Transduction Adenoviral de CD4 naïfs cellules T pour étudier la différenciation Treg

Résumé

Le transfert de gène adénoviral en CD4 des cellules T naïves avec expression transgénique du récepteur de l'adénovirus Coxsackie permet l'analyse moléculaire de la différenciation des cellules T régulatrices In vitro.

Résumé

Les cellules T régulatrices (Treg) sont essentielles pour assurer la tolérance immunitaire à l'auto ainsi que pour certains antigènes étrangers. Tregs peut être généré à partir de cellules T CD4 naïves in vitro avec le TCR et co-stimulation en présence de TGF et de l'IL-2. Cela porte un énorme potentiel pour de futurs traitements, cependant, les molécules et les voies de signalisation que la différenciation de contrôle sont largement inconnues.

Les cellules T primaires peuvent être manipulés par l'expression des gènes extra-utérine, mais les méthodes communes parviennent pas à cibler l'état naïf le plus important de la cellule T avant la reconnaissance de l'antigène primaire. Ici, nous fournissons un protocole d'exprimer des gènes extra-utérines en cellules T CD4 naïves in vitro avant d'induire la différenciation Treg. Elle s'applique transduction avec l'adénovirus déficient pour la réplication et explique sa génération et de la production. L'adénovirus peut prendre jusqu'à de grands inserts (jusqu'à 7 ko) et peut être équipé avec les promoteurs pour atteindre la haute et transitoire OVEREXPression dans les cellules T. Il transduit efficacement les lymphocytes T de souris naïves si elles expriment un récepteur de l'adénovirus Coxsackie transgénique (CAR). Surtout, après l'infection, les lymphocytes T restent naïfs (CD44 ^faible, CD62L ^élevé) et de repos (CD25 ^-, CD69 ^-) et peuvent être activées et différenciées en Tregs similaires aux cellules non-infectées. Ainsi, cette méthode permet la manipulation de cellules CD4 T différenciation cellulaire depuis ses débuts. Il assure que l'expression des gènes extra-utérine est déjà en place lorsque les événements de signalisation précoces de la stimulation initiale TCR induit des changements cellulaires qui aboutissent dans Treg différenciation.

Introduction

Tregs sont cruciales pour maintenir la tolérance immunitaire et à atténuer la réponse immunitaire de surréaction. Tregs supprimer l'activation des cellules T du spectateur. Par conséquent, l'ablation des Tregs conduit à l'auto-immunité fatal et l'auto-destruction entraînée par les cellules T activées ^1. Tregs se développent dans le thymus au cours de sélection négative des CD4 précurseurs mono-positifs, mais ils peuvent aussi faire la différence dans la périphérie de CD4 des lymphocytes T naïfs lors de la stimulation antigénique faible dose optimale avec ^1,2 co-stimulation. Thymique Tregs semblent supprimer l'auto-immunité tissu contre des auto-antigènes, alors que périphérique Tregs ont été impliqués dans la fourniture de tolérance dans l'intestin ou du poumon. Ceux-ci induit Tregs puissamment prévenir l'activation des lymphocytes T après la reconnaissance d'antigènes étrangers dans la muqueuse, y compris antigènes environnementaux de la nourriture et de l'air, les bactéries commensales, et les allergènes ^3,4. En outre, les Tregs sont essentielles pour établir la tolérance maternelle de peptides fœtales ⁵ et à prévent la maladie du greffon contre l'hôte ^6. Dans le même temps, Tregs également médier les effets indésirables en atténuant la surveillance immunitaire des cellules tumorales ^7,8. La fonction caractéristique de Tregs est l'expression de la sous-spécification transcription Foxp3 facteur, un facteur de transcription contenant un domaine fourche tête qui est nécessaire et suffisante pour conférer une fonction ^9,10 Treg. Certaines voies de signalisation qui peuvent induire l'expression de Foxp3 sont connus. Cependant, les mécanismes moléculaires qui contrôlent, réguler ou moduler Treg différenciation en réponse au récepteur des cellules T déclenchement sont moins bien compris.

Tregs peut être très efficace induite in vitro par la stimulation des cellules T CD4 naïfs avec des anticorps anti-CD3 et anti-CD28 en présence de TGF et IL-2 ^11. Comme les Tregs émergents sont fonctionnelles in vivo, la manipulation de molécules qui favorisent la différenciation Treg porte un énorme potentiel pour l'avenir therapies, par exemple, le traitement de l'asthme, la maladie de Crohn et la transplantation ^11,12. Inversement, la modulation thérapeutique de molécules afin de bloquer la différenciation Treg peut offrir des avantages dans les futures approches de traitement combiné des patients atteints de tumeurs.

Dans les essais de différenciation in vitro ont joué un rôle important pour la description des changements moléculaires qui sont associés avec T différenciation de sous-ensemble de cellules. À l'heure actuelle, les tentatives expérimentales à la recherche ou à l'écran pour les produits de gènes qui contrôlent la différenciation des cellules T sont entravés par le fait que les méthodes les plus courantes de l'expression des gènes extra-utérine ne parviennent pas dans les cellules T naïves. Par exemple, l'électroporation et la transduction rétrovirale ne sont efficaces que dans les cellules T activées. Contrairement aux attentes initiales, la transduction lentivirus, qui est généralement efficace dans les cellules au repos, nécessite de pré-activation des cellules T naïves par des cytokines ^13. En outre, le transfert de l'ADNc ou de l'ARNm durant l'électroporationimplique une dépolarisation de la membrane plasmique, qui lui-même confère des caractéristiques de l'activation des cellules T et peut même mobiliser Ca ^{2 +} signalisation et activer des protéines NFAT (observation et ref inédit. ^14). De même, pour la transduction rétrovirale, les cellules T naïves doivent être activés pour 18 - 40 h. Pendant ce temps, la répartition de la membrane nucléaire au cours de la division cellulaire se produit et permet l'intégration de la génomique ultérieure du vecteur rétroviral ^15. Ces méthodes ne sont donc pas en mesure de répondre à la régulation moléculaire début de la rencontre initiale des lymphocytes T avec l'antigène, qui est la phase décisive de la différenciation des cellules T helper.

Transduction adénovirus est connue pour conférer une expression ectopique du gène passagère dans un certain nombre de types de cellules humaines qui expriment le récepteur de l'adénovirus humain Coxsackie (CAR). Il procède sans obligation pour l'activation de la cellule ou de la progression du cycle cellulaire. L'expression de surface de CAR est essentiel pour la fixation du virus efficace et l'intériorisation et l'expression transgénique de la version tronquée CARΔ1 sous un promoteur spécifique des cellules T a été trouvée pour rendre thymocytes de souris et des cellules T sensibles à l'infection par adénovirus ^16. Surtout, le transgène ne modifie pas le développement des thymocytes ou la différenciation in vitro des cellules CD4 T naïfs cellules dans différents sous-ensembles (données non présentées; ref ^17).. Transduction adénovirus des cellules T a déjà été utilisé pour la surexpression ^17,18 et knock-down approches ^19,20. Les cellules T transgéniques peuvent être purifiés à partir de commerce DO11.10 tg; CARΔ1 tg (Taconic, Inc. et ref ^17).. Surtout, transduction adénovirale permet une haute expression d'un gène d'intérêt dans des cellules T naïves sans induire des signes évidents d'activation. Les lymphocytes T restent naïfs (CD44 ^faible, CD62L ^élevé) et de repos (CD25 ^-, CD69 ^-) après infectisur et peut être activée et différenciée en Treg similaire aux cellules non infectées.

Production d'adénovirus recombinants peut être atteint après transfection de cellules avec des plasmides HEK293A adénoviraux (Figure 1). Ces plasmides contiennent généralement du génome de l'adénovirus humain de type 5 avec les gènes E1 et E3 supprimées pour rendre adénovirus recombinants incompétent pour la réplication ^21. Cellules HEK293A complètent carence de réplication tels qu'ils ont été immortalisés par l'intégration stable de l'adénovirus ²² cisaillé. Depuis vecteurs adénoviraux sont grandes (~ 40 kb) et par conséquent pas bien adapté pour l'enzyme de restriction induite par clonage traditionnel, nous avons utilisé le système de passerelle. Le gène d'intérêt est initialement clonée dans un vecteur d'entrée plus petit, à partir de laquelle il peut être facilement transféré dans le vecteur adénoviral de destination par l'intermédiaire de la réaction de recombinaison lambda (LR) ^23. Nous avons construit le vecteur pCAGAdDuen associant le promoteur CAG (promoteur de l'actine de poulet et CMV) avec une cassette d'expression contenant des sites LR flanquant le marqueur de sélection ccdB procaryote ^24. Cette cassette d'expression est fusionnée à un site d'entrée interne du ribosome (IRES) de l'élément qui permet de co-expression du marqueur renforcée protéine eucaryote de l'infection fluorescente verte (EGFP), qui est fusionné à une séquence contenant l'hormone de croissance bovine poly (A) de signal. Nous avons choisi des séquences cis-régulatrices CAG, puisque le promoteur CMV prototype a été jugée hautement dépendant de l'activation et donc défavorable pour l'expression des gènes dans les cellules T naïves.

Ici, nous fournissons un protocole pour l'efficacité dans Treg différenciation in vitro et une méthode pour la transduction de CD4 des lymphocytes T naïfs sans activation (figure 2). La méthode permet l'expression des gènes extra-utérine ou abattre CD4 précédents différenciation des cellules T à l'état naïf. Il permet de tester l'effet d'une overexpressegène d 'intérêt au cours des événements de signalisation précoces lors de la stimulation initiale TCR jusqu'à engagement de sous-ensemble de cellules T. Nos expériences de validation fournissent également la base pour établir l'application de l'adénovirus similaire dans la différenciation des autres sous-ensembles de cellules T comme Th1, Th2, Th9, Th17, Th22, ou des cellules TFH.

Protocole

1. Clonage d'un gène d'intérêt dans un vecteur d'entrée

1. Cloner le gène d'intérêt dans un vecteur d'entrée. Amplification par PCR du gène suivie d'une ligature d'extrémités franches dans un vecteur topoisomérase couplé (par exemple pENTR / D-TOPO) ou l'enzyme de restriction à médiation par clonage peut être utilisé pour cette procédure.

2. Transfert du gène d'intérêt dans le pCAGAdDu Vecteur de Destination

1. Transférer le gène d'intérêt à partir du vecteur d'entrée dans le vecteur de destination par recombinaison LR (par exemple la passerelle LR Clonase II Enzyme Mix). Cela va créer le vecteur d'expression adénoviraux (Figure 1).
2. Linéariser 10 ug du vecteur d'expression adénoviral dans une digestion de restriction PacI, précipiter l'ADN et remettre en suspension dans l'eau à une concentration de 3 pg par 100 pi. Linéarisation libère les répétitions inversées virales (ITR), qui sont nécessaires pour la réplication et l'encapsidation du vADN IRAL dans des particules virales.

3. Génération du lysat Virus primaire

1. Graine de 1 x 10 ⁵ cellules HEK293A dans deux milieux de culture de cellules ml (DMEM, 10% FBS, 5% Penstrep) dans un puits d'une plaque de 6 puits et incuber les cellules pendant 6 à 14 heures à 37 ° C en 10% Incubateur à CO ₂ pour leur permettre d'adhérer. Les cellules doivent alors être à la confluence d'environ 50%.
2. Lipofection: Transfert 6 pi de réactif jetPEI dans 94 ul de 50 uM NaCl, brièvement vortex. Ajouter la solution mélangée à 100 pi vecteur adénovirus linéarisé en vortex et incuber ce mélange de transfection pendant 15 - 30 min à température ambiante.

Effectuez toutes les étapes suivantes dans les conditions appropriées de biosécurité pour l'infection à adénovirus!

3. Verser goutte à goutte la solution dans la cellule contenant HEK293A bien et incuber les cellules à 37 ° C et 10% de CO _2. Lorsque vous utilisez un marqueur de fluorescence, d'évaluer le transfeefficacité ction visuellement après 12 à 36 h à l'aide d'un microscope inversé à fluorescence. Ajouter 0,5 ml de milieu frais tous les 3 jours.
4. Consultez toutes les 2 - 3 jours avec un microscope optique ou de fluorescence pour effet cytopathogène (CPE), qui sont des zones avec des cellules élargies et arrondies qui commencent à se détacher. Ceci est révélateur de la génération de virus efficace. Lors de l'apparition de zones plus larges du CPE (figure 3), il faudra 24 à 72 h avant de toutes les cellules sont infectées.
5. Lorsque toutes les cellules présentent des signes de CPE, mais avant un décollement de l'ensemble des cellules se produit, détacher les cellules par pipetage doux et les cellules de transfert de surnageant (SN, 3-5 ml) dans un tube en polystyrène de 15 ml.
6. Geler les cellules de la SN sur glace sèche pendant 15 - 20 min et décongeler rapidement à 37 ° C après la rupture des cellules. Répétez ce gel-dégel et-cycle (F / TC) deux fois plus. Gardez le lysat primaire du virus sur la glace pour une utilisation dans un jour ou le congeler à -80 ° C pour le stockage à long terme. Toute F supplémentaire/ TC permettra de réduire le titre viral de 30 - 50%.

4. amplification du virus

1. Semences et cultiver des cellules HEK293A à 90% de confluence sur un cm boîte de culture 14 tissulaire.
2. Infecter les cellules avec la moitié du lysat de virus primaire (1,5 - 2,5 ml) et incuber les cellules pendant au moins 36 h. Presque toutes les cellules devraient être infectés puis, qui peut être déterminé par microscopie à fluorescence. Pour la ré-amplification d'un stock de virus déjà amplifié (soit plus concentré), infecter HEK293A à une multiplicité d'infection (MOI) de 50 (voir 6.3).
3. Les cellules doivent être récoltées lorsque tous d'entre eux montrent CPE mais avant détachement. Avec une production efficace du virus cet état est atteint dans les 48 heures après l'infection. (Si cela prend jusqu'à une semaine, envisager un autre cycle d'amplification en augmentant la quantité de stock de l'adénovirus utilisé pour l'infection décrite au point 4.2.)
4. Détacher les cellules par pipetage doux et des cellules de transfert et SN pour un tube en polystyrène de 50 ml. Spin cellules vers le bas à 300 g pendant 10 min à 4 ° C.
5. Retirez le SN et remettre le culot dans un volume approprié de milieu ou SN (environ 1 ml).
6. Effectuez 3 F / TC de perturber les cellules et centrifuger à 800 xg pendant 15 min à 4 ° C. Enlevez le SN qui contient les particules de virus (c'est à dire le lysat de virus concentré), et aliquote du lysat de virus de la stocker à -80 ° C.

5. Virus Détermination du titre

1. Seed 10 ⁵ cellules A549 par puits en 5 puits d'une plaque de 12 puits dans 1 ml de milieu et de laisser cellules adhèrent pendant 6 heures.
2. Utilisez 1 pl de l'adénovirus concentré (décongelé sur glace) pour effectuer une dilution en série dans le milieu (1:5000, 1:10.000, 1:50.000, 1:100.000) et ajouter 10 ul par puits. Laissez un bien non infecté pour régler le déclenchement en cytométrie en flux.
3. Après 36 heures, enlever le SN, lavez avec PBS, les cellules et détachement (par exemple par traitement à la trypsine). Pour les précautions risques biologiques, il est recommandé de fixer caunes de 100 pi paraformaldéhyde 4% dans du PBS pendant 10 min à température ambiante et lavage avec du PBS seule fois.
4. Effectuer une analyse FACS de l'expression du marqueur d'infection. Plot 'ul lysat viral appliquée »contre le nombre absolu de cellules infectées (figure 4). Déterminer la plage linéaire de l'infection et de calculer le titre par ml de virus non dilué à partir de la courbe d'étalonnage sur la plage linéaire avec x = 1000 pl.

6. L'infection des cellules T

1. Isoler les cellules T CD4 naïfs / repos de DO11.10 tg; souris Tg CARΔ1 utilisant MACS (T CD4 + naïves cellulaire Isolation Kit II) ou FACS (CD4 + CD25 + CD44-CD62L-).
2. Pour les expériences à petite échelle, une pipette un volume approprié de lysat viral pour atteindre une MOI de 50 dans un puits d'une plaque de 96 puits à fond rond.
3. Ajoutez jusqu'à 4 x 10 ⁵ cellules T dans un volume d'infection final de 50 ul dans un milieu de cellules T (RPMI1640, 10% de FBS, 5% Penstrep, 5% NaPyruvate, 1x NEAA, 1x MEM Essentialvitamine, 1x L-glutamine, 1:250.000 Mercaptoéthanol, HEPES 10 mM).
   Exemple:
   Une MOI de 50 doivent être utilisés pour infecter 3 x 10 ⁵ cellules T; le titre viral est de 3 x 10 ⁹ ml ^-1
   volume de virus = MOI x T numéro de cellulaire / titre viral = 50 x (3 x 10 ⁵⁾ / (3 x 10 ⁹ ml ^-1) = 0,005 ml

Note: pour une infection du nombre de cellules plus grandes, l'échelle en utilisant une MOI de 50 dans un volume d'infection de 165 pi par 10 ⁶ cellules T naïves dans un tube de polystyrène avec la tasse lâche (jusqu'à tp 3 ml par tube).

4. Incuber les cellules pendant 90 min à 37 ° C dans 5% d'un incubateur à CO _2.
5. Isoler les cellules à 300 g pendant 5 min à température ambiante, enlever SN, remettre en suspension dans 200 pi de PBS. Centrifuger de nouveau et décoller SN.

(Facultatif: les cellules peuvent être lavées à nouveau pour supprimer le virus plus efficacement)

6. Remettre les cellulesdans 200 pi de milieu de cellules T sans anticorps stimulant et sans IL-2 ou d'autres cytokines et les reposer pendant 40 heures à 37 ° C dans un 5% de CO ₂ incubateur pour permettre l'expression du gène d'intérêt avant l'activation.

7. Activation des cellules T et de la polarisation

1. Pipette un volume d'anti-CD3 et perles anti-CD28 couplés qui est égal au nombre de cellules (par exemple 4 x 10 ⁵⁾ dans une petite tasse de réactif, ajouter le volume 10 fois de PBS et mettez-les sur un aimant pour 2 min . Enlever le surnageant et remettre en suspension les perles dans 200 pi de milieu polarisant (pour les Tregs: milieu de cellules T + 1 ng / ml TGFß, 100 U / ml d'IL-2).

Note: Les cellules peuvent également être activés à l'aide des boîtes de culture de tissu recouvertes d'anticorps anti-CD28 et anti-CD3, ou d'une manière spécifique du récepteur DO11.10 cellules T en utilisant irradiés splénocytes BALB / c pulsées avec de l'ovalbumine 323-339 antigène peptidique.

2. Centrifuge le reposa cellules comme avant, enlever le SN et remettre les cellules dans 200 ul milieu polarisant contenant des anticorps anti-CD3 et anti-CD28 anticorps couplés à des perles. Incuber pendant 72 heures à 37 ° C dans un 5% de CO ₂ incubateur sans changer de support.

8. T Fixation cellulaire et coloration pour cytométrie en flux

1. Laver les cellules: Isoler les cellules à 300 g pendant 5 min à température ambiante, enlever SN, remettre en suspension dans 200 pi de PBS. Centrifuger de nouveau et décoller SN. Effectuez toutes les étapes de lavage suivantes en conséquence.
2. Reprendre les cellules dans 100 ul solution fixable de coloration de cellules mortes et incuber pendant 30 min à 4 ° C.
3. Laver les cellules, remettre en suspension dans 100 pi de PBS, ajouter 100 ul paraformaldéhyde 4% dans du PBS, incuber 15 min à température ambiante.
4. Laver les cellules, les remettre en suspension dans 200 pi glacée 70% de méthanol dans du PBS et incuber pendant 30 min sur la glace.

Note: Les cellules peuvent être traités à partir de maintenant sans précaution Biohazard!

5. Préparer 60 pl mélange-maître de 60 pi de PBS + 10 pg / ml Fc-bloc (anti-FCR3 pour bloquer la liaison non spécifique). Laver les cellules, les remettre en suspension dans 40 pl de PBS + anti-FCR3 et incuber 15 min à température ambiante.
6. Ajouter 20 ul de PBS + anti-FCR3 contenant 1 pg d'anticorps anti-Foxp3 PE-couplé, bien mélanger et laisser incuber à 4 ° C pendant la nuit.
7. Laver les cellules deux fois dans du PBS et analyser les cellules sur un cytomètre de flux.

Résultats

La production de virus

Pour la production de titres élevés de virus, le moment de la récolte des cellules HEK293A dans la production primaire du virus ou d'amplification du virus est cruciale. Représentant images de contraste fluorescents et en phase avec les signes visuels de la production de virus sont présentés dans la figure 3. Le CPE a été observée 10 jours après transfection de cellules HEK293A avec un pCAGAdDu contrôle vectoriel sans insert. CPE sont carac...

Discussion

Génération Virus et titrage

Pour obtenir des résultats de transfection optimales, la qualité et la quantité de vecteur linéarisé semblent les plus importants. Nous n'avons pas observé d'effets négatifs sur la production de lysat primaire d'une prolifération initiale de la culture depuis l'infection va procéder rapidement une fois que la production de virus efficace se produit. Cependant, la production de virus par les cellules HEK293A peut être affectée par de longs...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
pENTR/D-TOPO Cloning Kit	Invitrogen	K240020
Gateway LR Clonase II Enzyme mix	Invitrogen	11791020
PacI	New England Biolabs	R057S
jetPEI	Polyplus-transfection	101-10N
HEK293A Cell Line	Invitrogen	R705-07
A549	ATCC	CCL-185
6-well plates	BD Falcon	353046
14 cm tissue culture dish	Nunc	168381
BALB/cJ-Tg(DO11.10)10Dlo Tg(CARΔ1)1Jdgr	Taconic Farms	Model Nr. 4285
Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II	Miltenyi Biotech	130-094-131
DMEM	Invitrogen	41966-052
FBS	PAN Biotech	1502-P110704
PenStrep	Invitrogen	15140-122
RPMI 1640	Lonza	BE12-167F
NaPyruvate	Lonza	BE13-115E
NEAA 100x	Lonza	BE13-114E
L-Glutamine	Invitrogen	25030
HEPES Buffer Solution (1 M)	Invitrogen	15630-056
β-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M-7522
MEM Essential vitamin mixture (100x)	Lonza	13-607C
Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28 for Cell Expansion and Activation	Invitrogen	114-56D
Recombinant Human TGF-beta 1	R&D Systems	240B
Proleukin S (18 x 106IE)	Novartis
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit	Invitrogen	L-23105
Mouse BD Fc BlockT	BD Pharmingen	553141
Anti-Mouse/Rat Foxp3 PE	eBioscience	12-5773-82
Mmu-miR-155 TaqMan MicroRNA Assay	Roche Applied Biosystems	4427975
LightCycler 480 Probes Master	Roche Applied Biosystems	04902343001
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit	Roche Applied Biosystems	4366596