Un método para cultivar embrionarias<em&gt; C. elegans</em&gt; Células

Resumen

Se describe aquí un protocolo revisado para el cultivo a gran escala de embriones C. elegans células. Embryonic C. elegans células cultivadas in vitro utilizando este método, parecen diferenciarse y recapitular la expresión de genes de una manera específica de la célula. Las técnicas que requieren el acceso directo a las células o el aislamiento de tipos de células específicas de los otros tejidos se pueden aplicar sobre C. elegans células cultivadas.

Resumen

C. elegans es un modelo de sistema de gran alcance, en la que las técnicas genéticas y moleculares son de fácil aplicación. Hasta hace poco, sin embargo, las técnicas que requieren acceso directo a las células y el aislamiento de determinados tipos de células, podrían no aplicarse en C. elegans. Esta limitación se debe al hecho de que los tejidos están confinados dentro de una cutícula presurizado que no es fácilmente digerido por el tratamiento con enzimas y / o detergentes. Basado en el trabajo de los pioneros por Laird Bloom, Christensen y sus colegas han desarrollado la ¹ un método robusto para el cultivo de C. Elegans células embrionarias en gran escala. Los huevos están aisladas de adultos grávidas por tratamiento con lejía / NaOH y posteriormente tratados con quitinasa para eliminar las cáscaras de huevo. Las células embrionarias se disocia mediante pipeteo manual y sembraron en sustrato de vidrio cubierto en medio de suero enriquecido. Dentro de las 24 horas de las celdas de aislamiento comenzar a diferenciar cambiando la morfología y expresando marke células específicasrs. C. elegans células cultivadas con este método sobrevivir hasta 2 semanas in vitro y se han utilizado para electrofisiológico, inmunoquímica, y proyección de imagen analiza todo lo bien que se han clasificado y utilizado para los microarrays de perfiles.

Introducción

Caenorhabditis elegans (C. elegans) es un organismo modelo de gran alcance para la investigación de las bases moleculares de la función celular, la diferenciación y el comportamiento. Mientras que su genoma, metabólicos y las vías biosintéticas son similares a los vertebrados, su maleabilidad genética y molecular son mucho mayores ^2. Entre sus ventajas son su tamaño y simple anatomía, su rápido ciclo de vida (3 días a 25 ° C), de corta duración de la vida (2 semanas) y gran número de crías (> 200). Debido a su naturaleza hermafrodita y corto ciclo de vida, las manipulaciones genéticas y moleculares son sencillos en C. elegans, incluyendo la generación de animales transgénicos ^3,4 y la aplicación de técnicas de saldo de genes tales como ARN de interferencia ^5. C. cuerpo elegans y la cáscara de huevo son transparentes. Por lo tanto las células se pueden visualizar fácilmente tanto en el adulto y el embrión utilizando microscopía estándar. En los últimos 40 años, el C. elegans comunidad ha creado recursos invaluables para C. investigación elegans incluyendo una gran colección de mutantes, knockouts y transgénicos, una descripción detallada de la anatomía y desarrollo ^6,7, incluida la reconstrucción completa del sistema nervioso ^8, y un genoma secuenciado completamente, que es bien anotado y disponible para toda la comunidad ( www.wormbase.com ).

A pesar de las numerosas ventajas, algunos enfoques experimentales han sido difíciles en C. elegans. Estos incluyen los que requieren la accesibilidad a la membrana plasmática de las células y el aislamiento de los tejidos o tipos de células. De hecho C. tejidos elegans están confinados dentro de su esqueleto hidrostático a presión, que no es fácilmente digerido por tratamiento enzimático o detergentes. A finales de la década de 1990 Miriam Goodman y Janet Richmond pioneros métodos de registros electrofisiológicos de C. elegansneuronas y células musculares in situ ^9,10. Si bien estos métodos nos dio pistas importantes sobre neuronal y la función muscular in vivo, que son desafiantes y bajo rendimiento. Los métodos alternativos para el estudio de la función de células in vivo se han desarrollado, sobre todo en especial en vivo de imágenes de calcio por medio de sensores de calcio genéticamente codificados como GCamP y cameleon ^11-13. Estos métodos, sin embargo, no permiten el uso de herramientas farmacológicas porque se aplican en animales vivos intactos.

El primer intento de cultivar C. elegans células in vitro en gran escala fue realizada por Laird Bloom durante la preparación de su tesis doctoral ^14. Desafortunadamente, las dificultades encontradas con una pobre adhesión de las células al sustrato, pobre diferenciación celular y la supervivencia prevenir el establecimiento de este protocolo ya en un método de cultivo celular robusto. En 1995 Edgar y sus colegas publicaron un procedimientopara investigar la división celular y la morfogénesis por aislamiento y cultivo de una sola C. elegans embriones ^15. Las células embrionarias obtenidos por la digestión de las cáscaras de huevo con una combinación de tratamiento enzimático y la disociación manual, continuaron proliferando, produciendo hasta ~ 500 células ^15. Posteriormente, Leung y colaboradores cultivaron un pequeño número de blastómeras estudiar la morfogénesis intestinal. Ellos mostraron que uno in vitro aislados E blastómeros produjo células intestinales polarizadas que crearon una estructura análoga a la luz intestinal al interactuar entre sí a través de las salidas ¹⁶ adherentes apicales. Buechner y colegas también informaron un método similar para el cultivo C. elegans células embrionarias in vitro ^17.

Sobre la base de este trabajo inicial, Christensen y sus colegas desarrollaron un protocolo robusto para el cultivo embrionario C. elegans células in vitro ^1. Ellosmostró que el aislado C. elegans células pueden diferenciarse en diversos tipos de células y mantener las características que poseen in vivo, incluyendo la expresión de marcadores específicos de célula. Varias técnicas que son un reto in vivo, se pueden aplicar en aislado C. elegans células embrionarias. Estos incluyen electrofisiológico ^{1,18 19,} de formación de imágenes, y técnicas inmunoquímicas ^20,21, así como el aislamiento de tipos de células específicas por-fluorescente clasificación de células activadas (FACS) para la construcción de bibliotecas de ADNc de células específicas de ^22,23. Técnicas de genes desmontables tales como interferencia de ARN (RNAi) se pueden aplicar sobre culta C. elegans células ¹ y un método novedoso marcaje metabólico usando Azido-azúcar como una herramienta para el descubrimiento de glicoproteína se ha desarrollado recientemente para cultivadas in vitro C. elegans células ^24.

En conclusión, el método de cultivo celular se expande la matriz Of técnicas que se pueden aplicar a la C. modelo elegans en un esfuerzo para descifrar la función de genes en el contexto de un organismo vivo. Se describe aquí el protocolo para el cultivo de C. Elegans células embrionarias in vitro, que se basa en gran parte en el protocolo descrito por primera vez por Christiansen y sus colegas ^1.

Protocolo

Los asteriscos (*) indican los pasos nuevos o modificados en comparación con Christensen et al. ¹

1. Configuración del material

1. El procedimiento de cultivo celular requiere grandes cantidades de huevos aislados de los adultos grávidas. Crecer C. elegans en 8P placas de agar sembrado con NA22 (disponible a través de la C. elegans Consorcio Genético - CGC) bacterias para aislar grandes cantidades de huevos. En estas placas de la cantidad de peptona utilizado es 8 veces la cantidad que se utiliza normalmente para las placas de NGM. La concentración de peptona superior sostiene el crecimiento de bacterias NA22 de manera más eficiente, que contrariamente a OP50-, crecer en capas gruesas.

8P placas de recetas:

Disolver 3 g de NaCl, 20 g de Bacto-peptona, 25 g de agar en 1 L de agua destilada estéril y se autoclave durante 30 min. Deje enfriar el medio a 55 ° C y luego añadir-filtrados estériles de 1 ml de colesterol (5 mg / ml en EtOH), 1 ml de 1 MgCl ₂, 1 ml de _MgSO4 y 25 ml de tampón KP (un balance de 500 ml: 5 g de K ₂ HPO _4, 30 g de KH ₂ PO _4, pH 6,00). Verter medio de agar líquido en 10 cm de placas de Petri (25 ml / placa).

2. El día siguiente se extendió toda la superficie de cada placa de agar de peptona enriquecida con 1 ml de E. NA22 coli cultivadas durante la noche en medios 2xYT (16 g de triptona, extracto de 10 g de levadura, 5 g de NaCl en 1 l de agua estéril, pH 7,0) a 37 ° C. Estas bacterias constituyen una fuente de alimento abundante que formará una capa gruesa apoyar el crecimiento de las grandes cantidades de adultos grávidas. Deja placas sembradas durante la noche a temperatura ambiente para permitir el crecimiento de las bacterias. El proceso puede ser acelerado por incubación a 37 ° C durante 4-5 horas.
3. Traslado animales murieron de sembradas 8P placas. Lavar los animales fuera de una placa de NGM hambre usando 5-6 ml de tampón M9 o agua y añadir 1-2 ml de esta suspensión a cada placa 8P.
4. Permitir el crecimiento y la multiplicación de los animales UNTil las placas se llenan en la confluencia de los adultos grávidas.
5. Aislar los huevos necesarios para la preparación de C. Elegans células embrionarias, de adultos grávidas utilizando 5-6 ml de solución de lisis.

Receta de solución de lisis

5 ml de lejía fresca, 1,25 ml de NaOH 10 N y 18,5 ml de H2O _estéril Esta mezcla debe prepararse antes de cada uso.

6. Lavar los huevos aislados de los adultos grávidas usando tampón de huevo:

Receta búfer Huevo

NaCl 118 mM, 48 mM de KCl, 2 mM de _CaCl2, 2 mM de MgCl _2, 25 mM de Hepes, pH 7,3, osmolaridad 340 mOsm.

7. Retire la cáscara de huevo que rodea los huevos por el tratamiento con quitinasa. La quitinasa es una enzima con actividad más alta a pH ácido ^25. Disolver quitinasa (Sigma, n º de catálogo. C6137) en tampón de huevo de pH 6,5 a una concentración final de 2 mg / ml. Almacene las acciones quitinasasolución a -20 ° C en alícuotas de 1 ml en tubos de 15 ml cónicos estériles. Las alícuotas se pueden almacenar a -20 ° C hasta unos pocos meses.
8. Crecer C. células cultivadas sobre cubreobjetos elegans en autoclave (12 mm de diámetro) cubierto con lectina de cacahuete. Disolver lectina de cacahuete en agua estéril (0,5 mg / ml). Solución de lectina de cacahuete no debe ser filtrada o en autoclave. También no tiene que ser tratada con luz UV. Tienda 2 ml alícuotas a -20 ° C durante un máximo de 6 meses.
9. Medio de cultivo celular completo (500 ml) contiene 500 ml de L-15 medio de cultivo de Gibco, 50 ml de suero bovino fetal (inactivado por calor), 7,7 g de sacarosa (45 mOsm), 5 ml de 100 U / ml de penicilina y de 100 g / ml de estreptomicina (2%). El medio completo se filtra a continuación, utilizando un filtro de poro 0,20 micras.

Tenga en cuenta que la memoria intermedia de huevo y el medio de cultivo tienen osmolaridad de 340 mOsm y 345, respectivamente. En efecto, contrariamente a las células de mamíferos, C. células elegans tienen una relativamente alta osmolaridadque necesita ser tenido en cuenta al preparar soluciones que estarán en contacto directo con la membrana plasmática de las células. Las recetas de estos reactivos se ajustaron para alcanzar la osmolaridad deseada, que se midió utilizando un osmómetro ^1. No es necesario utilizar un osmómetro si estas recetas se siguen con exactitud y cuidado se utiliza en la preparación de estos reactivos. Sin embargo, se debe utilizar un Osmoter si otras soluciones tienen que estar preparados, cuyas recetas no son reportados aquí o en cualquiera de las publicaciones que utilizan C. elegans células cultivadas.

2. Aislamiento Huevo

1. Se recomienda comenzar con al menos cuatro 8P placas para recoger los huevos suficientes para 12 pocillos de células cultivadas (en placas de 24 pocillos).
2. Antes de comenzar con el procedimiento de descongelar un tubo de solución de cacahuete lectina de valores. Coloque cubreobjetos tratados en autoclave en la parte inferior de los pocillos en una placa de 24 pocillos y añadir 200 l de lectina de cacahuete a los cubreobjetos. Incubar durante 1 hora o uasta las células están listas para ser chapada. Retire completamente la lectina de cacahuete y lavar los pocillos una vez con 1 ml de agua estéril tratada en autoclave. La eliminación completa de la lectina de cacahuete de los cubreobjetos es esencial para evitar la formación de grumos de células.
3. Lave los adultos grávidas de las placas de agar con agua tratada en autoclave estéril. Recoger la suspensión en dos cónica tubo de 50 ml estéril. Dejar los tubos en hielo durante hasta 5 minutos para permitir la precipitación de los gusanos en la parte inferior de los tubos (*). Retire el agua con una pipeta de plástico de transferencia y reemplazarla con agua esterilizada en autoclave fresco. Pellet gusanos sobremesa centrifugación a 200 xg (~ 1200 rpm) durante 10 min (*). Repita este último paso al menos 3.
4. Transferencia de gusanos en un tubo cónico de 15 ml estéril y sedimentar ellos a 200 xg (~ 1200 rpm) durante 10 min (*). No utilice una mayor velocidad de centrifugación para evitar la recogida de las bacterias en la parte inferior del tubo también. A veces, después centrifugaciones los gusanos no están completamente sedimentan. After de cada lavado y antes de la eliminación del sobrenadante, coloque los tubos durante 5 minutos en hielo. En refrigerada gusanos de agua precipitan a la parte inferior del tubo.
5. Retire el agua y añadir 5-6 ml de solución de lisis (ver material creado). Rock the suspensión suavemente durante 5-10 minutos y luego comenzar a supervisar lisis gusano bajo el microscopio estereoscópico, cada 2-3 min. Una gota de la suspensión puede ser también colocado en un cubreobjetos para la inspección fácil. El tiempo de incubación varía en función de la frescura de la lejía, comprar pequeñas botellas de lejía y abrir una botella nueva cada mes.
6. Cuando ~ 70-80% de los gusanos se lisan (10 min desde el comienzo de la incubación), detener la reacción de lisis mediante la adición de 9 ml de tampón de huevo de pH 7,3 (ver Material SET UP). Centrifugar la suspensión a 200 xg (~ 1200 rpm) durante 10 min. A partir de ahora tendrá un mechero Bunsen en adelante, en el banco para evitar una nueva contaminación de los huevos (*).
7. Retire con cuidado el sobrenadante con una pipeta de transferencia de plástico estéril y lavar el pellet 3-4x con tampón de huevo hasta que la solución es clara. Asegúrese de mezclar bien el sedimento en el tampón de huevos durante cada lavado.
8. Los huevos se separan de los cadáveres de animales utilizando solución de sacarosa al 30%. Resuspender el sedimento en 2 ml de tampón de huevo estéril y añadir solución de sacarosa al 2 ml de 60% (en tampón de stock huevo estéril). Mezclar bien y centrifugar durante 20 min a 200 xg (~ 1200 rpm) (*).
9. Retire con cuidado los tubos de la centrífuga. Los huevos están flotando en la parte superior de la solución. Usando una pipeta P1000 y puntas de pipetas estériles, transferir todos los huevos en un tubo cónico frescas 15 ml estériles.
10. Añadir 10 ml de tampón de huevo estéril para el tubo y centrifugar a 200 xg (~ 1200 rpm) durante 10 min. Repita el lavado 3 x. Asegúrese de que los huevos estén totalmente resuspendidas en el tampón de huevos durante cada lavado.

3. Células embrionarias de disociación

Llevar a cabo los siguientes pasos del procedimiento en condiciones estériles utilizando una campana de flujo laminar. Mientras que los animales sonel vestido en placas de bacterias, los lavados y el tratamiento con la solución de lisis que contiene blanqueador debería eliminar la mayoría si no todas las bacterias. Por lo tanto el uso de una campana laminar en este punto del procedimiento evita nueva contaminación de la suspensión de huevos.

1. Resuspender huevos sedimentadas en 1 ml de 2 mg / ml quitinasa (existencias en tampón de huevo pH 6,5 (*)) y transferirlos a un nuevo tubo cónico de 15 ml estéril. Roca el tubo de 10-30 minutos a temperatura ambiente. La hora exacta de incubación varía de acuerdo con la frescura de la enzima y la temperatura de la habitación y por lo tanto debe determinarse para cada preparación. Se recomienda iniciar la supervisión de los huevos en un microscopio invertido de cultivo celular después de 10 minutos de incubación. Nota: en nuestra experiencia, el bajo pH aumenta la actividad enzimática quitinasa. Por esta razón se utiliza tampón de huevo a pH 6,5 para disolver quitinasa (receta se informó anteriormente, donde el pH se ajusta a 6,5 ​​usando NaOH).
2. Cuando ~ 80% de las cáscaras de huevo son digeridos por latratamiento quitinasa (Figuras 1 AB), que sedimenten los huevos por centrifugación a 900 xg (~ 2500 rpm) durante 3 min (*). Usando una pipeta P1000 y puntas esterilizadas, retire con cuidado el sobrenadante y añadir 3 ml de medio L-15 (*).
3. La transferencia de los huevos en un plato de 6 cm de diámetro y disociar suavemente las células utilizando una jeringa estéril de 10 ml equipado con una aguja de calibre 18. Monitorear el grado de disociación mediante la colocación de una gota de suspensión en un placa Petri de plástico fresco y por ver bajo el microscopio. No aspirar aire en la jeringa durante este procedimiento para evitar dañar las células. Continuar la disociación hasta ~ 80% de las células se disocian.
4. Filtrar la suspensión utilizando un filtro de 5 micras Millipore estéril. Las suspensiones celulares deben ser filtrados con el fin de eliminar los agregados celulares, los huevos no digeridas y larvas eclosionadas. Filtrar 4-5 ml adicionales de frescas L-15 medios de comunicación a través del filtro para recuperar todas las células. No use fuerza excesiva durante la etapa de filtración para evitar damaging el filtro y / o las células.

4. El cultivo de células

1. Sedimenten las células disociadas por centrifugación a 900 xg (~ 2500 rpm) durante 3 min (*). Usando una pipeta P1000 y puntas esterilizadas retire con cuidado todo el sobrenadante. Resuspender las células sedimentadas en completa medio L-15 y la placa 1 ml / pocillo. La cantidad del medio añadido depende del número de placas 8P utilizado, la confluencia de los gusanos en las placas, y el tipo de experimentos que se pueden realizar en las células. La densidad celular se puede determinar usando un hemocitómetro. Para patch-clamp grabaciones enchapado densidad de ~ 230.000 células / cm ² es óptima.
2. Guarde la placa de 24 pozos en un recipiente Tupperware plástico con toallas de papel mojadas para evitar la evaporación del medio de cultivo. Almacenar el recipiente en un incubador humidificado a 20 ° C y el aire ambiente.
3. Las células suelen estar listos para los experimentos dentro de las 24 horas cuando la diferenciación morfológica y expresoion de los marcadores GFP están completos. Las células se pueden mantener en cultivo durante un máximo de 2 semanas, pero por lo general son más sanos hasta 7-9 días después de la siembra. El medio tiene que ser reemplazado una vez al día para mantener las células sanas.

Resultados

C. elegans y células cultivadas se diferencian de células expresan marcadores específicos

Christensen y sus colegas utilizando tinción con azul tripán demostraron que> 99% de los embriones C. elegans células sobreviven el procedimiento de aislamiento. En días 9 y 22 después de la siembra, 85% y 65%, respectivamente, siguen vivos ^1. Aislado embrionario C. células elegans deben adherirse a un sustrato con el fin de diferenciar. Las célul...

Discusión

C. elegans es un organismo modelo de gran alcance para descifrar los mecanismos genéticos implicados en el desarrollo, la conducta y el envejecimiento. Su conveniencia se debe principalmente a la facilidad con la que puede ser manipulada genéticamente y de su ciclo de vida corto. A pesar de su conveniencia, C. elegans tiene sus limitaciones. C. células elegans son pequeñas y confinado dentro de una cutícula a presión que limita la aplicación de métodos que requieren el acceso ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Bacto Peptone	VWR International Inc.	90000-382
Difco Agar Granulated	VWR International Inc.	90000-784
Bacto Tryptone	VWR International Inc.	90000-284
Bacto Yeast Extract	VWR International Inc.	90000-724
Leibovitz's L-15 Medium (1x) Liquid	Invitrogen	11415-064
Fetal Bovine Serum	Invitrogen	16140-063
Penicillin-streptomycin	Sigma	P4333-100ML
Chitinase from Streptomyces Griseus	Sigma	C6137-25UN
NA22 Escherichia coli	Caenorhabditis Genetics Center
Peanut Lectin	Sigma	L0881-10MG
Sucrose	Sigma	57903-1KG
D-(+)Glucose	Sigma	67528-1KG
Ethylene glycol-bis (2-amin–thylether), N,N,N',N'- tetraacidic acid (EGTA)	Sigma	E0396-25G
Hepes	Sigma	H3375-500G
Cholesterol
NaCl	Sigma	57653-1KG
KCl	Sigma	P9333-500G
CaCl2	Sigma	C1016-500G
MgCl2	Sigma	M8266-100G
MgSO4	Sigma	M2643-500 g
K2HPO4	Sigma	P2222-500G
KH2PO4	Sigma	P9791-500G
NaOH	Sigma	S8045-500G
KOH	Sigma	P1767-500G
Ethanol
Autoclaved distilled H2O
Bleach
EQUIPMENT
101-1000 μl Blue Graduated Pipet Tips	USA Scentific	1111-2821
10 ml Sterilized Pipet Individually Wrapped	USA Scentific	1071-0810
Ergonomic Variable Volume (100-1000 μl) Pipettor with tip ejector	VWR International Inc.	89079-974
Portable Pipet Aid, Drummond	VWR International Inc.	53498-103
Transfer Plastic Pipet Sterile	VWR International Inc.	14670-114
15 ml Conical Tube	USA Scentific	1475-1611
50 ml Conical Tube	USA Scentific	1500-1811
Sterile 18 gauge Needles	Becton, Dickinson and Co.	305196
Sterile 10 ml Syringes	Becton, Dickinson and Co.	305482
Plastic Syringe Filters Corning 0,20 μm pore size	Corning	431224
Acrodic 25 mm Syringe filter w/5 μm versapor Membrane	VWR International Inc.	28144-095
60x15 mm Petri Dish Sterile	VWR International Inc.	82050-548
100x15 mm Petri Dish Sterile	VWR International Inc.	82050-912
12 mm Diameter Glass Coverslips	VWR International Inc.	48300-560
Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid	Thomas scientific	6902A09
Dumont #5- Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Centrifuge 5702	Eppendorf	022629883
Laminar Flow Hood
Inverted Microscope with x10 objective
Ambient air humidified Incubator