התמרה adenoviral של CD4 תמימים תאי T ללמוד בידול Treg

Summary

העברת גני adenoviral לתוך CD4 נאיבי תאי T מהונדס עם ביטוי של הקולטן אדנווירוס Coxsackie מאפשרת ניתוח המולקולרי של התמיינות תאי T רגולטורים במבחנה.

Abstract

תאי T רגולטוריים (Tregs) הם חיוניים כדי לספק סובלנות חיסונית עצמי, כמו גם לאנטיגנים זרים מסוימים. יכול להיות שנוצר Tregs מתאי T מסוג CD4 נאיביים במבחנה עם TCR-ושיתוף גירוי בנוכחות TGFβ ו-IL-2. זה נושא פוטנציאל עצום לטיפולים עתידיים, לעומת זאת, המולקולות ומסלולי איתות שבידול שליטה הם במידה רבה לא ידועים.

ניתן להשפיע תאי T עיקריים דרך ביטוי גנים מחוץ לרחם, אך שיטות נפוצות אינן מצליח למקד את המדינה הנאיבית החשובה ביותר של תא T לקראת הכרת אנטיגן העיקרית. כאן, אנו מספקים פרוטוקול לבטא גנים מחוץ לרחם בתאי T מסוג CD4 נאיביים במבחנה לפני גרימת בידול Treg. היא חלה התמרה עם אדנווירוס כפול המחסר ומסבירה הדור והייצור שלה. אדנווירוס יכול לקחת עד מחדיר גדול (עד 7 קילו) והוא יכול להיות מצויד עם יזמים כדי להשיג overexp הגבוהה והחולףression בתאי T. זה למעשה transduces תאי T עכבר נאיביים אם הם מבטאים רצפטור אדנווירוס Coxsackie מהונדס (מכונית). חשוב מכך, לאחר הדבקת תאי T נשארים נאיביים (CD44 ^נמוך, CD62L ^גבוהה) ומנוחה (CD25 ^-, CD69 ^-) ויכול להיות מופעל ומובחן לTregs דומה לתאים שאינם נגועים. לכן, שיטה זו מאפשרת מניפולציה של CD4 התמיינות תאי T מראשיתו. זה מבטיח כי ביטוי גנים מחוץ לרחם כבר נמצא במקום כאשר אירועי איתות ראשונים של גירוי TCR הראשוני גורם לשינויים תאיים שסופו של דבר יובילו לבידול Treg.

Introduction

Tregs הם חיוניים כדי לשמור על סבילות חיסונית ולצנן את התגובות חיסוניות להחטיא. Tregs לדכא הפעלת תא T עובר אורח. כתוצאה מכך, אבלציה של Tregs מובילה לאוטואימוניות הקטלנית והרס עצמי מונעת על ידי תאי T מופעל ^1. Tregs להתפתח בבלוטת התימוס במהלך סלקציה שלילית של CD4 מבשרים אחת חיובי, אבל הם גם יכולים להבחין בפריפריה מתאי T מסוג CD4 תמימים על גירוי אנטיגן במינון נמוך עם ^1,2 שיתוף הגירוי הכי מוצלח. נראה הרתי Tregs לדכא אוטואימוניות רקמה נגד-אנטיגנים עצמיים, ואילו ההיקפי Tregs היו מעורב במתן סובלנות במעי או הריאה. המושרה Tregs אלה potently למנוע הפעלת תא T לאחר הכרה של אנטיגנים זרים ברירית, כולל אנטיגנים סביבתיים ממזון והאוויר, חיידקי commensal, ואלרגנים ^3,4. בנוסף, Tregs הם קריטיים להקמת סובלנות אימהית לעובר ⁵ פפטידים ומראשמחלת שתל נגד מארח פורקן ^6. במקביל, גם Tregs לתווך לוואי בלתי רצוי על ידי הפחתת ערך מעקב חיסונית של תאים סרטניים ^7,8. תכונת ההיכר של Tregs היא הביטוי של-משנה ציון FOXP3 גורם השעתוק, גורם שעתוק המכיל תחום המזלג בראש, כי הוא הכרחי ומספיק להעניק Treg פונקציה ^9,10. כמה מסלולי איתות שיכול לגרום ביטוי FOXP3 ידועים. עם זאת, התהליכים המולקולריים השליטה, להסדיר, או לווסת Treg בידול בתגובה לקולטן תא T מפעילה הם הבינו פחות טובים.

יכול מאוד יעיל להיגרם Tregs במבחנה על ידי הגירוי של תאי T מסוג CD4 נאיביים עם נוגדנים אנטי CD3 ואנטי CD28 בנוכחות TGFβ ו-IL-2 ^11. כTregs מתעורר הם פונקציונליים in vivo, המניפולציה של מולקולות המקדמות בידול Treg נושא פוטנציאל עצום לעתיד therapies, למשל, טיפול באסתמה, מחלת Crohns, והשתלת ^11,12. לעומת זאת, אפנון טיפולי של מולקולות כדי לחסום בידול Treg עשוי לספק תועלת בגישות עתידיות של טיפול המשולב של חולי סרטן.

במבחני בידול במבחנה כבר סייע לתיאור של שינויים מולקולריים הקשורים להתמיינות תאי T משנה. באותו הרגע, ניסיונות ניסיוניים לחיפוש או מסך למוצרי גן שהתמיינות תאי T שליטה הם הקשו על ידי העובדה שהשיטות הנפוצות ביותר של ביטוי גנים מחוץ לרחם להיכשל בתאי T נאיביים. לדוגמה, electroporation ותמרת retroviral הם יעילים רק בתאי T מופעלים. בניגוד לציפיות ראשוניות, תמרת lentiviral, שהוא בדרך כלל יעיל בתאי מנוחה, דורשת מראש הפעלה של תאי T נאיביים ידי ציטוקינים ^13. יתר על כן, ההעברה של cDNA או mRNA במהלך electroporationכרוך בשלילת קוטביות של קרום הפלזמה, שהיא עצמה מעניקה תכונות של הפעלת תאי T ואולי אף לגייס Ca ^{2 +} איתות ולהפעיל את חלבוני NFAT (תצפית ושופט שלא פורסם. ^14). באופן דומה, לתמרת retroviral, תאי T הנאיביים צריכים להיות מופעלים עבור 18 - 40 שעות. במהלך תקופה זו, הפירוט של קרום הגרעין במהלך חלוקת תא מתרחש, ומאפשר לשילוב הגנומי הבא של וקטור retroviral ^15. שיטות אלה אינם מסוגלים להתמודד עם הרגולציה המולקולרית המוקדמת של מפגש ראשוני עם תא T אנטיגן, המהווה את השלב המכריע של התמיינות תאי T מסייע.

התמרה adenoviral ידועה להעניק ביטוי גנים מחוץ לרחם חולף במספר סוגי תאים האנושיים המבטאים את הקולטן אדנווירוס Coxsackie האנושי (מכונית). הוא ממשיך ללא דרישה להפעלת תא או התקדמות מחזור התא. משטח הביטוי של גAR הוא חיוני לקובץ מצורף וירוס יעיל והפנמה, וביטוי מהונדס של הגרסה המקוצצת CARΔ1 תחת אמרגן תא ספציפי T נמצא כדי להבהיר thymocytes העכבר ותאי T הרגישים לזיהום adenoviral ^16. חשוב לציין, transgene אינו משנה thymocyte פיתוח או בבידול מבחנה של CD4 תאי T נאיבי לתוך תת שונים (מידע לא מוצג; נ"צ ^17.). התמרה אדנווירוס בתיווך של תאי T ששימש בעבר לביטוי יתר ^17,18 ועקום למטה גישות ^19,20. יכולים להיות מטוהרים תאי T המהונדס מזמין מסחרי DO11.10 TG; CARΔ1 TG (Taconic, Inc ונ"צ ^17.). חשוב לציין, התמרה adenoviral מאפשרת ביטוי גבוה של גן של עניין בתאי T נאיביים ללא גרימת סימנים ברורים של הפעלה. תאי ה-T נשארים נאיביים (CD44 ^נמוך, CD62L ^גבוהה) ומנוחה (CD25 ^-, CD69 ^-) לאחר infectiוביכול להיות מופעל ומובחן לTreg דומה לתאים שאינם נגועים.

ייצור של adenoviruses רקומביננטי יכול להיות מושגת לאחר transfection של תאי HEK293A עם פלסמידים adenoviral (איור 1). פלסמידים אלה מכילים בדרך כלל את הגנום האנושי אדנווירוס מסוג 5 עם גני E1 ו-E3 שנמחקו כדי להבהיר adenoviruses רקומביננטי שכפול פסול ^21. תאי HEK293A להשלים מחסור שכפול כפי שהם כבר הונצחו באמצעות שילוב יציב של אדנווירוס טעון ^22. מאז וקטורי adenoviral גדולים (~ 40 KB) וכתוצאה מכך לא מתאים גם לשיבוט בתיווך אנזים הגבלה מסורתי, אנחנו עובדים במערכת השער. הגן של עניין הוא משובט תחילה לתוך וקטור כניסה קטן יותר, שממנו ניתן להעביר אותו בקלות לתוך וקטור יעד adenoviral דרך תגובת רקומבינציה מבדה (LR) ^23. אנחנו בניתי את וקטור pCAGAdDuעל ידי שילוב של אמרגן CAG (אמרגן אקטין עוף ומשפר CMV) עם קלטת ביטוי המכילה אתרי LR איגוף סמן בחירת ccdB procaryotic ^24. קלטת ביטוי זה התמזגה לאתר פנימי כניסה הריבוזום (IRES) רכיב המאפשר coexpression של החלבון אוקריוטים זיהום הסמן המשופר הירוק הניאון (eGFP), אשר התמזג רצף המכיל הורמון גדילת פולי השור () אות. אנחנו בחרנו את רצפי cis-הרגולציה חטיבת כלי טיס, שכן אמרגן CMV prototypic נמצא להיות מאוד הפעלה תלויה ושלילי ולכן לביטוי גנים בתאי T נאיביים.

כאן, אנו מספקים פרוטוקול להתמיינות יעילה בTreg מבחנה ושיטה לtransduce תאי T מסוג CD4 תמימים ללא הפעלה (איור 2). השיטה מאפשרת ביטוי אקטופי גן או להפיל מסוג CD4 שקדמו התמיינות תאי T במצב הנאיבי. זה מאפשר לבחון את ההשפעה של overexpresseגן ד של ריבית במהלך אירועי איתות ראשונים על גירוי ראשוני TCR עד מחויבות משנה תא T. ניסויי האימות שלנו גם מספקים את הבסיס להקמת יישום דומה באדנווירוס הבידול של תת קבוצות אחרות כגון תאי T Th1, Th2, Th9, Th17, Th22, או תאי TFH.

Protocol

1. שיבוט של גן של עניין לוקטור כניסה

1. לשבט את הגן של עניין לוקטור כניסה. ההגברה PCR של הגן ואחרי קשירה בוטה סוף לתוך וקטור topoisomerase מצמידים (למשל pENTR / D-TOPO) או הגבלת אנזים בתיווך שיבוט עשוי לשמש להליך זה.

2. העברת הגן של עניין לוקטור יעד pCAGAdDu

1. להעביר את הגן של עניין מוקטור כניסתו לוקטור היעד על ידי רקומבינציה LR (מיקס למשל Gateway LR Clonase השני אנזים). הפעולה זו תיצור וקטור ביטוי adenoviral (איור 1).
2. Linearize 10 מיקרוגרם של וקטור ביטוי adenoviral בפאצ'י הגבלה לעכל, לזרז את ה-DNA וresuspend אותו במים בריכוז של 3 מיקרוגרם לכל 100 μl. ינאריזציה משחררת את החזרות ההפוכות נגיפיות (ITR), אשר נדרשות לשכפול וencapsidation של Vה-DNA iral לחלקיקי נגיף.

3. דור של lysate הווירוס היסודי

1. זרעי 1 x 10 ⁵ תאי HEK293A ב2 תרבות תקשורת סלולרי מ"ל (DMEM, 10% FBS, 5% PenStrep) באחד טוב של 6 גם צלחת ודגירת התאים עבור 6-14 שעות על 37 מעלות צלזיוס ב10% CO ₂ באינקובטור כדי לאפשר להם לדבוק. לאחר מכן תאים צריכים להיות בכ -50% confluency.
2. Lipofection: העברת 6 μl של מגיב jetPEI ל94 μl של 50 מיקרומטר NaCl, בקצרה מערבולת. מוסיף את הפתרון המעורב עד 100 וקטור אדנווירוס ינארית μl תוך vortexing ודגירת תמהיל transfection זה במשך 15 - 30 דקות בטמפרטורת חדר.

לבצע את כל הפעולות הבאות בתנאים המתאימים biosafety לזיהום אדנווירוס!

3. לוותר על פתרון dropwise על התא המכיל גם HEK293A ודגירת התאים ב 37 ° C ו-CO ₂ 10%. בעת שימוש בסמן פלואורסצנטי, להעריך transfection יעילות חזותי לאחר 12-36 שעות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך. הוסף 0.5 מ"ל של מדיום חדש כל 3 ימים.
4. בדקו כל 2 - 3 ימים עם מיקרוסקופ אור או הקרינה לתופעות cytopathic (CPE), שהם אזורים עם תאים מוגדלים ומעוגלים שמתחילים לניתוק. זה מעיד על דור וירוס יעיל. על המופע של אזורים רחבים יותר של CPE (איור 3), זה ייקח 24-72 שעות לפני שכל התאים נגועים.
5. כאשר כל התאים להראות סימנים של CPE, אבל לפני ניתוק כולל של תאים מתרחש, לנתק את התאים על ידי pipetting העדין ותאים עם העברת supernatant (SN, 3 - 5 מ"ל) לצינור פוליסטירן 15 מ"ל.
6. להקפיא את התאים בSN על קרח יבש במשך 15 - 20 דקות ולהפשיר אותם במהירות על 37 מעלות צלזיוס לאחר מכן לקרע התאים. חזור על הקפאה והפשרה, מחזור זה (נ / TC) פעמיים נוספות. שמור lysate הווירוס העיקרי על קרח לשימוש תוך יום או להקפיא אותו ב -80 מעלות צלזיוס במשך אחסון לטווח ארוך. כל F נוסף/ TC יפחית את כייל הנגיף על ידי 30 - 50%.

4. הגברה וירוס

1. זרעים ולגדל תאי HEK293A למפגש 90% על צלחת תרבית רקמת ס"מ 14.
2. להדביק את התאים עם מחצית lysate הווירוס העיקרי (1.5-2.5 מ"ל) ודגירת התאים במשך לפחות 36 שעות. כמעט כל התאים צריכים להיות נגועים לאחר מכן, כפי שניתן לקבוע על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. עבור מחדש ההגברה של מניות וירוס כבר מוגבר (כלומר מרוכז יותר), להדביק HEK293A בריבוי של זיהום (משרד הפנים) של 50 (ראה 6.3).
3. תאים צריכים להיות בצור כאשר כל אחד מהם מראים CPE אבל לפני הניתוק. עם ייצור וירוס יעיל מצב זה הוא הגיע בתוך 48 שעות לאחר הדבקה. (אם זה לוקח עד שבוע, לשקול סיבוב נוסף של הגברה על ידי הגדלת כמות מניות אדנווירוס משמשת לזיהום המתואר ב4.2.)
4. לנתק את התאים על ידי pipetting העדין והעברת תאים וSN לצינור פוליסטירן 50 מ"ל. ספין למטה תאים ב XG 300 עבור 10 דקות ב 4 ° C.
5. הסר את SN וresuspend גלולה בהיקף מתאים של מדיום או SN (1 מיליליטר בקירוב).
6. בצע 3 F / TC לשבש את התאים ו צנטריפוגות ב XG 800 במשך 15 דקות ב 4 ° C. תוריד את מספר סידורי המכיל את חלקיקי הנגיף (כלומר lysate הנגיף המרוכז), וaliquot lysate הווירוס לאחסן אותו ב -80 ° C.

5. קביעת כייל נגיף

1. זרעים 10 ⁵ תאים לכל A549 גם ל5 בארות של צלחת 12 גם במדיום 1 מ"ל ולתת לתאים לדבוק 6 שעות.
2. השתמש μl 1 של אדנווירוס המרוכז (מופשר על קרח) לביצוע דילול סדרתי במדיום (1:5,000, 1:10,000, 1:50,000, 1:100,000) ולהוסיף 10 μl בכל טוב. להשאיר אחד גם נגוע להתאים gating בcytometry הזרימה.
3. לאחר 36 שעות, תוריד את מספר סידורי, לשטוף עם תאי PBS ולנתק (לדוגמה על ידי trypsinization). לקבלת הוראות בטיחות Biohazard, מומלץ לתקן גאמות בparaformaldehyde 4% μl 100 ב PBS למשך 10 דקות בטמפרטורת חדר ולשטוף עם PBS פעם אחת.
4. לבצע ניתוח FACS של ביטוי זיהום סמן. עלילה 'lysate הנגיפי μl ייושם כנגד המספר המוחלט של תאים נגועים (איור 4). לקבוע את הטווח ליניארי של זיהום ולחשב לכל מ"ל של כייל נגיף חי מהעקומה הסטנדרטית על פני הטווח ליניארי באמצעות x = 1,000 μl.

6. זיהום תא T

1. בודד תאי T מסוג CD4 תמימים / מנוחה מDO11.10 TG; עכברי TG CARΔ1 באמצעות MACS (מסוג CD4 + T הנאיבי צינוק ערכה השני) או FACS מיון (מסוג CD4 + CD25-CD44-CD62L +).
2. לניסויים בקנה מידה קטנה, פיפטה נפח מתאים של lysate הנגיפי כדי להשיג משרד הפנים של 50 לאחד גם צלחת תחתונה 96, גם סיבוב.
3. הוסף עד 4 x 10 ⁵ תאי T בנפח סופי זיהום של 50 μl במדיום תא T (RPMI1640, 10% FBS, PenStrep 5%, 5% NaPyruvate, 1x NEAA, 1x ממ חיוניויטמין, 1x-L-גלוטמין, 1:250,000 mercaptoethanol, 10 HEPES מ"מ).
   לדוגמה:
   משרד הפנים של 50 ישמשו להדביק 3 x 10 ⁵ תאי T; כייל הנגיף הוא 3 X 10 ⁹ מ"ל ^-1
   נפח וירוס = משרד הפנים x T מספר תא / כייל נגיף = 50 x (3 x 10 ⁵⁾ / (3 x מיליליטר ^-1 10 ⁹⁾ = 0.005 מ"ל

הערה: לזיהום של מספרים סלולריים גדולים יותר, בקנה מידה של דבר באמצעות משרד הפנים של 50 בהיקף זיהום של 165 μl לכל 10 ⁶ תאי T נאיביים בצינור קלקר עם כוס רופפת (עד 3 מ"ל לכל צינור TP).

4. דגירה תאים עבור 90 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ב5% CO ₂ באינקובטור.
5. ספין למטה תאים ב XG 300 במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר, תוריד את מספר סידורי, resuspend ב200 PBS μl. צנטריפוגה שוב ותוריד את מספר סידורי.

(אופציונלי: התאים עלולים להישטף שוב כדי להסיר את הווירוס באופן יעיל יותר)

6. תאי Resuspendב200 בינונית μl תא T בלי גירוי נוגדנים וציטוקינים אחרים בלי IL-2 או לנוח ו 40 שעות על 37 מעלות צלזיוס ב5% CO ₂ באינקובטור כדי לאפשר ביטוי של הגן של עניין לפני ההפעלה.

7. הפעלת תא T וקיטוב

1. פיפטה בנפח של אנטי CD3-וחרוזים אנטי CD28 מצמידים ששווים למספר התא (לדוגמה: 4 x 10 ⁵⁾ לתוך כוס מגיב קטנה, להוסיף נפח של פי 10 של PBS ולשים אותם על מגנט במשך 2 דקות . קח את supernatant ו resuspend את חרוזי 200 בינוני קיטוב μl (לTregs: בינונית + T תא TGFβ ng / 1 מ"ל, 100 U / ml IL-2).

הערה: ניתן גם להפעיל תאים באמצעות תרבות מנות רקמות מצופות בנוגדנים נגד CD28 ואנטי CD3, או באופן ספציפי לקולטן תא T DO11.10 באמצעות splenocytes BALB / ג מוקרן פעם עם אנטיגן ovalbumin 323-339 פפטיד.

2. Centrifugהדואר נח תאים כמו קודם, תוריד את תאי resuspend SN וב200 בינונית μl קיטוב המכילים אנטי CD3-וחרוזים-CD28 נוגדן אנטי מצמידים. דגירה של 72 שעות על 37 מעלות צלזיוס ב5% CO ₂ באינקובטור ללא שינוי בינונית.

8. קיבוע תא T ומכתים עבור cytometry הזרימה

1. שטוף תאים: ספין למטה תאים ב XG 300 במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר, תוריד את מספר סידורי, resuspend ב200 PBS μl. צנטריפוגה שוב ותוריד את מספר סידורי. לבצע את כל שלבי הכביסה הבאים בהתאם.
2. Resuspend התאים בתמיסת 100 μl ניתן לתקן מת תא מכתים ודגירה במשך 30 דקות ב 4 ° C.
3. שטוף תאים, resuspend ב100 PBS μl, להוסיף paraformaldehyde 4% μl 100 PBS, 15 דקות לדגור על RT.
4. שטוף תאים, resuspend אותם במתנול 70% μl 200 קר כקרח PBS ו דגירה למשך 30 דקות על קרח.

הערה: ניתן לטפל בתאים מעתה והלאה ללא אמצעי זהירות Biohazard!

5. הכן 60 אדון ותמהיל של 60 μl μl PBS + 10 מיקרוגרם / מיליליטר FC-בלוק (אנטי FCR3 לחסום מחייב נוקבים). שטוף תאים, resuspend אותם 40 μl של PBS + אנטי FCR3 ודגירת 15 דקות ב RT.
6. הוסף 20 μl של PBS + אנטי FCR3 המכיל נוגדני 1 מיקרוגרם PE-מצמידים אנטי FOXP3, מערבב היטב ודגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך הלילה.
7. שטפו תאים פעמים PBS ולנתח תאים בcytometer זרימה.

תוצאות

ייצור וירוס

עבור דור של titers וירוס גבוה, העיתוי של מסיק תא HEK293A בייצור וירוס ראשוני או הגברה וירוס הוא קריטי. תמונות עם ניגודיות ניאון ושלב נציג עם סימנים חזותיים של ייצור נגיף מוצגות באיור 3. CPE נצפו 10 ימים לאחר transfection של תאי ...

Discussion

דור וירוס וטיטרציה

לקבלת תוצאות אופטימליות transfection, האיכות והכמות של וקטור לינארית מופיעות חשוב ביותר. אנו לא צופים השפעה שלילית על ייצור lysate עיקרי מצמיחת יתר ראשונית של התרבות מאז הזיהום ימשיך במהירות ברגע ייצור וירוס יעיל מתרחש. ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
pENTR/D-TOPO Cloning Kit	Invitrogen	K240020
Gateway LR Clonase II Enzyme mix	Invitrogen	11791020
PacI	New England Biolabs	R057S
jetPEI	Polyplus-transfection	101-10N
HEK293A Cell Line	Invitrogen	R705-07
A549	ATCC	CCL-185
6-well plates	BD Falcon	353046
14 cm tissue culture dish	Nunc	168381
BALB/cJ-Tg(DO11.10)10Dlo Tg(CARΔ1)1Jdgr	Taconic Farms	Model Nr. 4285
Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II	Miltenyi Biotech	130-094-131
DMEM	Invitrogen	41966-052
FBS	PAN Biotech	1502-P110704
PenStrep	Invitrogen	15140-122
RPMI 1640	Lonza	BE12-167F
NaPyruvate	Lonza	BE13-115E
NEAA 100x	Lonza	BE13-114E
L-Glutamine	Invitrogen	25030
HEPES Buffer Solution (1 M)	Invitrogen	15630-056
β-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M-7522
MEM Essential vitamin mixture (100x)	Lonza	13-607C
Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28 for Cell Expansion and Activation	Invitrogen	114-56D
Recombinant Human TGF-beta 1	R&D Systems	240B
Proleukin S (18 x 106IE)	Novartis
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit	Invitrogen	L-23105
Mouse BD Fc BlockT	BD Pharmingen	553141
Anti-Mouse/Rat Foxp3 PE	eBioscience	12-5773-82
Mmu-miR-155 TaqMan MicroRNA Assay	Roche Applied Biosystems	4427975
LightCycler 480 Probes Master	Roche Applied Biosystems	04902343001
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit	Roche Applied Biosystems	4366596