1ml）を適切な音量でペレットを再懸濁します。
6. 4℃で15分間、800×gで細胞や遠心分離機を破壊する3 F / TCを実行（濃縮ウイルスライセートをIE）のウイルス粒子が含まれているSNを脱いで、そしてアリコートウイルス溶解物は-80℃で、それを格納するために℃の

5。ウイルス力価測定

1. 、1mlの培地中12ウェルプレートのウェルに5シードウェルあたり10 ⁵ A549細胞を、細胞が6時間密着させ。
2. 培地で段階希釈を実行するために集中アデノウイルスの1μlの（氷上で解凍）を使用してください（1:5,000、1:10,000、1:50,000、1:100,000）とウェルあたり10μLを加える。フローサイトメトリーでゲートを調整する一つがよく感染していないままにしておきます。
3. 36時間後、PBSとデタッチ細胞（ 例えばトリプシン処理によって）で洗って、SNを脱ぐ。バイオハザード予防のために、Cを固定することをお勧めしますPBS 1時間室温と洗浄で10分間PBSで100μlの4％パラホルムアルデヒドでエルボ。
4. 感染マーカー発現のFACS分析を実行します。プロット感染細胞の絶対数（図4）に対して'μlのウイルス溶解液を適用'。感染の直線範囲を決定し、X = 1,000μLを用いた線形範囲で標準曲線から原液ウイルス1ml当たり価を計算します。

6。 T細胞感染

1. から休息/ナイーブCD4 T細胞を単離DO11.10 TG; MACS（ナイーブCD4 + T CellアイソレーションキットII）またはFACS、ソートを使用してCARΔ1Tgマウス（CD4 + CD25-CD62L + CD44-）。
2. 小規模の実験のために、96ウェル丸底プレートの1ウェル中にMOI 50を達成するために、ウイルス溶解物の適切な量をピペット。
3. T細胞培地（RPMI1640、10％FBS、5％PenStrep、5％NaPyruvate、1×NEAA、必須1×MEM中の50μlの最終感染量で4×10 ⁵ T細胞まで追加ビタミン、1×L-グルタミン、1:250,000メルカプトエタノール、10mMのHEPES）。
   例：
   MOI 50は3×10 ⁵個のT細胞を感染するために使用しなければならない。 ウイルス力価は、3×10 ⁹ミリリットル^-1で
   ウイルス量= MOI X T細胞数/ウイルス力価= 50×（3×10 ^{5）/（3×10 9}ミリリットル^-1）= 0.005ミリリットル

注：より大きい細胞数の感染、スケール緩いカップポリスチレンチューブ（最大チューブあたりTP 3ml）中10 ⁶ナイーブT細胞あたり165μLの感染量でMOI 50のを使って。

4. 5％CO ₂インキュベーター内で37℃で90分間細胞をインキュベート。
5. 室温で5分間300 xgで細胞をスピンダウンし、200μlのPBSに再懸濁し、SNを脱ぐ。再び遠心し、SNを脱ぐ。

（オプション：細胞がより効率的にウイルスを削除するには、再度洗浄してもよい）

6. 細胞を再懸濁し200μlのT細胞を刺激抗体がなく、IL-2又は他のサイトカインを含まない培地で37℃で40時間のためにそれらを休ませ、5％CO ₂インキュベーター内°Cは、起動する前に、目的の遺伝子の発現を可能にする。

7。 T細胞の活性化と偏光

1. 体積抗CD3および小試薬カップに細胞数（ 例えば、4×10 ^5）に等しい抗CD28結合ビーズをピペットで、PBSの10倍量を加え、2分間磁石の上に置く。上清を脱いで、200μlの偏培地（Tregのために：T細胞培地+ 1 ngの/ mlでのTGFβ、100 U / mlのIL-2）でビーズを再懸濁します。

注：細胞を、抗CD28及び抗CD3抗体で被覆された組織培養皿を用いて活性化することができる、またはオボアルブミン323-339ペプチド抗原をパルス照射されたBALB / cの脾臓細胞を用いDO11.10 T細胞受容体特異的である。

2. Centrifugeは前と同じように、細胞を休ませ、200μlの偏光を含む培地抗CD3を、抗CD28抗体結合ビーズにSN再懸濁した細胞を脱ぐ。媒体を変えることなく、5％CO ₂インキュベーター内で37℃で72時間インキュベートする。

8。フローサイトメトリー用のT細胞固定と染色

1. 細胞を洗浄：200μlのPBSに再懸濁し、SNを脱いで、室温で5分間300 xgで細胞をスピンダウン。再び遠心し、SNを脱ぐ。それに応じて、以下のすべての洗浄の手順を実行します。
2. 100μlの固定可能な死細胞の染色液で細胞を再懸濁し、4℃で30分間インキュベート℃で
3. 細胞を洗浄し、100μlのPBSに再懸濁し、PBS、室温でインキュベートし、15分で100μlの4％パラホルムアルデヒドを追加します。
4. 細胞を洗浄し、PBSで200μlの氷冷70％メタノール中で再懸濁し、氷上で30分間インキュベートする。

注：細胞をバイオハザード予防せず、今から治療することができます！

5. 60μlのPBS + 10μgの/ mlのFcをブロック（非特異的結合をブロックする抗FCR3）60μlのマスターミックスを調製する。細胞を洗浄し、PBS +抗FCR340μlの再懸濁し、室温で15分間インキュベートする。
6. 1μgのPE-結合抗Foxp3の抗体を含有するPBS +抗FCR3の20μlを添加し、よく混合し、°Cで一晩4℃でインキュベートする。
7. PBSで細胞を2回洗浄し、フローサイトメーターで細胞を分析する。

結果

ウイルス産生

高いウイルス力価の生成のために、主要なウイルス産生やウイルス増幅HEK293A細胞収穫のタイミングが非常に重要です。ウイルス産生の視覚的徴候を描写蛍光及び位相コントラスト像を図3に示す。 CPEが10日インサートなしの対照pCAGAdDuベクターによる細胞のトランスフェクションHEK293A後に観察された。 CPEは、感染マーカーGFP高発現をデタッチし、?...

ディスカッション

ウイルスの生成と滴定

最適なトランスフェクションの結果を得るためには、線状化ベクターの質と量は、最も重要な表示されます。効率的なウイルス産生が発生すると感染症を迅速に進めていきますので、我々は文化の初期の異常増殖からプライマリーライセート生産にマイナスの効果を観察しませんでした。しかし、HEK293A細胞によるウイルス産生効率を低下させる長い?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
pENTR/D-TOPO Cloning Kit	Invitrogen	K240020
Gateway LR Clonase II Enzyme mix	Invitrogen	11791020
PacI	New England Biolabs	R057S
jetPEI	Polyplus-transfection	101-10N
HEK293A Cell Line	Invitrogen	R705-07
A549	ATCC	CCL-185
6-well plates	BD Falcon	353046
14 cm tissue culture dish	Nunc	168381
BALB/cJ-Tg(DO11.10)10Dlo Tg(CARΔ1)1Jdgr	Taconic Farms	Model Nr. 4285
Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II	Miltenyi Biotech	130-094-131
DMEM	Invitrogen	41966-052
FBS	PAN Biotech	1502-P110704
PenStrep	Invitrogen	15140-122
RPMI 1640	Lonza	BE12-167F
NaPyruvate	Lonza	BE13-115E
NEAA 100x	Lonza	BE13-114E
L-Glutamine	Invitrogen	25030
HEPES Buffer Solution (1 M)	Invitrogen	15630-056
β-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M-7522
MEM Essential vitamin mixture (100x)	Lonza	13-607C
Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28 for Cell Expansion and Activation	Invitrogen	114-56D
Recombinant Human TGF-beta 1	R&D Systems	240B
Proleukin S (18 x 106IE)	Novartis
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit	Invitrogen	L-23105
Mouse BD Fc BlockT	BD Pharmingen	553141
Anti-Mouse/Rat Foxp3 PE	eBioscience	12-5773-82
Mmu-miR-155 TaqMan MicroRNA Assay	Roche Applied Biosystems	4427975
LightCycler 480 Probes Master	Roche Applied Biosystems	04902343001
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit	Roche Applied Biosystems	4366596