Аденовирусной трансдукции наивного CD4 Т-клеток по изучению Treg Дифференциация

Резюме

Аденовирусные перенос гена в наивных CD4 Т-клеток с трансгенной экспрессии рецептора аденовируса Коксаки позволяет молекулярного анализа регуляторных Т-клеточной дифференцировки В пробирке.

Аннотация

Регуляторные Т-клетки (Treg,) имеют важное значение для обеспечивать иммунную толерантность к себе, а также определенные чужеродные антигены. Tregs могут быть получены от наивных Т клеток CD4 в пробирке с TCR-и совместной стимуляции в присутствии TGF-и ИЛ-2. Это имеет огромный потенциал для будущих терапий, однако, молекулы и сигнальных путей, которые контролируют дифференциации в значительной степени неизвестными.

Первичные Т-клетки можно манипулировать посредством эктопической экспрессии генов, но общие методы не позволяют нацелены на наиболее важных наивных состояние Т-клеток перед первичным распознавание антигена. Здесь мы предоставляем протокол выразить внематочной генов в наивных Т клеток CD4 в пробирке Перед тем как вызвать Treg дифференциации. Это относится трансдукции репликацию аденовируса-дефицитных и объясняет его поколения и производства. Аденовирус может занять до больших вставками (до 7 КБ) и может быть оборудован с промоутерами для достижения высоких и переходные ПЕРЕЭКСПression в Т-клетках. Он эффективно преобразовывает наивные Т-клетки мыши, если они выражают трансгенных аденовирус Коксаки рецепторов (CAR). Важно отметить, что после инфекции Т-клеток остаются наивных (CD44 ^{низкий,} CD62L ^{высокий)} и отдыха (CD25 ^-, CD69 ^-) и может быть активирована и дифференцировались в Tregs похожа на неинфицированных клеток. Таким образом, этот метод позволяет манипуляции дифференциации CD4 Т-клеток с самого начала. Это гарантирует, что эктопическая экспрессия гена уже на месте, когда в начале сигнальных событий начальной стимуляции TCR вызывает клеточный изменения, которые в конечном итоге ведут в Treg дифференциации.

Введение

Tregs имеют решающее значение для поддержания иммунной толерантности и, чтобы ослабить превышение иммунных реакций. Tregs подавлять наблюдателем активацию Т-клеток. Следовательно, абляция Tregs приводит к фатальным аутоиммунные и самоуничтожение обусловлен активированных Т-клеток ^1. Tregs развиваться в тимусе при отрицательной селекции клеток CD4 одним положительным предшественников, но они также могут дифференцироваться в периферии от наивных CD4 Т-клеток при низких дозах антигена стимуляции с субоптимальной костимуляцию ^1,2. Тимуса Tregs кажется подавить ткани аутоиммунные против аутоантигенов, в то время как периферийная Tregs были вовлечены в обеспечении толерантности в кишки или легкого. Эти индуцированные Tregs мощно предотвратить активацию Т-клеток после признания чужеродных антигенов в слизистой оболочке, в том числе экологических антигенов из пищи и воздуха, синантропных бактерий и аллергенов ^3,4. Кроме того, Tregs имеют решающее значение для создания материнской толерантности к плода пептиды ⁵ и предварительновентиляционные трансплантат против хозяина ^6. В то же время, Tregs также посредником нежелательных эффектов путем ослабления иммунного надзора опухолевых клеток ^7,8. Отличительной особенностью Tregs является выражением подмножество указанием Foxp3-фактор транскрипции, вилка-головной домен-содержащий транскрипционный фактор, который является необходимым и достаточным для придания Treg функции ^9,10. Некоторые сигнальных путей, которые могут индуцировать Foxp3 экспрессии, хорошо известны. Однако молекулярные процессы, контроля, регулирования, или модулировать Treg дифференцировка на Т-клеточный рецептор запуска менее понятны.

Tregs может быть очень эффективно индуцированных в пробирке посредством стимуляции наивным Т-клеток CD4 анти-CD3 и анти-CD28 антитела в присутствии TGF-и ИЛ-2 ^11. Поскольку новые Tregs функциональны в естественных условиях, манипулирование молекулами, которые способствуют Treg дифференциации несет огромный потенциал для будущего therapiы, например, при лечении астмы, болезни Крона, и трансплантации ^11,12. С другой стороны, терапевтическое модуляции молекул блокировать Treg дифференциации может принести пользу в будущем подходы комбинированного лечения онкологических больных.

В анализах пробирке дифференциации играют важную роль для описания молекулярных изменений, которые связаны с Т дифференциации подмножество клетки. На данный момент экспериментальные попытки поиска или экран для генных продуктов, которые контролируют дифференцировки Т-клеток препятствует тот факт, что наиболее распространенными методами эктопической экспрессии гена неудачу в наивных Т-клеток. Например, электропорации и ретровирусной трансдукции эффективны только в активированных Т-клеток. В отличие от первоначальных ожиданий, лентивирусов трансдукции, которое обычно эффективны в покоящихся клеток, требует предварительной активации наивных Т-клеток цитокинами ^13. Кроме того, передача кДНК или мРНК во время электропорациивключает деполяризацию мембраны плазмы, которая сама дает особенности активации Т-клеток и может даже мобилизации Са ^{2 +} сигналов и активировать NFAT белков (неопубликованные наблюдения и реф. ^14). Аналогично, для ретровирусов трансдукции, наивные Т-клетки должны быть активированы в течение 18 - 40 часов. В течение этого времени распада ядерной мембраны в процессе клеточного деления происходит и позволяет последующей интеграции геномной ретровирусный вектор ^15. Эти методы являются, следовательно, не в состоянии решать начале молекулярный регулирование начальной Т встречи клетки с антигеном, который является решающей фазе помощник дифференцировки Т-клеток.

Аденовирусной трансдукции, как известно, придают переходных эктопической экспрессии гена в ряде типов клеток человека, которые экспрессируют человеческий рецептор аденовируса Коксаки (CAR). Это продолжается без требования для активации клеток или клеточного цикла. Поверхностную экспрессию CAR необходимо эффективное присоединение вируса и интернализации и трансгенной экспрессии усеченной версии CARΔ1 под Т-клеток промотора было установлено, оказывают мышь тимоцитов и Т-клетки, восприимчивыми к аденовирусной инфекции ^16. Важно отметить, что трансгенов не изменяет тимоцитов развития или в пробирке дифференцировки наивных CD4 Т-клеток в различные подмножества (данные не приводятся; ссылка ^17.). Аденовирус трансдукции Т-клеток был ранее использован для сверхэкспрессию ^17,18 и нокдауна подходы ^19,20. Трансгенных клеток T может быть очищен из коммерчески доступных DO11.10 ТГ; CARΔ1 ТГ (Taconic, Inc и ссылка ^17.). Важно отметить, что аденовирусной трансдукции позволяет с высокой экспрессией гена интереса к наивным Т-клеткам, не вызывая очевидных признаков активации. Т-клетки остаются наивными (CD44 ^{низкий,} CD62L ^{высокий)} и отдыха (CD25 ^-, CD69 ^-) после Infectiна и может быть активирована и дифференцировались в Treg похожа на неинфицированных клеток.

Получение рекомбинантных аденовирусов может быть достигнута после трансфекции клетки HEK293A с аденовирусной плазмиды (фиг. 1). Эти плазмиды обычно содержат человеческий тип 5 геном аденовируса с E1 и E3 генов удален оказывать рекомбинантных аденовирусов репликации некомпетентные ^21. HEK293A клетки дополняют репликации дефицита, как они были увековечены через стабильной интеграции стриженого аденовирус ^22. С аденовирусных векторов большие (~ 40 Kb) и, следовательно, не очень хорошо подходит для традиционных ферментов рестрикции-опосредованной клонирование, мы использовали шлюза системы. Интерес ген первоначально клонировали в меньший входной вектор, из которого можно легко переносить в аденовирусный вектор назначения через лямбда реакции рекомбинации (LR) ^23. Мы построили pCAGAdDu векторпутем объединения CAG промотор (курица промотор актина и энхансер CMV) счет экспрессирующей кассеты, содержащей LR сайтов, фланкирующих прокариотических выбор CCDB маркер ^24. Эта кассета экспрессии слитого с внутреннего входа рибосом (IRES) элемент, который позволяет совместной экспрессии эукариотических инфекции маркер усиленный зеленый флуоресцентный белок (УЗФБ), которые слиты с последовательностью, содержащей бычьего гормона роста поли (А)-сигнала. Мы выбрали CAG цис-регуляторных последовательностей, так как прототип промотор CMV было обнаружено, что чрезвычайно-зависимой активации и, следовательно, неблагоприятных для экспрессии генов в наивным Т-клеток.

Здесь мы приводим протокол для эффективной дифференциации в пробирке Treg и способу для трансдукции наивных CD4 Т-клеток без активации (фиг. 2). Метод позволяет эктопическая экспрессия гена или сбить предыдущего CD4 Т-клеток в наивной государства. Это позволяет тестирования эффекта overexpresseD интересующего гена в раннем сигнальных событий при первоначальной стимуляции TCR до T приверженность подмножество клетки. Наши эксперименты проверки также обеспечивают основу для создания аналогичных приложений аденовирус в дифференцировке клетки других подмножеств T, таких как Th1, Th2, Th9, Th17, Th22, или TFH клеток.

протокол

1. Клонирование гена в векторной записи

1. Клонирование гена в векторной записи. ПЦР-амплификации гена, за которым лигирование тупых концов в топоизомеразы связью вектор (например pENTR / D-TOPO) или рестриктазы-опосредованного клонирование может быть использован для этой процедуры.

2. Перенос гена в вектор назначения pCAGAdDu

1. Передача интересующего гена от векторной записи в целевой вектор на LR рекомбинации (например, шлюз LR Clonase II смеси ферментов). Это создаст аденовирусной вектора экспрессии (рис. 1).
2. Линеаризовать 10 мкг аденовирусного вектора экспрессии в ограничение PacI дайджест, осадить ДНК и ресуспендируют в воде при концентрации 3 мкг на 100 мкл. Линеаризация высвобождает вирусные инвертированные повторы (ITR), которые необходимы для репликации и капсидировани объемИРАЛ ДНК в вирусных частицах.

3. Генерация первичного лизат Вирус

1. Семенной 1 × 10 ⁵ HEK293A клеток в 2 мл клеточной культуральной среде Игла (DMEM, 10% FBS, 5% PenStrep) в одну лунку 6-луночного планшета и инкубировали клетки в течение 6 - 14 ч при 37 ° С в 10% CO ₂ инкубатор, чтобы их придерживаться. Клетки должны быть по крайней примерно 50% слияния.
2. Липофекция: Трансфер 6 мкл реагента jetPEI в 94 мкл 50 мкМ NaCl, вихревые кратко. Добавление смешанного раствора до 100 мкл линеаризованного вектора аденовируса в то время как вортексе и инкубируют эту смесь для трансфекции в течение 15 - 30 мин при комнатной температуре.

Выполните все следующие шаги при соответствующих условиях биобезопасности для аденовирусной инфекции!

3. Разливают каплям раствор на клеточной содержащих HEK293A и инкубировать клетки при 37 ° С и 10% CO _2. При использовании флуоресцентного маркера, оценить Transfeие эффективности визуально после 12 - 36 часов с использованием инвертированного флуоресцентного микроскопа. Добавить 0,5 мл свежей среды каждые 3 дня.
4. Проверка каждые 2 - 3 дней с легкой или флуоресцентный микроскоп для цитопатического эффекта (CPE), которые являются зонах с увеличенным и округлые клетки, которые начинают отделяться. Это свидетельствует об эффективной генерации вируса. При наступлении более широкие зоны CPE (рис. 3), это займет 24 - 72 часов, после чего все клетки инфицированы.
5. Когда все клетки проявляют признаки CPE, но до общего отделение клеток происходит, открепления клеток, осторожно пипеткой и переноса клеток супернатант (SN, 3 - 5 мл) в 15 мл полистирольные трубки.
6. Замораживание клеток в SN на сухом льду в течение 15 - 20 мин и оттаивать их быстро при 37 ° С после этого к разрыву клеток. Повторите этот замораживания-оттаивания и цикла (F / TC) еще два раза. Хранить первичные лизата вируса на льду для использования в течение дня или заморозить при температуре -80 ° С в течение длительного хранения. Любые дополнительные F/ TC приведет к снижению титра вируса на 30 - 50%.

4. Вирус Усиление

1. Семенной и расти HEK293A клетках до 90% слияния на 14 см блюдо культуры ткани.
2. Infect клеток с половиной первичного лизата вируса (1,5 - 2,5 мл) и инкубировали клетки в течение по крайней мере 36 часов. Почти все клетки должны быть заражен, то, что может быть определено с помощью флуоресцентной микроскопии. Для повторного усиления уже усиливается (т.е. более концентрированный) штамма вируса, заражать HEK293A при множественности заражения (МВД) 50 (см. 6.3).
3. Клетки должны быть собраны, когда все из них показывают CPE, но до отряда. С эффективное производство этого вируса состояние достигается в течение 48 часов после заражения. (Если это занимает до одной недели, рассмотрим еще один раунд усиления за счет увеличения количества аденовируса акции использовали для заражения описано в 4.2.)
4. Отделить клетки, осторожно пипеткой и переноса клеток и SN в 50 мл полистирольные трубки. Спин клетки вниз при 300 мкг в течение 10 мин при 4 ° C.
5. Удалить SN и ресуспендируют осадок в подходящем объеме среды или СН (приблизительно 1 мл).
6. Выполнить 3 F / TC для разрушения клеток и центрифугируют при 800 х г в течение 15 мин при 4 ° С. Снимают SN, который содержит вирусные частицы (т.е. концентрированной лизата вируса), и аликвоты вируса лизата хранить его при температуре -80 ° C.

5. Вирус определения титра

1. Семенной 10 ⁵ 549 клеток на лунку в 5 лунки 12-луночного планшета в 1 мл среды и пусть клетки придерживаться течение 6 часов.
2. Используйте 1 мкл концентрированной аденовирус (оттаивали на льду) для выполнения серийных разведений в среде (1:5000, 1:10000, 1:50000, 1:100000) и добавить 10 мкл на лунку. Оставьте одну и неинфицированных регулировать стробирования в проточной цитометрии.
3. После 36 часов, снять С.Н., промыть PBS и отделить клетки (например трипсинизацией). Для биологической меры предосторожности, рекомендуется исправить Cлоктей в 100 мкл 4% параформальдегид в PBS в течение 10 мин при комнатной температуре и промывают один раз PBS.
4. Выполните FACS анализ экспрессии маркеров инфекции. Земля 'мкл вирусный лизат применяться против абсолютного числа инфицированных клеток (рис. 4). Определение линейного диапазона инфекции и расчета титра на мл неразбавленного вирус из стандартной кривой на линейном диапазоне использованием х = 1000 мкл.

6. Инфекция T сотовых

1. Изолировать наивные / отдыха CD4 Т-клеток от DO11.10 TG; CARΔ1 TG мышей с использованием MACS (Наивные CD4 + Т-клеток Изоляция Kit II) или FACS сортировки (CD4 + CD25-CD44 + CD62L-).
2. Для небольших экспериментов, пипетки соответствующий объем вирусный лизат для достижения МВД 50 в одну лунку 96-луночного круглым дном тарелки.
3. Добавьте до 4 × 10 ⁵ Т-клеток в конечном объеме заражение 50 мкл в средней Т-клеток (RPMI 1640, 10% FBS, 5% PenStrep, 5% NaPyruvate, 1x NEAA, 1x MEM Эфирныевитамин, 1x L-глутамина, 1:250000 меркаптоэтанола, 10 мМ HEPES).
   Пример:
   МВД 50 должно использоваться для заражения 3 х 10 ⁵ Т-клеток; Титр вируса составляет 3 × 10 ⁹ мл ^-1
   Вирус объем = х Т МВД номер мобильного / титр вирусов = 50 х (3 х 10 ⁵⁾ / (3 × 10 ⁹ мл ^-1) = 0,005 мл

Примечание: для заражения большего числа клеток, по расширению использования МВД в 50 инфекции объем 165 мкл на 10 ⁶ наивных Т-клеток в полистирола трубка с подвижным чашки (до TP 3 мл на пробирку).

4. Клетки инкубируют в течение 90 мин при 37 ° С в 5% CO _{2-инкубаторе.}
5. Спином вниз клетки при 300 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре, снять С.Н., ресуспендируйте в 200 мкл PBS. Центрифуга снова и снять SN.

(Дополнительно: клетки могут быть снова промывают, чтобы удалить вирус более эффективно)

6. Ресуспендируют клетокв 200 мкл среды Т-клеток без стимулирующих антител и без IL-2 или других цитокинов и остальные их в течение 40 ч при 37 ° С в 5% СО ₂ инкубаторе в возможной экспрессию интересующего гена перед активацией.

7. Активацию Т-клеток и поляризация

1. Внесите объем анти-CD3 и анти-CD28-связанной бисера, равная числу клеток (например, 4 х 10 ⁵⁾ в маленькую чашку реагента, добавьте 10-кратный объем PBS и положил их на магнит в течение 2 мин . Взлет супернатант и ресуспендируют бисером в 200 мкл поляризационной среды (Tregs: Т-клеток среда + 1 нг / мл TGF, 100 U / мл IL-2).

Примечание: Клетки могут быть также активированы с использованием тканевых культуральных чашках, покрытых анти-CD28 и анти-CD3 антитела или в DO11.10 Т-клеточного рецептора конкретным способом с использованием облученных мышей BALB / с спленоцитов импульсного овальбумином 323-339 пептидного антигена.

2. Centrifugе отдыхали клетки как и раньше, снять SN и ресуспендирования клеток в 200 мкл среды, содержащей поляризационными анти-CD3 и анти-CD28-антитело связью бисером. Инкубируют в течение 72 ч при 37 ° С в 5% СО ₂ инкубаторе без смены среды.

8. T Фиксация клеток и окрашивание на проточной цитометрии

1. Вымойте клетки: SPIN вниз клетки при 300 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре, снять С.Н., ресуспендируйте в 200 мкл PBS. Центрифуга снова и снять SN. Выполнение всех следующих стадий промывки соответственно.
2. Ресуспендируют клеток в 100 мкл фиксации мертвой решение окрашивания клеток и инкубировали в течение 30 мин при 4 ° С.
3. Вымойте клетки, ресуспендируют в 100 мкл PBS, добавьте 100 мкл 4% параформальдегида в PBS, инкубировать 15 минут при комнатной температуре.
4. Вымойте клетки, ресуспендируют их в 200 мкл ледяной 70% метанола в PBS и инкубировать в течение 30 минут на льду.

Примечание: Клетки можно рассматривать отныне без биологической меры предосторожности!

5. Подготовка 60 мкл мастер-смеси 60 мкл PBS + 10 мкг / мл Fc-блок (анти-FCR3 блокировать неспецифического связывания). Мытье клетки, ресуспендируют их в 40 мкл PBS + анти-FCR3 и инкубируют 15 мин при комнатной температуре.
6. Добавить 20 мкл PBS + анти-FCR3, содержащей 1 мкг PE-сочетании анти-антитело Foxp3, хорошо перемешивают и инкубируют при 4 ° С в течение ночи.
7. Мытье клетки дважды в PBS и клетки анализируют на проточном цитометре.

Результаты

Вирус Продакшн

Для генерации высоких титров вируса, сроки HEK293A сбора клеток в первичном производстве вируса или усиления имеет решающее значение. Представитель флуоресцентные и фазового контраста изображения с визуальные признаки продукции вируса показаны на рису?...

Обсуждение

Поколение Вирус и титрование

Для получения оптимальных результатов трансфекции, качество и количество векторных линеаризованной представляются наиболее важными. Мы не наблюдали негативных последствий от производства сырья лизат из начальных разрастание культуры с ин...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
pENTR/D-TOPO Cloning Kit	Invitrogen	K240020
Gateway LR Clonase II Enzyme mix	Invitrogen	11791020
PacI	New England Biolabs	R057S
jetPEI	Polyplus-transfection	101-10N
HEK293A Cell Line	Invitrogen	R705-07
A549	ATCC	CCL-185
6-well plates	BD Falcon	353046
14 cm tissue culture dish	Nunc	168381
BALB/cJ-Tg(DO11.10)10Dlo Tg(CARΔ1)1Jdgr	Taconic Farms	Model Nr. 4285
Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II	Miltenyi Biotech	130-094-131
DMEM	Invitrogen	41966-052
FBS	PAN Biotech	1502-P110704
PenStrep	Invitrogen	15140-122
RPMI 1640	Lonza	BE12-167F
NaPyruvate	Lonza	BE13-115E
NEAA 100x	Lonza	BE13-114E
L-Glutamine	Invitrogen	25030
HEPES Buffer Solution (1 M)	Invitrogen	15630-056
β-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M-7522
MEM Essential vitamin mixture (100x)	Lonza	13-607C
Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28 for Cell Expansion and Activation	Invitrogen	114-56D
Recombinant Human TGF-beta 1	R&D Systems	240B
Proleukin S (18 x 106IE)	Novartis
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit	Invitrogen	L-23105
Mouse BD Fc BlockT	BD Pharmingen	553141
Anti-Mouse/Rat Foxp3 PE	eBioscience	12-5773-82
Mmu-miR-155 TaqMan MicroRNA Assay	Roche Applied Biosystems	4427975
LightCycler 480 Probes Master	Roche Applied Biosystems	04902343001
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit	Roche Applied Biosystems	4366596