JoVE Logo
发表
联系我们

登录

需要订阅 JoVE 才能查看此. 登录或开始免费试用。

本文内容

  • 摘要
  • 摘要
  • 引言
  • 研究方案
  • 结果
  • 讨论
  • 材料
  • 参考文献
  • 转载和许可

摘要

我们在这里描述的修订协议，用于胚胎C.大型文化线虫的细胞。 C.胚胎线虫使用这种方法的细胞在体外培养时，出现分化和概括的基因的表达在细胞中的具体方式。需要直接访问到细胞中，或从其它组织中的特定细胞类型的分离技术可以对C.施加线虫培养细胞。

摘要

线虫是一种强大的模型系统中，其中的遗传和分子生物学技术是很容易适用的。直到最近，虽然，需要直接访问到细胞和特定的细胞类型的隔离技术，无法在C应用线虫 。这种限制是由于这一事实，即组织内被加压的角质层这是不容易通过与酶和/或洗涤剂处理消化的局限。基于早期的先驱工作，莱尔德布鲁姆，克里斯滕森和同事1开发出一个强大的方法培养C.线虫胚胎干细胞在大规模。鸡蛋是从妊娠成人分离与漂白/ NaOH处理，随后用壳多糖酶处理以除去蛋壳。胚胎细胞，然后通过手动移液解离，并铺板于血清中丰富的介质基片覆盖的玻璃。在隔离牢房的24小时开始改变形态和表达细胞特异性马克分化RS。C.线虫细胞用这种方法培养的存活最多2周体外和已用于电生理，免疫和成像分析以及它们已被分类并用于微阵列分析。

引言

秀丽隐杆线虫 （ 线虫 ）是一款功能强大的模式生物研究细胞功能，分化和行为的分子基础。虽然它的基因组，代谢和生物合成途径类似于脊椎动物“，它的遗传和分子可追踪性都远远大于2。在它的优点是它的外形和简洁的解剖，其快速的生命周期（3天在25°C），短寿命（2周）和大量的后代（> 200）。由于其雌雄同体的性质和生命周期短，分子和基因操作是直接在C。线虫 ，包括转基因动物3,4和诸如RNA干扰5基因敲低技术的应用的生成。C.线虫体和蛋壳是透明的。因此，细胞可以容易地可视化在成人和使用标准显微镜的胚胎。在过去的40年里，C。线虫 的社区已经为下创建的宝贵资源线虫的研究，包括收集了大量的突变体，基因敲除和转基因，解剖和发展6,7的详细说明，包括完整的重建神经系统8，和一个完全测序的基因组这是很好的说明，并将提供给整个社会（ www.wormbase.com ）。

尽管有许多优点，一些实验方法已在C挑战线虫 。这些包括需要访问到组织或细胞类型的细胞和分离的质膜的那些。事实上Ç。线虫组织都在其加压流体静骨架，这是不容易通过酶处理或洗涤剂消化密闭。在20世纪90年代末仪Goodman和珍妮特里士满率先为C的电生理记录的方法线虫神经元和肌肉细胞中原位 9,10。虽然这些方法给了我们重要的见解和神经元在体内的肌肉功能，它们是具有挑战性和低吞吐量。替代的方法来研究细胞功能的体内已经制定了，大多尤其是在使用基因编码的钙传感器，如GCamP和卡默莱昂11-13 体内钙成像。这些方法虽然不允许使用的药理学工具，因为它们是应用在完整的活的动物。

在培养C.第一次尝试线虫细胞在体外大规模被他的博士论文14的制备过程中由莱尔德布卢姆。不幸的是，难以与细胞到衬底的粘附性差遇到，不良细胞的分化和存活无法建立此早期协议作为一个强大的细胞培养方法。 1995年，埃德加和他的同事发表的程序由孤立的单个C和文化来研究细胞分化和形态发生。线虫胚胎15。通过用酶处理和手动解离的组合蛋壳的消化获得的胚胎干细胞，继续增殖，产生高达〜500个细胞15。随后，梁先生和同事培养一个小数字卵裂球的研究肠道形态。它们表明，1 体外分离ë卵裂球产生由通过心尖粘着连接16彼此进行交互创建了一个结构类似于肠腔偏振肠细胞。布氏及其同事还报道了培养℃的类似的方法。线虫胚胎细胞在体外 17。

在此基础上的早期作品，克里斯滕森和同事开发出一种强大的协议培养胚胎Ç。线虫细胞在体外 1。他们表明分离出来的C。线虫细胞可以分化成各种细胞类型和保持它们在体内具有的功能，包括细胞特异性标志物的表达。那些在体内具有挑战性的几种技术，可以在隔离C.应用线虫胚胎细胞。这些包括电1,18 19，成像和免疫化学技术20,21，以及通过荧光激活细胞的特定细胞类型分选（FACS）对细胞特异性cDNA文库22,23的结构的隔离。如RNA干扰（RNAi）的基因敲除技术可以对培养C.施加线虫细胞1，用叠氮基糖作为糖蛋白发现的一个工具了一种新的代谢标记方法最近已在体外培养的C.开发线虫细胞24。

总之，细胞培养方法扩展数组Ø可应用到的C. f技术线虫模型，以努力破译基因功能的生物体的情况下。我们在这里描述的协议C.培养线虫在体外 ，这在很大程度上是基于最早由克里斯蒂安森和他的同事1中所述的协议胚胎细胞。

研究方案

星号（*）表示新的或修改的步骤相比，Christensen 等人 1

1。材质设置

  1. 在细胞培养过程需要大量的鸡蛋从妊娠的成年人中分离的。 C.成长线虫对8P琼脂平板NA22（可通过线虫遗传协会-长城电脑）接种细菌分离大量鸡蛋。在这些板用蛋白胨的量为8倍，通常是用于NGM板的量。较高的蛋白胨浓度更有效地维系着NA22细菌的生长，这出乎OP50-，生长在厚层。

8P板的配方：

将3克氯化钠，20g的细菌用胰蛋白胨，1升无菌蒸馏水和高压釜30分钟25克琼脂。让介质凉爽，在55℃，然后加入无菌过滤的1毫升胆固醇（5毫克/毫升的EtOH），将1ml 1的MgCl 2的1毫升硫酸镁和25毫升KP缓冲液（500毫升储：5克K 2 HPO 4，30克KH 2 PO 4，pH值6.00）。倒液琼脂培养基中成10毫米培养皿中（25毫升/盘）。

  1. 第二天散布各富含蛋白胨琼脂板的整个表面上用1毫升NA22 E的在2XYT培养基（16克胰蛋白胨，10克酵母提取物，5克NaCl的1升的无菌水，pH 7.0）中于37℃培养的大肠杆菌过夜这些细菌构成了丰富的食物来源，会形成一层厚厚的支持大量妊娠成人的生长。离开种子板在室温下过夜，使细菌的生长。该过程可以通过在37℃下进行4-5小时来加速。
  2. 饿死的动物转移到播种8P板。清洗过的动物用5-6毫升M9的缓冲区或水的匮乏NGM板加1-2毫升此悬液，以每8P板。
  3. 允许生长的动物和乘法UNT金正日板是由妊娠成人人口在汇合。
  4. 隔离要求下编制的蛋线虫用5-6的裂解溶液胚胎细胞，从妊娠的成年人。

裂解液配方

5毫升新鲜的漂白剂1.25毫升10 N的NaOH和18.5毫升的无菌H 2 O的该混合物必须准备每次使用前新鲜。

  1. 从洗净用鸡蛋缓冲妊娠成人孤立的蛋：

鸡蛋缓冲配方

118 mM氯化钠，48毫米氯化钾，2毫米氯化钙2，2毫米氯化镁2，25毫米HEPES，pH值7.3，渗透压340毫渗量。

  1. 删除与几丁质酶处理周围的鸡蛋蛋壳。几丁质酶是在酸性pH值25最高活性的酶。在蛋缓冲液pH 6.5溶解几丁质酶（Sigma公司，目录号C6137）在2毫克/毫升的最终浓度。存储几丁质酶股票溶液在-20℃下在1ml等份在无菌的15毫升锥形管中。等分试样可被储存在-20℃至几个月。
  2. C.成长线虫培养细胞上覆盖着花生凝集素灭菌盖玻片（直径12 mm）。溶解花生植物血凝素在无菌水（0.5毫克/毫升）。花生凝集素溶液不应该过滤或高压灭菌。它也并不需要被用UV光处理。存储2毫升分装在-20°C可保存6个月。
  3. 完整的细胞培养液（500毫升）中包含500个ML L-15培养基购自Gibco，将50ml胎牛血清（热灭活），7.7克蔗糖（45毫渗量），5毫升100微克100 U / mL青霉素和/毫升链霉素（2％）。在完全培养基中，然后用0.20微米的微孔过滤器过滤。

注意的是，蛋缓冲器和培养基分别具有340摩尔渗透压浓度和345毫渗透摩尔浓度。事实上，相反的哺乳动物细胞，C。线虫细胞中有相对高的渗透压需要准备的解决方案，在将要与所述细胞的细胞膜直接接触时，必须考虑到计数。这些试剂的配方进行了调整，以达到所需的渗透压，这是用一个渗压计1测量。这是没有必要使用一个渗透压力计如果这些配方是完全按照与护理用于制备这些试剂。然而，人们应该使用osmoter如果其他解决方案需要做好准备，他们的食谱这里不报，或在任何使用C的出版物线虫培养细胞。

2。鸡蛋隔离

  1. 我们建议开始与至少四个8P板收集到足够的鸡蛋12井培养细胞（24孔板）。
  2. 开始在手术前解冻的花生凝集素原液一管。置于高压灭菌的盖玻片在孔的底部的24孔板，加入200μl的花生凝集素的盖玻片。孵育1小时或uNTIL细胞准备进行电镀。完全取出花生凝集素和用1毫升无菌水灭菌一次洗井。彻底去除盖玻片花生凝集素是避免细胞聚集是必不可少的。
  3. 洗妊娠关闭成人用无菌水高压灭菌的琼脂平板。收集悬浮成两个无菌锥形50ml管中。留在冰上的管中长达5分钟，以允许蠕虫沉淀在管（*）的底部。与转印塑料吸管除去水，并将其与新鲜无菌水高压灭菌取代。通过台式离心分离，在200×g离心（〜1200 rpm）离心10分钟（*）沉淀蠕虫。重复该最后步骤至少为3。
  4. 传送蠕虫到无菌的15毫升锥形管中，沉淀它们在200×g离心（〜1200 rpm）离心10分钟（*）。不使用更高的离心速度，以避免收集细菌在管的底部，以及。有时候，离心后的虫还没有完全沉淀。 AF三每一清洗和去除之前上清液，将管5分钟冰上。在冷却水的蠕虫沉淀到管的底部。
  5. 去除水中加5-6毫升裂解液（见材料设置）。摇动该悬浮液轻轻地5-10分钟，然后开始监控虫溶胞体视显微镜下，每2-3分钟。一滴悬浮液也可以放置在盖玻片，以方便检查。孵化时间取决于漂白剂的新鲜度;买小瓶装的漂白剂，每月开新瓶。
  6. 当〜蠕虫的70-80％被溶解（从孵化开始10分钟），停止裂解反应中加入9mL的蛋缓冲液pH 7.3（见材料设置）。离心该悬浮液在200×g离心（〜1200 rpm）离心10分钟。从这点上有一个本生灯上，在板凳上，以防止再次污染的鸡蛋（*）的。
  7. 小心取出用无菌塑料移液上清，洗涤沉淀3-4x，其中蛋缓冲区中，直到溶液澄清。确保每次洗涤过程中混合颗粒以及在蛋缓冲区。
  8. 鸡蛋是从用30％蔗糖溶液的动物尸体分离。重悬浮颗粒在2毫升无菌鸡蛋缓冲和加入2ml 60％的蔗糖溶液（股票在无菌鸡蛋缓冲区）。拌匀，离心20分钟在200 XG（〜1200转）（*）。
  9. 小心地从离心分离机取出试管。将卵悬浮在溶液的上方。使用P1000移液器和无菌针头，转移所有鸡蛋放入一个新的无菌的15 mL锥形管。
  10. 加入10毫升无菌蛋缓冲到管和离心机在200×g离心（〜1200 rpm）离心10分钟。重复洗涤3×。请确保在鸡蛋缓冲区每次清洗时将鸡蛋完全悬浮。

3。胚胎干细胞解离

进行下一步骤的程序使用的是层流罩的无菌条件下进行。虽然动物袍菌上板，将洗涤液并用含漂白剂的裂解溶液处理，如果不是所有的细菌应消除大部分。因此，使用在层流罩在这一点上的程序可以防止新的卵悬浮液的污染。

  1. 重悬沉淀鸡蛋1毫升2毫克/毫升的几丁质酶（股票鸡蛋缓冲液pH 6.5（*）），并将它们转移到一个新的无菌的15 mL锥形管。摇动该管，在室温下10-30分钟。根据酶和房间的温度的新鲜度的精确的温育时间的变化，因此应为每个准备确定。建议在开始监视孵育10分钟后倒置细胞培养显微镜下的蛋。注：根据我们的经验，低pH值增加几丁质酶活性。为此，我们使用蛋缓冲液，pH 6.5以溶解几丁质酶（配方上面的报道，其中pH用NaOH调整至6.5）。
  2. 时〜80％的蛋壳是由消化几丁质酶处理（ 图1 AB），通过离心分离沉淀的鸡蛋，在900×g离心（〜2500 rpm）离心3分钟（*）。使用P1000移液器和无菌针头，小心取出上清液，加3毫升的L-15培养基（*）。
  3. 传送鸡蛋成直径6厘米的板，并用10毫升无菌注射器配备有18号针头轻轻地解离的细胞。将一滴悬浮液到一个新的塑料培养皿中，并通过在显微镜下观察监测解离度。在此过程中不要吸入空气进入注射器，以避免损坏电池。继续解离，直到〜80％的细胞解离。
  4. 使用无菌5微米的微孔过滤器过滤悬浮液。细胞悬浮液必须经过过滤，以除去细胞团块，未消化的卵和孵出的幼虫。通过过滤器过滤额外4-5毫升新鲜的L-15介质恢复所有的细胞。不要使用在过滤步骤用力过猛，以免达maging过滤器和/或细胞。

4。细胞培养

  1. 通过离心分离沉淀的分离的细胞在900×g离心（〜2500 rpm）离心3分钟（*）。使用P1000移液器和无菌针头小心地取出所有上清。重悬细胞沉淀在完整的L-15培养基和板1毫升/。加入培养基中的量依赖于所用的8P板的数量，在平板上蠕虫的汇合处，以及将要在细胞上进行的实验的类型。细胞密度可以使用血细胞计数器确定。对于膜片钳记录电镀〜230000个细胞/ cm 2为最佳浓度。
  2. 保持24孔板中含有湿纸巾，避免培养基蒸发特百惠塑料容器。存储容器，在湿润的培养箱中在20℃和环境空气。
  3. 这些细胞通常是准备在24小时内试验时的形态分化和快递的绿色荧光蛋白标记物的离子是完整的。细胞可以保存在文化长达2周，但它们通常是最健康的长达7-9天电镀后。介质需要更换，每天一次，以保持健康的细胞。

结果

线虫培养的细胞分化并表达细胞特异性标志物

Christensen和使用台盼蓝染色的同事证明，> 99％的胚胎C的线虫细胞存活的分离过程。在9日和镀后22，分别为85％和65％，仍健在1。孤立的胚胎C.线虫的细胞必须坚持的衬底，以区分。细胞没有附着形成团块和它是否生存是不明确的。细胞的分化开始2-3小时电镀后并持续至24小时。 24小时内，细胞承?...

讨论

线虫是一种功能强大的模式生物破译参与发展，行为和衰老的遗传途径。其方便茎主要从难易程度可以遗传操作，并从它的循环寿命短。尽管它的便利性，C.线虫有其局限性。C.线虫细胞是微小的，在加压的角质层，限制了需要直接访问的细胞，例如电生理和药理学技术，或特定类型的细胞的分离，如通过微阵列分析的基因表达图谱方法的应用局限。该三线虫的细胞培?...

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
REAGENTS
Bacto PeptoneVWR International Inc.90000-382
Difco Agar GranulatedVWR International Inc.90000-784
Bacto TryptoneVWR International Inc.90000-284
Bacto Yeast ExtractVWR International Inc.90000-724
Leibovitz's L-15 Medium (1x) LiquidInvitrogen11415-064
Fetal Bovine SerumInvitrogen16140-063
Penicillin-streptomycinSigmaP4333-100ML
Chitinase from Streptomyces GriseusSigmaC6137-25UN
NA22 Escherichia coliCaenorhabditis Genetics Center
Peanut LectinSigmaL0881-10MG
SucroseSigma57903-1KG
D-(+)GlucoseSigma67528-1KG
Ethylene glycol-bis (2-amin–thylether), N,N,N',N'- tetraacidic acid (EGTA)SigmaE0396-25G
HepesSigmaH3375-500G
Cholesterol
NaClSigma57653-1KG
KClSigmaP9333-500G
CaCl2SigmaC1016-500G
MgCl2SigmaM8266-100G
MgSO4SigmaM2643-500 g
K2HPO4SigmaP2222-500G
KH2PO4SigmaP9791-500G
NaOHSigmaS8045-500G
KOHSigmaP1767-500G
Ethanol
Autoclaved distilled H2O
Bleach
EQUIPMENT
101-1000 μl Blue Graduated Pipet TipsUSA Scentific1111-2821
10 ml Sterilized Pipet Individually WrappedUSA Scentific1071-0810
Ergonomic Variable Volume (100-1000 μl) Pipettor with tip ejectorVWR International Inc.89079-974
Portable Pipet Aid, DrummondVWR International Inc.53498-103
Transfer Plastic Pipet SterileVWR International Inc.14670-114
15 ml Conical Tube USA Scentific1475-1611
50 ml Conical TubeUSA Scentific1500-1811
Sterile 18 gauge NeedlesBecton, Dickinson and Co.305196
Sterile 10 ml SyringesBecton, Dickinson and Co.305482
Plastic Syringe Filters Corning 0,20 μm pore size Corning431224
Acrodic 25 mm Syringe filter w/5 μm versapor MembraneVWR International Inc.28144-095
60x15 mm Petri Dish SterileVWR International Inc.82050-548
100x15 mm Petri Dish SterileVWR International Inc.82050-912
12 mm Diameter Glass CoverslipsVWR International Inc.48300-560
Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid Thomas scientific6902A09
Dumont #5- Fine Forceps Fine Science Tools11254-20
Centrifuge 5702Eppendorf022629883
Laminar Flow Hood
Inverted Microscope with x10 objective
Ambient air humidified Incubator

参考文献

  1. Christensen, M., et al. A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells. Neuron. 33, 503-514 (2002).
  2. Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R., Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. . C. elegans II. , (1997).
  3. Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans. Molecular and cellular biology. 5, 3484-3496 (1985).
  4. Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. The EMBO journal. 10, 3959-3970 (1991).
  5. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  6. Sulston, J. E., White, J. G. Regulation and cell autonomy during postembryonic development of Caenorhabditis elegans. Developmental biology. 78, 577-597 (1980).
  7. Chalfie, M. Caenorhabditis elegans development. Current opinion in cell biology. 1, 1122-1126 (1989).
  8. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences. 314, 1-340 (1986).
  9. Goodman, M. B., Hall, D. H., Avery, L., Lockery, S. R. Active currents regulate sensitivity and dynamic range in C. elegans neurons. Neuron. 20, 763-772 (1998).
  10. Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction. Nature. 2, 791-797 (1038).
  11. Miyawaki, A., Griesbeck, O., Heim, R., Tsien, R. Y. Dynamic and quantitative Ca2+ measurements using improved cameleons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 2135-2140 (1999).
  12. Kerr, R., et al. Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans. Neuron. 26, 583-594 (2000).
  13. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature. 19, 137-141 (2001).
  14. Bloom, L. . Genetic and molecular analysis of genes required for axon outgrowth in Caenorhabditis elegans. , (1993).
  15. Edgar, L. G. Blastomere culture and analysis. Methods in cell biology. 48, 303-321 (1995).
  16. Leung, B., Hermann, G. J., Priess, J. R. Organogenesis of the Caenorhabditis elegans intestine. Developmental biology. 216, 114-134 (1999).
  17. Buechner, M., Hall, D. H., Bhatt, H., Hedgecock, E. M. Cystic canal mutants in Caenorhabditis elegans are defective in the apical membrane domain of the renal (excretory) cell. Developmental biology. 214, 227-241 (1999).
  18. Suzuki, H., et al. In vivo imaging of C. elegans mechanosensory neurons demonstrates a specific role for the MEC-4 channel in the process of gentle touch sensation. Neuron. 39, 1005-1017 (2003).
  19. Carvelli, L., McDonald, P. W., Blakely, R. D., Defelice, L. J. Dopamine transporters depolarize neurons by a channel mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 16046-16051 (2004).
  20. Bianchi, L., et al. The neurotoxic MEC-4(d) DEG/ENaC sodium channel conducts calcium: implications for necrosis initiation. Nature. 7, 1337-1344 (2004).
  21. Frokjaer-Jensen, C., et al. Effects of voltage-gated calcium channel subunit genes on calcium influx in cultured C. elegans mechanosensory neurons. Journal of neurobiology. 66, 1125-1139 (2006).
  22. Von Stetina, S. E., et al. Cell-specific microarray profiling experiments reveal a comprehensive picture of gene expression in the C. elegans nervous system. Genome biology. 8, R135 (2007).
  23. Fox, R. M., et al. A gene expression fingerprint of C. elegans embryonic motor neurons. BMC genomics. 6, 42 (2005).
  24. Burnham-Marusich, A. R., et al. Metabolic Labeling of Caenorhabditis elegans Primary Embryonic Cells with Azido-Sugars as a Tool for Glycoprotein Discovery. PloS one. 7, e49020 (2012).
  25. Kim, K. J., Yang, Y. J., Kim, J. G. Purification and characterization of chitinase from Streptomyces sp. M-20. Journal of biochemistry and molecular biology. 36, 185-189 (2003).
  26. Chalfie, M., Wolinsky, E. The identification and suppression of inherited neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. Nature. 345, 410-416 (1990).
  27. Parpura, V. Voltage-gated calcium channel types in cultured C. elegans CEPsh glial cells. Cell calcium. 50, 98-108 (2011).
  28. Miller, D. M., Niemeyer, C. J. Expression of the unc-4 homeoprotein in Caenorhabditis elegans motor neurons specifies presynaptic input. Development. 121, 2877-2886 (1995).
  29. Lickteig, K. M., et al. Regulation of neurotransmitter vesicles by the homeodomain protein UNC-4 and its transcriptional corepressor UNC-37/groucho in Caenorhabditis elegans cholinergic motor neurons. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 21, 2001-2014 (2001).
  30. Zhang, H., et al. UNC119 is required for G protein trafficking in sensory neurons. Nature. 14 (7), (2011).
  31. Maduro, M., Pilgrim, D. Identification and cloning of unc-119, a gene expressed in the Caenorhabditis elegans nervous system. Genetics. 141, 977-988 (1995).
  32. Chalfie, M., Sulston, J. Developmental genetics of the mechanosensory neurons of Caenorhabditis elegans. Developmental biology. 82, 358-370 (1981).
  33. Fukushige, T., et al. MEC-12, an alpha-tubulin required for touch sensitivity in C. elegans. Journal of cell science. 112 (Pt. 3), 395-403 (1999).
  34. Driscoll, M., Chalfie, M. The mec-4 gene is a member of a family of Caenorhabditis elegans genes that can mutate to induce neuronal degeneration. Nature. 349, 588-593 (1991).
  35. Xu, K., Tavernarakis, N., Driscoll, M. Necrotic cell death in C. elegans requires the function of calreticulin and regulators of Ca(2+) release from the endoplasmic reticulum. Neuron. 31, 957-971 (2001).
  36. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual review of physiology. 46, 455-472 (1984).
  37. Strange, K., Christensen, M., Morrison, R. Primary culture of Caenorhabditis elegans developing embryo cells for electrophysiological, cell biological and molecular studies. Nature protocols. 2, 1003-1012 (2007).
  38. Goodman, M. B., Lockery, S. R. Pressure polishing: a method for re-shaping patch pipettes during fire polishing. Journal of neuroscience. 100, 13-15 (2000).
  39. Nickell, W. T., Pun, R. Y., Bargmann, C. I., Kleene, S. J. Single ionic channels of two Caenorhabditis elegans chemosensory neurons in native membrane. The Journal of membrane biology. 189, 55-66 (2002).
  40. Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans. Nature neuroscience. 11, 916-922 (2008).
  41. Parpura, V. Cell culturing of Caenorhabditis elegans glial cells for the assessment of cytosolic Ca(2)(+) dynamics. Methods Mol. Biol. 814 (2), 153-174 (2012).
  42. Zhang, Y., et al. Identification of genes expressed in C. elegans touch receptor neurons. Nature. 418, 331-335 (2002).
  43. Cinar, H., Keles, S., Jin, Y. Expression profiling of GABAergic motor neurons in Caenorhabditis elegans. Current biology : CB. 15, 340-346 (2005).
  44. Bacaj, T., Tevlin, M., Lu, Y., Shaham, S. Glia are essential for sensory organ function in C. elegans. Science. 322, 744-747 (2008).
  45. Colosimo, M. E., et al. Identification of thermosensory and olfactory neuron-specific genes via expression profiling of single neuron types. Current biology : CB. 14, 2245-2251 (1016).
  46. Shih, J. D., Fitzgerald, M. C., Sutherlin, M., Hunter, C. P. The SID-1 double-stranded RNA transporter is not selective for dsRNA length. RNA. 15, 384-390 (2009).
  47. O'Hagan, R., Chalfie, M., Goodman, M. B. The MEC-4 DEG/ENaC channel of Caenorhabditis elegans touch receptor neurons transduces mechanical signals. Nature. 8, 43-50 (2005).
  48. Du, H., Gu, G., William, C. M., Chalfie, M. Extracellular proteins needed for C. elegans mechanosensation. Neuron. 16, 183-194 (1996).
  49. Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PloS one. 6, e19505 (2011).

转载和许可

请求许可使用此 JoVE 文章的文本或图形

请求许可

探索更多文章

79

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

政策

使用条款

隐私

联系我们

向图书馆推荐

JoVE 新闻简报

科研

教育

发表

图书馆员

关于 JoVE

版权所属 © 2025 MyJoVE 公司版权所有，本公司不涉及任何医疗业务和医疗服务。