Ein Verfahren zur Kultivierung von embryonalen<em&gt; C. elegans</em&gt; Zellen

Zusammenfassung

Wir beschreiben hier eine überarbeitete Protokoll für die groß angelegte Kultur von embryonalen C. elegans-Zellen. Embryonale C. elegans in vitro kultivierte Zellen unter Verwendung dieses Verfahrens scheinen in einer zellspezifischen Weise zu differenzieren und zu rekapitulieren, die Expression von Genen. Techniken, die direkten Zugriff auf die Zellen oder Isolierung von spezifischen Zelltypen aus den anderen Geweben erfordern kann auf C angewendet werden elegans kultivierten Zellen.

Zusammenfassung

C. elegans ist ein leistungsfähiges Modellsystem, in der genetischen und molekularen Techniken sind leicht anwendbar. Bis vor kurzem aber Techniken, die direkten Zugang zu den Zellen und Isolierung von spezifischen Zelltypen benötigen, konnten nicht in C angewendet werden elegans. Diese Beschränkung resultiert aus der Tatsache, dass Gewebe in einem unter Druck Kutikula, die nicht leicht durch die Behandlung mit Enzymen und / oder Detergenzien aufgeschlossen wird beschränkt. Basierend auf frühen Pionierarbeit von Laird Bloom, Christensen und Kollegen entwickelten ^ein ein robustes Verfahren für die Kultivierung von C. elegans embryonalen Zellen in großem Maßstab. Die Eier werden von schwangeren Erwachsenen durch Behandlung mit Bleichmittel / NaOH isoliert und anschließend mit Chitinase behandelt, um die Eierschalen zu entfernen. Embryonale Zellen werden dann durch manuelles Pipettieren dissoziiert und auf das Substrat beschichtete Glas im Serum angereicherten Medien ausplattiert. Innerhalb von 24 Stunden von Isolationszellen beginnen, indem Morphologie und durch zellspezifische marke ausdrücken unterscheidenrs. C elegans Zellen mit dieser Methode kultiviert überleben bis 2 Wochen in vitro und haben für elektrophysiologische, immun verwendet, und Bildanalysen sowie wurden sie sortiert und für die Microarray-Profiling eingesetzt.

Einleitung

Caenorhabditis elegans (C. elegans) ist ein leistungsfähiges Modellorganismus für die Untersuchung der molekularen Grundlagen der zellulären Funktion, Differenzierung und Verhalten. Während sein Genom, Stoffwechsel-und Biosynthesewege ähnlich Wirbeltiere "sind, sind die genetischen und molekularen Lenkbarkeit weit größer ^2. Einer der Vorteile sind seine Größe und einfache Anatomie, seiner schnellen Lebenszyklus (3 Tage bei 25 ° C), kurze Lebensdauer (2 Wochen) und große Anzahl von Nachkommen (> 200). Aufgrund seiner Zwitter Natur und kurzen Lebenszyklus, sind molekulare und genetische Manipulationen einfach in C. elegans, einschließlich der Erzeugung von transgenen Tieren ^3,4 und die Anwendung der Gen-Knock-down-Verfahren, wie ^{RNA-Interferenz-5.} C elegans Körper und Eierschale sind transparent. Daher Zellen leicht sowohl in der Erwachsenen-und der Embryo mit Standard-Mikroskopie sichtbar gemacht werden. In den letzten 40 Jahren hat sich die C. elegans Gemeinde hat wertvolle Ressourcen für C erstellt elegans Forschung, darunter eine große Sammlung von Mutanten, Knockouts und Transgenen, eine detaillierte Beschreibung der Anatomie und Entwicklung ^6,7, einschließlich der vollständigen Rekonstruktion des Nervensystems ^8, und ein Genom vollständig sequenziert, die gut kommentierten und verfügbar für die ganze Gemeinde ( www.wormbase.com ).

Trotz der zahlreichen Vorteile, haben einige experimentelle Ansätze in C. Herausforderung worden elegans. Dazu gehören diejenigen, die Zugang zu der Plasmamembran der Zellen und Isolierung von Geweben oder Zelltypen erforderlich. Tatsächlich C. elegans Gewebe in seinem hydrostatischen Druck Skelett, das nicht leicht durch enzymatische Behandlung oder Detergenzien aufgeschlossen wird beschränkt. Am Ende der 1990er Jahre Miriam Goodman und Janet Richmond Pionier Methoden zur elektrophysiologischen Ableitungen von C. elegansNeuronen und Muskelzellen in situ ^9,10. Während diese Verfahren gab uns wichtige Einblicke in die neuronalen und Muskelfunktion in vivo, sie sind anspruchsvoll und geringem Durchsatz. Alternative Methoden, um die Zellfunktion in vivo zu untersuchen entwickelt worden, meist vor allem in vivo Calcium Imaging mit genetisch kodierte Kalzium-Sensoren wie GCamP und came ^11-13. Diese Methoden aber nicht die Verwendung von pharmakologischen Tools ermöglichen, weil sie auf intakten lebenden Tieren angewendet.

Der erste Versuch Kultivierung C. elegans-Zellen in vitro in großem Maßstab wurde von Laird Bloom während der Vorbereitung seiner Doktorarbeit ¹⁴ gemacht. Leider mit schlechter Adhäsion der Zellen an das Substrat auf Schwierigkeiten gestoßen, schlechte Zelldifferenzierung und das Überleben verhindert die Einrichtung dieser frühen Protokoll als robuste Zellkulturverfahren. Im Jahr 1995 Edgar und Kollegen veröffentlichten eine ProzedurZellteilung und Morphogenese durch Isolierung und Kultur von einer einzigen C zu untersuchen. elegans Embryonen ^15. Embryonale Zellen durch Verdau der Eierschalen mit einer Kombination aus enzymatischer Behandlung und manuelle Dissoziation erhalten, weiter zu vermehren, produzieren bis zu ~ 500 Zellen ^15. Anschließend Leung und Mitarbeiter kultiviert eine kleine Anzahl von Blastomeren Darm Morphogenese studieren. Sie zeigten, dass eine in vitro isolierten E Blastomere hergestellt polarisierten Darmzellen, die eine analoge Struktur des Darmlumens durch Wechselwirkung miteinander durch apikalen Adhärenzverbindungen ¹⁶ angelegt. Büchner und Kollegen auch ein ähnliches Verfahren für die Kultivierung C. elegans embryonalen Zellen in vitro ^17.

Basierend auf dieser frühen Arbeit Tensen und Kollegen entwickelt einen robusten Protokoll zur Kultivierung von embryonalen C. elegans-Zellen in vitro ^1. Siezeigten, dass isolierte C. elegans-Zellen können in verschiedene Zelltypen zu differenzieren und Aufrechterhaltung der Funktionen, die sie in vivo besitzen, einschließlich der Expression von zellspezifische Marker. Verschiedene Techniken, die in vivo eine Herausforderung sind, können auf isolierte C angewendet werden elegans embryonalen Zellen. Diese umfassen elektro ^{1,18 19,} Bildgebung und immunchemische Techniken ^20,21, sowie die Isolierung von spezifischen Zelltypen durch Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS) für den Aufbau von Zell-spezifische cDNA-Bibliotheken ^22,23. Gen-Knockdown-Techniken wie RNA-Interferenz (RNAi) auf kultivierte C angewendet werden elegans-Zellen ¹ und ein neuartiges Verfahren unter Verwendung von metabolischer Markierung Azido-Zucker als Werkzeug für Glykoprotein Entdeckung wurde kürzlich für die in vitro kultiviert C entwickelt elegans Zellen ^24.

Im Ergebnis dehnt sich das Zellkulturverfahren der Anordnung of Techniken, die dem C angewendet werden können elegans-Modell in dem Bemühen, Gen-Funktion in Zusammenhang mit einem lebenden Organismus zu entschlüsseln. Wir beschreiben hier das Protokoll für die Kultivierung von C. elegans embryonalen Zellen in vitro, die weitgehend auf dem Protokoll zuerst von Christiansen und Kollegen ¹ beschrieben basiert.

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Protokoll

Sternchen (*) zeigen an neuen oder modifizierten Schritten im Vergleich zu Christensen et al. ¹

1. Material Einstellungs

1. Das Zellkulturverfahren erfordert große Mengen an Eiern von schwangeren Erwachsenen isoliert. Wachsen C. elegans auf Agar-Platten ausgesät 8P mit NA22 (durch C. elegans Genetic Consortium - CGC) Bakterien, um große Mengen von Eiern zu isolieren. In diesen Platten die Menge Pepton verwendet wird, ist 8-mal der Betrag, der normalerweise für die NGM-Platten verwendet. Je höher Peptonkonzentration trägt das Wachstum von Bakterien NA22 effizienter, was gegen OP50-, wachsen in dicken Schichten.

8P Platten Rezept:

Man löst 3 g NaCl, 20 g Bacto-Pepton, 25 g Agar in 1 l sterilem destilliertem Wasser und Autoklaven für 30 min. Lassen Sie das Medium kühl bei 55 ° C und fügen Sie dann steril filtriert 1 ml Cholesterin (5 mg / ml in EtOH), 1 ml 1 MgCl ₂1 ml MgSO ₄ und 25 ml KP-Puffer (Lager von 500 ml: 5 g K ₂ HPO _4, 30 g KH ₂ PO _4, pH-Wert 6,00). Gießen flüssigen Agar-Medium in 10 cm Petrischalen (25 ml / Platte).

2. Der nächste Tag verteilt die ganze Oberfläche jeder bereichert Pepton-Agar-Platte mit 1 ml NA22 E. coli über Nacht in 2XYT-Medien (16 g Trypton, 10 g Hefeextrakt, 5 g NaCl in 1 l sterilem Wasser, pH 7,0) bei 37 ° C. Diese Bakterien bilden eine reiche Nahrungsquelle, die eine dicke Schicht, die das Wachstum von großen Mengen von schwangeren Erwachsenen bilden. Lassen beimpften Platten über Nacht bei Raumtemperatur, um das Wachstum der Bakterien zu ermöglichen. Das Verfahren kann durch Inkubation bei 37 ° C für 4-5 h beschleunigt werden.
3. Übertragen Sie verhungerten Tiere geimpft 8P Platten. Waschen Sie weg von einer ausgehungerten Tiere NGM Platte mit 5-6 ml M9-Puffer oder Wasser und fügen Sie 1-2 ml dieser Suspension auf jeden 8P Platte.
4. Ermöglichen Wachstum und die Vermehrung der Tiere until die Platten bei Zusammenfluss von schwangeren Erwachsenen bevölkert.
5. Isolierung der für die Herstellung von C benötigt Eier elegans embryonalen Zellen, von der schwangeren Erwachsenen mit 5-6 ml Lyse-Lösung.

Die Lyse-Lösung Rezept

5 ml frischem Bleichmittel, 1,25 ml 10 N NaOH und 18,5 ml sterilem H ₂ O. Diese Mischung muss frisch zubereitet vor jedem Einsatz werden.

6. Waschen Sie die Eier von schwangeren Erwachsenen mit Ei Puffer isoliert:

Egg Puffer Rezept

118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl _{2, 2} mM MgCl _2, 25 mM Hepes, pH 7,3 Osmolarität 340 mOsm.

7. Entfernen Sie die Eierschale, die die Eier umgibt, durch Behandlung mit Chitinase. Chitinase ist ein Enzym mit der höchsten Aktivität bei sauren ^pH-25. Auflösen Chitinase (Sigma, Katalog-Nr. C6137) in Ei-Puffer pH 6,5 auf eine Endkonzentration von 2 mg / ml. Bewahren Sie die Chitinase LagerLösung bei -20 ° C in 1 ml Aliquots in sterilen 15 ml konischen Röhrchen. Aliquots bei -20 ° C bis zu einigen Monaten gelagert werden.
8. Wachsen C. elegans kultivierten Zellen auf Deckgläser autoklaviert (12 mm Durchmesser) mit Erdnuss-Lektin bedeckt. Auflösen Erdnuß-Lectin in sterilem Wasser (0,5 mg / ml). Peanut Lektin-Lösung sollte nicht gefiltert oder autoklaviert werden. Es ist auch nicht brauchen, um mit UV-Licht behandelt werden. Speicher 2 ml Aliquots bei -20 ° C für bis zu 6 Monate.
9. Kompletten Zellkulturmedium (500 ml) enthält 500 ml L-15-Kulturmediums von Gibco, 50 ml fötales Rinderserum (hitzeinaktiviert), 7,7 g Saccharose (45 mOsm), 5 ml 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin (2%). Das komplette Medium wird dann unter Verwendung eines 0,20 &mgr; m Porenfilter filtriert.

Beachten Sie, dass das Ei-Puffer und das Kulturmedium haben Osmolarität von 340 bis 345 mOsm auf. Denn im Gegensatz zu Säugerzellen, C. elegans-Zellen weisen eine relativ hohe Osmolaritätdass muss in Zahl bei der Herstellung von Lösungen, die in direktem Kontakt mit der Plasmamembran der Zellen kommen genommen wird. Die Rezepte dieser Reagenzien wurden angepasst, um die gewünschte Osmolarität, die mit einem Osmometer ¹ gemessen wurde, zu erreichen. Es ist nicht notwendig, einen Osmometer verwenden, wenn diese Rezepte genau befolgt und Sorgfalt bei der Herstellung dieser Reagenzien verwendet. Allerdings sollte man eine Osmoter verwenden, wenn andere Lösungen müssen darauf vorbereitet sein, deren Rezepte werden hier nicht gemeldet oder in einer der Publikationen, die C verwenden elegans kultivierten Zellen.

2. Egg Isolation

1. Es wird empfohlen, mit mindestens vier 8P Platten beginnen, um genug Eier für 12 Vertiefungen von kultivierten Zellen zu sammeln (in 24-Well-Platten).
2. Bevor Sie mit dem Verfahren aufzutauen eine Tube Lektin Erdnuss-Stammlösung. Platzieren autoklaviert Deck am Boden der Vertiefungen in einer Platte mit 24 Vertiefungen und mit 200 ul Erdnuß-Lectin auf die Deckgläser. Inkubation für 1 h oder until die Zellen bereit sind, beschichtet werden. Komplett entfernen die Erdnuss Lektin und waschen Sie die Vertiefungen einmal mit 1 ml sterilem Wasser autoklaviert. Vollständige Entfernung des Erdnuß-Lectin aus den Deck ist wichtig zur Vermeidung Zellverklumpung.
3. Von den Agar-Platten mit sterilen autoklaviertem Wasser waschen schwangeren Erwachsenen. Sammeln Sie die Suspension in zwei sterile 50 ml konischen Röhrchen. Lassen Sie die Röhrchen auf Eis für 5 min zur Ausfällung der Schnecken am Boden der Rohre (*) zu ermöglichen. Entfernen Sie das Wasser mit einem Transfer Plastikpipette und ersetzen Sie es mit frischen steril autoklaviert Wasser. Pellet Würmer durch Tisch-Zentrifugation bei 200 xg (~ 1.200 rpm) für 10 min (*). Wiederholen letzten Schritt mindestens 3 ist.
4. Übertragen Würmer in einem sterilen 15 ml konischen Röhrchen und pelle sie bei 200 × g (~ 1200 rpm) für 10 min (*). Höhere Zentrifugationsgeschwindigkeit nicht verwenden, um zu vermeiden das Sammeln der Bakterien an der Unterseite des Rohres als auch. Manchmal nach Zentrifugierungen die Würmer nicht vollständig pelletiert. After jeweils waschen und vor dem Entfernen der Überstand, legen Sie die Röhrchen für 5 min auf Eis. In gekühltem Wasser Würmer auszufällen zum Boden des Röhrchens.
5. Entfernen Sie das Wasser und geben Sie 5-6 ml Lyse-Lösung (siehe Material einrichten). Rock the Federung sanft für 5-10 min und dann beginnen die Überwachung Wurm Lyse unter dem Stereomikroskop alle 2-3 min. Ein Tropfen der Suspension kann auch auf ein Deckglas für eine einfachere Überprüfung platziert werden. Die Inkubationszeit variiert abhängig von der Frische der Bleichmittel, kaufen kleine Flaschen Bleichmittel, und öffnen Sie eine neue Flasche jeden Monat.
6. Wenn ~ 70-80% der Würmer werden lysiert (10 min von Beginn der Inkubation), stoppen Sie die Lyse-Reaktion durch Zugabe von 9 ml Ei-Puffer pH 7.3 (siehe Material einrichten). Zentrifugieren Sie die Suspension bei 200 xg (~ 1.200 rpm) für 10 min. Von diesem Punkt an eine Bunsenbrenner auf, die auf der Bank, um eine erneute Verunreinigung der Eier (*) zu verhindern.
7. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand mit einer sterilen Plastiktransferpipette und waschen das Pellet 3-4x mit Ei Puffer, bis die Lösung klar ist. Stellen Sie sicher, um das Pellet auch in der Eierpuffer während jeder Wäsche mischen.
8. Die Eier werden von den Tierkörpern unter Verwendung von 30% Saccharose-Lösung getrennt. Das Pellet in 2 ml steriler Ei-Puffer und 2 ml 60% Saccharose-Lösung (Lager in sterile Ei-Puffer). Gut mischen und zentrifugieren für 20 min bei 200 xg (~ 1.200 rpm) (*).
9. Die Röhren vorsichtig aus der Zentrifuge zu entfernen. Die Eier sind an der Oberseite der Lösung schweben. Mit einer Pipette und P1000 sterile Spitzen, übertragen alle Eier in ein frisches steriles 15 ml konischen Röhrchen.
10. 10 ml sterile Puffer Ei mit dem Rohr und Zentrifuge bei 200 × g (~ 1200 rpm) für 10 min. Wiederholen Sie den Wasch 3 x. Sicherzustellen, dass die Eier vollständig in das Ei während jedes Waschpuffer resuspendiert.

3. Embryonic Cells Dissoziation

Führen Sie die nächsten Schritte des Verfahrens unter sterilen Bedingungen mit einem Steril. Während Tiere sindKleid auf Bakterienplatten, der Waschungen und der Behandlung mit der Lyse-Lösung mit Bleichmittel sollten die meisten, wenn nicht zu eliminieren alle Bakterien. Somit eine Laminar-Abzugshaube an diesem Punkt des Verfahrens verhindert, dass neue Verunreinigung der Eiersuspension.

1. Resuspendieren pelletiert Eier in 1 ml 2 mg / ml Chitinase (Lager in Ei-Puffer pH 6.5 (*)) und übertragen sie auf eine neue sterile 15 ml konischen Röhrchen. Rock das Rohr für 10-30 min bei Raumtemperatur. Die genaue Inkubationszeit ändert sich entsprechend der Frische des Enzyms und der Temperatur des Raums und ist daher für jede Präparation bestimmt werden. Es wird empfohlen, die Überwachung der Eier unter einem Umkehrmikroskop die Zellkultur nach 10 min Inkubation zu starten. Hinweis: in unserer Erfahrung, erhöht niedrigen pH-Wert die Chitinase enzymatische Aktivität. Aus diesem Grund verwenden wir Ei-Puffer bei pH 6,5 bis Chitinase (Rezept oben berichtet, in der pH-Wert auf 6,5 mit NaOH) aufzulösen.
2. Bei ~ 80% der Eierschalen durch die verdauteChitinase-Behandlung (Fig. 1 AB), pelletieren Sie die Eier durch Zentrifugation bei 900 × g (~ 2500 rpm) für 3 min (*). Mit einer Pipette und P1000 sterile Spitzen, entfernen Sie vorsichtig den Überstand und 3 ml L-15-Medium (*).
3. Übertragen Sie die Eier in eine Platte Durchmesser 6 cm und sanft distanzieren die Zellen mit einem 10 ml sterile Spritze mit einer 18 G-Nadel ausgestattet. Überwachen Sie den Grad der Dissoziation, indem ein Tropfen der Suspension in eine frische Petrischale aus Kunststoff und durch Betrachtung unter dem Mikroskop. Während dieses Vorgangs Luft in die Spritze anzusaugen nicht zu schädlichen Zellen zu vermeiden. Weiterhin die Dissoziation bis ~ 80% der Zellen dissoziiert.
4. Filtern Sie die Suspension mit einer sterilen 5 um Millipore-Filter. Zellsuspensionen werden müssen, um Zellklumpen, unverdaute Eier und geschlüpften Larven entfernen gefiltert werden. Filter zusätzliche 4-5 ml frischem L-15-Medien durch den Filter, um alle Zellen zu erholen. Während des Filtrationsschritt Verwenden Sie nicht zu viel Kraft zu vermeiden, daMaging den Filter und / oder die Zellen.

4. Kultivieren von Zellen

1. Pellet die dissoziierten Zellen durch Zentrifugation bei 900 × g (~ 2500 rpm) für 3 min (*). Mit einem P1000 Pipette und sterilen Spitzen sorgfältig entfernen Sie alle den Überstand. Resuspendieren der pelletierten Zellen in komplette L-15-Medium und der Platte 1 ml / well. Die Menge des dem Medium zugesetzt wird, hängt von der Anzahl der 8P-Platten verwendet, die Mündung der Würmer auf den Platten, und die Art von Experimenten, die von den Zellen durchgeführt wird. Die Zelldichte kann unter Verwendung einer Zählkammer bestimmt. Für Patch-Clamp-Aufnahmen Beschichtungs-Dichte von ~ 230.000 Zellen / cm ² ist optimal.
2. Halten Sie die 24 Vertiefungen in einer Kunststoffplatte Tupperware-Behälter, nasse Handtücher um die Verdampfung des Kulturmediums zu vermeiden. Speicherung der Behälter in einem befeuchteten Inkubator bei 20 ° C und der Umgebungsluft.
3. Die Zellen sind in der Regel bereit, für die Experimente innerhalb von 24 Stunden, wenn die morphologische Differenzierung und ExpressIon der GFP-Marker sind abgeschlossen. Zellen in Kultur für bis zu 2 Wochen aufbewahrt werden, aber sie sind in der Regel die meisten gesunden bis zu 7-9 Tage nach der Plattierung. Das Medium muss einmal täglich an gesunden Zellen aufrechtzuerhalten ersetzt werden.

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Ergebnisse

C. elegans kultivierten Zellen zu differenzieren und Express-Zell-spezifische Marker

Christensen und Kollegen mit Trypanblaufärbung gezeigt, dass> 99% der embryonalen C. elegans Zellen überleben die Isolierungsverfahren. Am Tag 9 und 22 nach dem Plattieren, 85% und 65%, bzw. ¹ sind noch am Leben. Isoliert embryonalen C. elegans-Zellen müssen auf ein Substrat, um zu unterscheiden haften. Zellen, die Klumpen bilden nicht einhalten und es ist nicht klar,...

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Diskussion

C. elegans ist ein leistungsfähiges Modellorganismus für die Entschlüsselung der genetischen Pfade in der Entwicklung, Verhalten und Alterung beteiligt. Seine Bequemlichkeit liegt vor allem in der Leichtigkeit, mit der sie genetisch manipuliert werden können und von seiner kurzen Lebenszyklus. Trotz seiner Bequemlichkeit, C. elegans hat seine Grenzen. C elegans-Zellen sind klein und in einem unter Druck Cuticula, die die Anwendung von Verfahren, die direkten Zugriff auf die Zellen, wie ele...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Bacto Peptone	VWR International Inc.	90000-382
Difco Agar Granulated	VWR International Inc.	90000-784
Bacto Tryptone	VWR International Inc.	90000-284
Bacto Yeast Extract	VWR International Inc.	90000-724
Leibovitz's L-15 Medium (1x) Liquid	Invitrogen	11415-064
Fetal Bovine Serum	Invitrogen	16140-063
Penicillin-streptomycin	Sigma	P4333-100ML
Chitinase from Streptomyces Griseus	Sigma	C6137-25UN
NA22 Escherichia coli	Caenorhabditis Genetics Center
Peanut Lectin	Sigma	L0881-10MG
Sucrose	Sigma	57903-1KG
D-(+)Glucose	Sigma	67528-1KG
Ethylene glycol-bis (2-amin–thylether), N,N,N',N'- tetraacidic acid (EGTA)	Sigma	E0396-25G
Hepes	Sigma	H3375-500G
Cholesterol
NaCl	Sigma	57653-1KG
KCl	Sigma	P9333-500G
CaCl2	Sigma	C1016-500G
MgCl2	Sigma	M8266-100G
MgSO4	Sigma	M2643-500 g
K2HPO4	Sigma	P2222-500G
KH2PO4	Sigma	P9791-500G
NaOH	Sigma	S8045-500G
KOH	Sigma	P1767-500G
Ethanol
Autoclaved distilled H2O
Bleach
EQUIPMENT
101-1000 μl Blue Graduated Pipet Tips	USA Scentific	1111-2821
10 ml Sterilized Pipet Individually Wrapped	USA Scentific	1071-0810
Ergonomic Variable Volume (100-1000 μl) Pipettor with tip ejector	VWR International Inc.	89079-974
Portable Pipet Aid, Drummond	VWR International Inc.	53498-103
Transfer Plastic Pipet Sterile	VWR International Inc.	14670-114
15 ml Conical Tube	USA Scentific	1475-1611
50 ml Conical Tube	USA Scentific	1500-1811
Sterile 18 gauge Needles	Becton, Dickinson and Co.	305196
Sterile 10 ml Syringes	Becton, Dickinson and Co.	305482
Plastic Syringe Filters Corning 0,20 μm pore size	Corning	431224
Acrodic 25 mm Syringe filter w/5 μm versapor Membrane	VWR International Inc.	28144-095
60x15 mm Petri Dish Sterile	VWR International Inc.	82050-548
100x15 mm Petri Dish Sterile	VWR International Inc.	82050-912
12 mm Diameter Glass Coverslips	VWR International Inc.	48300-560
Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid	Thomas scientific	6902A09
Dumont #5- Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Centrifuge 5702	Eppendorf	022629883
Laminar Flow Hood
Inverted Microscope with x10 objective
Ambient air humidified Incubator