나이브 CD4의 아데노 바이러스 형질은 Treg의 분화를 연구하는 세포를 T

요약

순진 CD4 콕 사키 아데노 바이러스 수용체의 유전자 발현과 T 세포에 아데노 바이러스 유전자 전달은 규제 T 세포 분화의 분자 분석을 가능하게 체외에서.

초록

규제 T 세포 (Tregs의)는 자체뿐만 아니라 특정 외국 항원에 대한 면역 내성을 제공하기 위해 필수적입니다. Tregs의는 TGFβ와 IL-2의 존재 TCR과 공동 자극 체외 순진 CD4 T 세포에서 생성 할 수 있습니다. 이 미래의 치료를위한 엄청난 잠재력을지지하지만, 분자 신호 전달 경로 제어 차별은 대부분 알 수 있다고.

기본 T 세포는 자궁외 유전자 발현을 조작하지만, 일반적인 방법은 일차 항원 인식 이전에 T 세포의 가장 중요한 순진 상태를 대상으로 실패 할 수 있습니다. 여기, 우리는 Treg 분화를 유도하기 전에 체외에서 순진 CD4 T 세포의 이소성 유전자를 표현하는 프로토콜을 제공합니다. 그것은 복제 결핍 아데노 바이러스 전달을 적용하고 그 생성 및 생산을 설명합니다. 아데노 바이러스는 대량 삽입 (최대 7 KB) 걸릴 수 있습니다 및 높은 과도 overexp을 달성하기 위해 발기인을 장착 할 수 있습니다T 세포 ression. 그들은 형질 전환 콕 사키 아데노 바이러스 수용체 (CAR)을 표현하면 효과적으로 순진 마우스 T 세포를 transduces. 중요한 것은 감염 후 T 세포가 순진 유지 (CD44 ^낮은 CD62L ^높은)과 휴식 (CD25 ^- CD69 ^-)과는 Tregs의에 감염되지 않은 세포와 유사한 활성화하고 차별화 할 수 있습니다. 따라서,이 방법은 처음부터 CD4의 T 세포 분화의 조작을 할 수 있습니다. 그것은 초기 TCR 자극의 초기 신호 이벤트가 결국 차별화를 Treg으로 이어질 세포 변화를 유도 할 때 자궁외 유전자 발현이 이미 보장합니다.

서문

Tregs의 면역 관용을 유지하고 지나친 면역 반응을 저해하는 중요합니다. Tregs의는 방관자 T 세포의 활성화를 억제합니다. 따라서, Tregs의의 제거가 활성화 된 T 세포 ^1에 의해 구동 치명적인자가 면역과 자기 파괴에 이르게한다. Tregs의는 CD4 단일 긍정적 인 전구체의 부정적인 선택시 흉선에서 개발하지만, 그들은 또한 차선의 공동 자극 ^1,2 낮은 복용량 항원의 자극에 따라 순진 CD4 T 세포에서 주변에 구별 할 수 있습니다. 주변 Tregs의이 용기 나 폐에 내성을 제공 연루되어있다 반면 흉선 Tregs의는 자기 항원에 대한 조직의자가 면역을 억제하는 것 같습니다. 이러한 유도 Tregs의이 유력 음식과 공기, 공생 세균 및 알레르기 ^3,4에서 환경 항원을 포함하여 점막 외국 항원을 인식 한 후 T 세포의 활성화를 방지합니다. 또한, Tregs의 태아 펩티드에 산모의 허용 오차 ^5를 구축하고 사전에 중요하다환기 이식편 대 숙주 질환 ^6. 동시에, Tregs의도 ^7,8 종양 세포의 면역 감시를 감쇠에 의해 원치 않는 효과를 중재. Tregs의의 특징 기능은 하위 - 지정하는 전사 인자 Foxp3의 필요와 기능 ^9,10 Treg 부여하기에 충분 포크 헤드 도메인을 포함하는 전사 인자의 표현이다. Foxp3의 발현을 유도 할 수있는 몇 가지 신호 전달 경로가 알려져있다. 하지만, 제어, 규제, 또는 트리거 T 세포 수용체에 대한 응답으로 차별화를 Treg 조절하는 분자 프로세스는 덜 잘 이해하고 있습니다.

Tregs의 매우 효율적으로 TGFβ와 IL-2 ^(11)의 존재 반대로 CD3와 anti-CD28 항체 순진 CD4 T 세포의 자극을 통해 체외에서 유도 할 수 있습니다. 새로운 Tregs의 생체, Treg 분화를 촉진 분자의 조작에 기능적으로 미래 therapi에 대한 엄청난 잠재력을 품는다ES 예를 들어, 천식 치료, 크론 병, 및 이식 ^11,12. 반대로, Treg 차별화를 차단하는 분자의 치료 변조 종양 환자의 복합 치료의 향후 접근 방법의 이점을 제공 할 수 있습니다.

체외 분화 분석에서 T 세포 부분 집합의 분화와 관련된 분자 변화에 대한 설명은 쓸모있다. 순간, 검색 또는 제어 T 세포 분화가 자궁외 유전자 발현의 가장 일반적인 방법은 순진 T 세포에서 실패한다는 사실에 의해 방해되는 유전자 제품의 화면으로 실험하려고합니다. 예를 들어, 일렉트로와 레트로 바이러스 전달이 활성화 된 T 세포에만 효과가 있습니다. 초기의 기대, 휴식 세포에서 일반적으로 효과적입니다 렌티 바이러스 전달, 대조적으로 사이토 카인 ^13만큼 순진 T 세포의 사전 활성화가 필요합니다. 또한, 일렉트로 동안의 cDNA 또는 발현의 전송자체가 T 세포 활성화의 기능을 부여하고 심지어 칼슘 ^{2 +} 신호를 동원 할 수 세포막의 탈분극을 포함 하고 NFAT 단백질 (미발표 관찰과 REF. ¹⁴⁾ 활성화합니다. 40 시간 - 마찬가지로, 레트로 바이러스 전달을 위해, 순진 T 세포는 18 활성화해야합니다. 이 시간 동안, 세포 분열의 과정에서 핵 막 고장이 발생하고 레트로 바이러스 벡터 ^15의 후속 게놈 통합 할 수 있습니다. 이러한 방법은 따라서 헬퍼 T 세포 분화의 결정적인 단계이다 항원과 초기 T 세포 발생의 초기 분자 규제를 해결 할 수 없습니다.

아데노 바이러스 전달은 인간의 콕 사키 아데노 바이러스 수용체 (CAR)을 표현하는 인간의 세포 유형의 숫자​​에 과도 자궁외 유전자 발현을 부여하는 것으로 알려져있다. 그것은 세포 활성화 또는 세포주기의 진행에 대한 요구 사항없이 진행됩니다. C의 표면 발현AR 효율적인 바이러스 부착 및 국제화를 위해 필수적이며, T 세포 특이 적 프로모터에 따라 절단 된 버전 CARΔ1의 유전자 발현 아데노 바이러스 감염 ^16에 감염 마우스 흉선 세포 및 T 세포를 렌더링하는 발견되었다. 중요한 유전자는 흉선 세포 발달을 변경하지 않거나 순진 CD4의 체외 분화 서로 다른 하위 집합으로 셀 (데이터 표시되지; 심판 ^17.) 마. T 세포의 아데노 바이러스 - 매개 형질는 이전에 접근 ^19,20 발현 ^17,18에 사용되며 노크 다운되었다. 형질 전환 된 T 세포는 시판 DO11.10 TG에서 정제 될 수있다 CARΔ1 TG (코닉, 주식 회사와 REF ^17.). 중요한 것은, 아데노 바이러스 전달이 활성화 명백한 증거를 유도하지 않고 순진 T 세포에 대한 관심의 유전자의 고 발현 할 수 있습니다. T 세포는 순진 유지 (CD44 ^낮은 CD62L ^높은)과 휴식 (CD25 ^- CD69 ^-) 후 infecti에 비에 감염된 세포와 유사한 Treg으로 활성화하고 차별화 할 수 있습니다.

재조합 아데노 바이러스 생산은 아데노 바이러스 플라스미드 (그림 1) HEK293A 세포의 형질 전환 한 후 얻을 수 있습니다. 이 플라스미드는 일반적으로 복제 무능한 재조합 아데노 바이러스 ^21을 렌더링 삭제 E1 및 E3 유전자와 인간 유형 5 아데노 바이러스 게놈을 포함합니다. 그들은 전단 아데노 바이러스 ^(22)의 안정적 통합을 통해 불후의 한으로 HEK293A 세포가 복제 결핍을 보완. 아데노 바이러스 벡터가 큰 (~ 40 KB) 결과적으로 잘 기존의 제한 효소 중재 복제에 적합하지 않습니다 때문에, 우리는 게이트웨이 시스템을 채택했다. 관심의 유전자는 처음에 쉽게 람다 재조합 반응 (LR) ^23를 통해 아데노 바이러스를 대상 벡터에 전송 될 수있는 작은 입력 벡터로 복제됩니다. 우리는 pCAGAdDu 벡터를 생성원핵 ccdB 선택 마커 ^{24 측면을} 노릴 LR 사이트를 포함하는 발현 카세트 CAG 프로모터 (닭 액틴 프로모터 및 CMV 증강)을 결합하여. 이 발현 카세트 소 성장 호르몬 폴리 (A) 신호를 포함하는 시퀀스 융합 진핵 세포 감염 마커 강화 된 녹색 형광 단백질 (EGFP)의 coexpression 수 있도록 내부 ribosome 항목 사이트 (IRES) 요소가 융합되어 있습니다. 프로토 타입 CMV 프로모터가 매우 활성화에 의존하고 순진 T 세포의 유전자 발현 그러므로 불리한 것으로 발견 된 이후 우리는 CAG CIS 규제 시퀀스를 선택했다.

여기, 우리는 체외 Treg의 분화 효율을위한 프로토콜 및 활성화 (그림 2)하지 않고 순진 CD4 T 세포를 형질 도입하는 방법을 제공합니다. 방법은 자궁외 유전자 발현을 활성화하거나 순진 상태에서 위의 CD4에게 T 세포 분화를 노크. 그것은 overexpresse의 효과를 테스트 할 수 있습니다T 세포 부분 집합의 약속까지 초기 TCR 자극에 따라 초기 신호 이벤트 기간 동안 관심의 D 유전자. 우리의 검증 실험은 Th2 사이토 같은 살전 다른 T 세포 집합, Th9, Th17의, TH22, 또는 TFH 세포의 분화와 비슷한 아데노 바이러스 응용 프로그램을 구축하는 기초를 제공합니다.

프로토콜

1. 입력 벡터에 관심 유전자의 클로닝

1. 입력 벡터로 관심의 유전자를 복제합니다. 국소 이성화 효소 결합 벡터 (예 : pENTR / D-TOPO) 또는 제한 효소 중재 복제이 절차를 사용할 수 있습니다에 무딘 엔드 내고 다음 유전자의 PCR 증폭.

2. pCAGAdDu 대상 벡터에 관심있는 유전자를 전송

1. LR 재조합 (예 : 게이트웨이 LR Clonase II 효소 믹스)하여 대상 벡터에 입력 벡터의 관심의 유전자를 전송합니다. 이 아데노 바이러스 발현 벡터 (그림 1)을 생성합니다.
2. , PACI 제한 다이제스트에서 아데노 바이러스 발현 벡터의 10 μg을 선형화 DNA를 침전하고 100 μL 당 μg의 농도로 물에 resuspend을. 선형화 V의 복제 및 encapsidation에 필요한 바이러스 거꾸로 반복 (ITR)를 줘라바이러스 입자에 iral DNA.

3. 기본 바이러스 해물의 생성

1. 시드 1 개 6 잘 플레이트 잘 하나 2 ㎖ 세포 배양액 10 ⁵ HEK293A 세포 (DMEM 10 % FBS, 5 % PenStrep)와 6의 세포를 배양 - 37 14 시간 10 % ° C CO ₂ 배양기 그들을 준수 할 수 있도록합니다. 세포는 자랄 때 약 50 %이어야한다.
2. Lipofection : 전송 염화나트륨 50 μM, 소용돌이 짧게 94 μL로 jetPEI 시약 6 μL. 소용돌이로 교반하면서 100 ㎕의 선형화 된 아데노 바이러스 벡터의 혼합 용액을 추가하고 15이 형질 혼합 배양 - 실온에서 30 분.

아데노 바이러스 감염에 대한 적절한 바이오 안전성 조건에서 다음의 모든 단계를 수행합니다!

3. HEK293A 세포 함유도에 적가 솔루션을 분배하고 37 세포를 품어 ° C와 10 % CO _2. 형광 마커를 사용하는 경우, transfe를 평가시각적 12 후 ction의 효율 - 거꾸로 형광 현미경을 사용하여 36 시간. 신선한 매체의 0.5 ML 3 일마다 추가합니다.
4. 분리하기 시작 확대와 둥근 세포 영역입니다 변성 효과 (CPE)에 대한 빛 또는 형광 현미경을 가진 3 일 - 매 2를 확인합니다. 이 효율적으로 바이러스 생성을 나타내는 것입니다. CPE의 넓은 영역 (그림 3)의 발생에 따라, 그것은 24 소요됩니다 - 72 시간 모든 세포가 감염되기 전에.
5. 모든 세포는 CPE의 흔적을 보여 주지만, 세포의 전반적인 박리가 발생하기 전에, 상층와 부드러운 피펫 및 전송 세포 (SN, 3-5 ml)에 의해 세포를 분리 할 때 15 ML의 폴리스티렌 튜브.
6. 15 드라이 아이스의 SN에 세포를 동결 - 20 분 파열 세포에 ° C 이후 37 신속하게 해동. 이 동결 및 해동 사이클 (F / TC)를 두 번 더 반복합니다. 일 안에 사용을 위해 얼음에 기본 바이러스 해물을 유지 또는 -80 ° C 장기 저장을 위해 동결. 추가 F/ TC 30에 의해 바이러스 역가를 줄일 수 있습니다 - 50 %.

4. 바이러스 증폭

1. 씨와 14 센티미터 조직 배양 접시에 90 %의 합류로 HEK293A 세포를 성장.
2. 기본 바이러스 해물 (1.5-2.5 ML)의 절반 세포를 감염 적어도 36 시간 동안 세포를 품어. 거의 모든 세포는 형광 현미경에 의해 결정 될 수있는 다음 감염해야한다. 이미 (더 집중 즉) 증폭 된 바이러스 주식의 재 증폭, 50의 감염의 다중성 (MOI) (6.3 참조) HEK293A를 감염.
3. 그들 모두는 CPE를 표시하지만, 분리되기 전 세포를 수확해야한다. 효율적인 바이러스 생산이 상태는 감염 후 48 시간 이내의 거리에 있습니다. (이것은 1 주일까지 소요되는 경우, 4.2에 설명 된 감염에 사용되는 아데노 바이러스 주식의 양을 증가 증폭의 또 다른 라운드를 고려한다.)
4. 50 ML의 폴리스티렌 튜브에 부드러운 피펫 및 전송 세포와 SN하여 세포를 분리. 4 10 분 ° C.에 대한 300 XG에서 세포를 스핀 다운
5. SN를 제거하고 중간 SN (ca. 1 ML)의 적절한 볼륨 펠렛을 resuspend을.
6. 4 ℃에서 15 분 800 XG에서 세포와 원심 분리를 방해하는 3 F / TC를 수행 (집중 바이러스 해물 즉) 바이러스 입자를 포함 SN을 벗고 나누어지는 바이러스 해물은 -80를 저장 ° C.

5. 바이러스 역가 결정

1. 씨앗 10 ⁵ A549 세포를 잘 당에 1 ML 매체와 세포가 6 시간 동안 준수하게에 12 잘 플레이트의 5 우물.
2. 중간에 시리얼 희석 (1:5,000, 1:10,000, 1:50,000, 1:100,000)을 수행하고, 잘 당 10 μl를 추가하는 집중 아데노 바이러스 (얼음에 해동) 1 μl를 사용합니다. 유동 세포 계측법에 게이트를 조정 한 잘 감염되지 않은 둡니다.
3. 36 시간 후, PBS 및 분리 세포 (예를 들어, 트립신에 의해)로 씻어, SN를 벗어. 생물주의 사항은, 그것은 C를 해결하는 것이 좋습니다10 실온에서 분간 PBS 한 번에 세척을위한 PBS 100 μL 4 % 파라 포름 알데히드의 ELL 학생.
4. 감염 마커 표현의 FACS 분석을 수행합니다. 플롯 감염된 세포의 절대 수 (그림 4)에 'μL 바이러스 해물 적용된'. 감염의 선형 범위를 결정하고 X = 1,000 μL를 사용하여 선형 범위의 표준 곡선으로부터 희석 바이러스의 ML 당 역가를 계산합니다.

6. T 세포 감염

1. 에서 휴식 / 순진 CD4 T 세포를 분리 DO11.10 TG, MACS (나이브 CD4 + T 세포 분리 키트 II) 또는 FACS는 정렬을 사용하여 CARΔ1 TG 마우스 (CD4 + CD25-CD62L + CD44-).
2. 소규모 실험, 96 - 웰 둥근 바닥 플레이트 잘 하나에 MOI 50를 달성하기 위해 바이러스 해물의 적절한 볼륨을 피펫.
3. T 세포 배지에 50 μL의 최종 감염 볼륨 (RPMI1640, 10 % FBS, 5 % PenStrep, 5 % NaPyruvate, 1X NEAA, 1X MEM 필수에 4 × 10 ⁵ T 세포를 추가비타민, 1X L-글루타민, 1:250,000 메르 캅토 에탄올, 10 MM HEPES).
   예를 들면 :
   MOI 50는 3 × 10 ⁵ T 세포를 감염하는 데 사용되어야한다; 바이러스 역가가 3 × 10 ⁹ ML ^-1
   바이러스 양 = MOI X T / 휴대폰 번호 / 바이러스 역가 = 50 × (3 × 10 ⁵⁾ (3 × 10 ⁹ ML ^-1) = 0.005 ML

참고 : 느슨한 컵 (튜브 당 TP 3 ML까지)와 폴리스티렌 튜브 10 ⁶ 순진 T 세포 당 165 μL의 감염 볼륨 MOI 50를 사용하여 큰 세포 수, 규모의 감염.

4. 5 % CO ₂ 배양기에서 37 ° C에서 90 분 동안 세포를 품어.
5. 상온에서 5 분 300 XG에서 세포를 스핀 다운, 200 μl의 PBS에 resuspend을 SN을 벗어. 다시 원심 분리 SN을 벗어.

(선택 사항 : 세포를보다 효율적으로 바이러스를 제거하기 위해 다시 세척 할 수있다)

6. 세포를 resuspend200 μL T 세포 자극 항체가없는 및 IL-2 또는 다른 사이토 카인없이 중간 37 40 시간 동안 그들을 나머지 5 % CO ₂ 배양기에서 ° C가 활성화되기 전에 그 유전자의 발현을 허용합니다.

7. T 세포 활성화 및 편광

1. 의 볼륨 항 CD3와 작은 시약 컵에 휴대폰 번호 (예 : 4 × 10 ^5)에 해당 안티 CD28 결합 비즈를 피펫, PBS의 10 배 볼륨을 추가하고 2 분 동안 자석에 올려 . 상층 액을 취하여 200 μL 편광 매체 구슬 (Tregs의 경우 : T 세포 배지 + 1 NG / ML TGFβ, 100 U / ML IL-2) resuspend을.

참고 : 셀은 또한 안티 CD28 및 안티-CD3 항체로 코팅 조직 배양 접시를 사용하여 활성화 할 수 있습니다, 또는 알부민 323-339 펩타이드 항원 펄스 조사 BALB / C 비장 세포를 사용하여 DO11.10 T 세포 수용체 특정 방식으로합니다.

2. Centrifug전자는 이전과 같이 세포를 휴식, 200 포함 μL 편광 중간 항 CD3를 및 안티 CD28 항체 결합 비즈 SN과를 Resuspend 세포를 벗어. 매체를 변경하지 않고 5 % CO ₂ 배양기에서 37 ° C에서 72 시간 동안 배양한다.

8. T 세포 고정 및 유동 세포 계측법에 대한 염색

1. 세포를 씻으 : 상온에서 5 분 300 XG에서 세포를 스핀 다운, 200 μl의 PBS에 resuspend을 SN을 벗어. 다시 원심 분리 SN을 벗어. 따라서 다음의 모든 세척 단계를 수행합니다.
2. 100 μL 고칠 수 죽은 세포 염색 용액에 세포를 resuspend을 4에서 30 분 동안 품어 ° C.
3. 세포를 씻으, 100 μL PBS에 resuspend을, PBS, RT에서 부화 15 분에 100 ㎕의 4 % 파라 포름 알데히드를 추가합니다.
4. 세포를 씻으, PBS 200 μL 얼음처럼 차가운 70 % 메탄올에서 그들을 resuspend을하고 얼음에 30 분간 배양한다.

참고 : 세포 생물주의하지 않고 지금부터 취급 할 수 있습니다!

5. 60 μL의 마스터 믹스 60 μL PBS + 10 ㎍ / ㎖ FC-블록 (불특정 바인딩을 차단하는 안티 FCR3). 준비 세포를 씻어 PBS + 안티 FCR3의 40 μL에서 그들을 resuspend을하고 RT에서 15 분 알을 품다.
6. 20 μl를 추가 PBS + 안티 FCR3 1 μg PE-결합 방지 Foxp3의 항체를 포함, ° C 하룻밤 4에 잘 혼합 배양.
7. PBS로 두 번 세포를 씻으과 흐름 cytometer에 대한 세포를 분석 할 수 있습니다.

결과

바이러스 생산

높은 바이러스 역가의 생성의 경우, 기본 바이러스 생산 또는 바이러스 증폭 HEK293A 세포 수확의 타이밍이 중요합니다. 바이러스 생산의 시각적 징후와 대표 형광 및 위상 콘트라스트 이미지는 그림 3에 표시됩니다. CPE는 십일 삽입하지 않고 제어 pCAGAdDu 벡터 HEK293A 세포의 형질 전환 한 후 관찰 하였다. CPE는 감염 마커 GFP의 높은 발현을 분리하고 전시...

토론

바이러스 생성 및 적정

최적의 형질 결과, 선형화 된 벡터의 질과 양이 가장 중요 나타납니다. 감염이 빠르게 번 효율적인 바이러스 생산이 발생 진행할 것이기 때문에 우리는 문화의 초기 전면에 자라 난의 기본 해물 생산에 부정적인 영향을 관찰하지 않았다. 그러나 HEK293A 세포에 의해 바이러스 생산 효율을 감소 긴 삽입에 의해 영향을받을 수 있습니다. 일부 오픈 읽기 프레?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
pENTR/D-TOPO Cloning Kit	Invitrogen	K240020
Gateway LR Clonase II Enzyme mix	Invitrogen	11791020
PacI	New England Biolabs	R057S
jetPEI	Polyplus-transfection	101-10N
HEK293A Cell Line	Invitrogen	R705-07
A549	ATCC	CCL-185
6-well plates	BD Falcon	353046
14 cm tissue culture dish	Nunc	168381
BALB/cJ-Tg(DO11.10)10Dlo Tg(CARΔ1)1Jdgr	Taconic Farms	Model Nr. 4285
Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II	Miltenyi Biotech	130-094-131
DMEM	Invitrogen	41966-052
FBS	PAN Biotech	1502-P110704
PenStrep	Invitrogen	15140-122
RPMI 1640	Lonza	BE12-167F
NaPyruvate	Lonza	BE13-115E
NEAA 100x	Lonza	BE13-114E
L-Glutamine	Invitrogen	25030
HEPES Buffer Solution (1 M)	Invitrogen	15630-056
β-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M-7522
MEM Essential vitamin mixture (100x)	Lonza	13-607C
Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28 for Cell Expansion and Activation	Invitrogen	114-56D
Recombinant Human TGF-beta 1	R&D Systems	240B
Proleukin S (18 x 106IE)	Novartis
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit	Invitrogen	L-23105
Mouse BD Fc BlockT	BD Pharmingen	553141
Anti-Mouse/Rat Foxp3 PE	eBioscience	12-5773-82
Mmu-miR-155 TaqMan MicroRNA Assay	Roche Applied Biosystems	4427975
LightCycler 480 Probes Master	Roche Applied Biosystems	04902343001
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit	Roche Applied Biosystems	4366596