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要約

ここでは、胚での大規模培養のための改訂されたプロトコルを記述細胞エレガンス 。胚でエレガンスこの方法を用いてインビトロで培養した細胞は、細胞特異的な様式で遺伝子の発現を区別し、反復するように見える。他の組織から特定 ​​の細胞型の細胞または単離への直接アクセスを必要とする技術は、C.上に塗布することができる培養細胞エレガンス 。

要約

C.エレガンスは、遺伝的および分子技術を容易に適用可能な、強力なモデル系である。しかし最近まで、細胞及び特定の細胞型の単離に直接アクセスする必要の技術は、C.に適用できなかった虫 。この制限は、組織が容易に酵素及び/又は界面活性剤で処理することによって消化されない加圧されたキューティクル内に閉じ込められるという事実によるものであった。 1は Cを培養するための堅牢な方法を開発したレアードブルーム、クリステンセンらが先駆者の仕事に基づいて大規模に胚細胞エレガンス 。卵は、漂白/ NaOHで処理することによって妊娠成人から単離し、続いて卵の殻を除去するキチナーゼで処理される。胚細胞は、その後、手動ピペッティングにより分離し、血清富化培地中の基質で覆われたガラス上にプレーティングする。アイソレーション·セルの24時間以内に形態を変更することにより、および細胞特異的マルケを発現させることにより、分化し始めるRS。C.エレガンスこの方法を用いて培養した細胞は、 インビトロで 2週間まで生存し、電気生理学的、免疫のために使用されており、それらはソートされ、マイクロアレイプロファイリングのために使用されているような画像は、同様に解析する。

概要

線虫（Caenorhabditis elegans）（虫 ） は、細胞の機能、分化、および行動の分子基盤を調査するための強力なモデル生物である。そのゲノム、代謝および生合成経路は、脊椎動物'に似ていますが、その遺伝的および分子扱いやすには、2はるかに大きい。その利点の中でも、その大きさと単純な解剖学的構造、その迅速なライフサイクル（25℃で3日間）、短寿命（2週）および子孫の大多数（> 200）である。 、その雌雄同体自然と短いライフサイクルに、分子·遺伝子操作は、C言語で簡単ですトランスジェニック動物3,4、およびそのようなRNA干渉5のような遺伝子ノックダウン技術の適用の生成を含む線虫、C.虫体と卵の殻が透明です。従って細胞は、容易に標準的な顕微鏡を使用して、成体および胚の両方で可視化することができる。過去40年間で、C.虫 コミュニティは、C.のための非常に貴重なリソースを作成しました突然変異体、ノックアウトおよびトランスジェニックの大規模なコレクション、神経系8の完全復興を含む解剖学と開発6,7の詳細な説明、よく注釈付きやコミュニティ全体で使用可能な完全に配列ゲノム（含む虫研究 www.wormbase.com ）。

多くの利点にもかかわらず、いくつかの実験的アプローチは、C言語で挑戦してきた虫 。これらは、組織または細胞型の細胞および単離の原形質膜へのアクセス可能性を必要とするものが挙げられる。確かにC。虫の組織は簡単に酵素処理または界面活性剤によって消化されない、その加圧された流体静力学的骨格内に閉じ込められる。 1990年代の終わりに、ミリアム·グッドマンとジャネットリッチモンドでの電気生理学的記録のための方法を開拓した虫その場 9,10 の神経細胞や筋肉細胞。これらの方法は、生体内での神経や筋肉の機能に私たちに重要な洞察を与えたが、彼 ​​らは挑戦的で低スループットである。 インビボで細胞機能を研究するための代替方法は、主に、特に、そのようなGCamPとカメレオン11-13として遺伝的にコードされたカルシウムセンサを用いてインビボカルシウムイメージングでは 、開発した。彼らは無傷で生きている動物に適用されるため、これらの方法は、しかし、薬理学的なツールの使用を許可していない。

培養にて最初の試み大規模な生体外での線虫細胞は、彼の博士論文14の調製時レアード·ブルームによって作られた。残念ながら、基板に対する細胞の接着不良で遭遇する困難は、貧弱な細胞分化および生存は、堅牢な細胞培養法として、この初期のプロトコルの確立を防止する。 1995年にエドガーらは手順を公表単一のCの単離および培養することによって細胞分裂と形態形成を調査する。虫は 15胚。酵素処理と手動解離の組み合わせで卵の殻の消化によって得られた胚細胞は、〜500のセル15までの生産、増殖し続けた。その後、レオンらは腸の形態形成を研究する割球数の少ない培養した。彼らは、1 試験管内孤立のE割球は、頂端接着結合16を介して互いに相互作用することにより、腸管腔に類似した構造を作成した偏腸細胞を生成することを示した。ブフナーらはまた、Cを培養するための同様の方法を報告した。試験管 17 内の胚細胞エレガンス 。

この初期の研究に基づいて、クリステンセンらは、胚のCを培養するための堅牢なプロトコルを開発した。試験管 1 で細胞エレガンス 。彼らその孤立したCが示された。虫細胞は、様々な細胞型に分化し、細胞特異的マーカーの発現を含め、それらがインビボで有する機能を維持することができる。 インビボで挑戦しているいくつかの技術は、単離されたC.上に塗布することができる胚細胞エレガンス 。これらは、電気生理学1,18 19、撮像、免疫化学的技法20,21、ならびに細胞特異的cDNAライブラリーの構築のため22,23（FACS）を蛍光活性化セルソーティングにより特定の細胞型の単離を含む。このようなRNA干渉（RNAi）などの遺伝子ノックダウン技術は、培養されたC.上に塗布することができる虫細胞1および糖タンパク質の発見のためのツールとしてアジド糖を用いて新規な代謝標識法は最近、 インビトロで培養C.ために開発されている虫の細胞24。

結論として、細胞培養法は、アレイを展開oをC.に適用することができるfの技法生体の文脈において遺伝子機能を解読するための努力においてエレガンスモデル 。ここではCを培養するためのプロトコルを記述大部分は最初のクリスチャンセンら1によって記述されたプロトコルに基づいており、in vitroで胚細胞を、 虫 。

プロトコル

クリステンセンらと比較して、アスタリスク（*）は、新規または変更されたステップを示している。1

1。素材のセットアップ

  1. 細胞培養手順が妊娠成人から単離された卵を大量に必要とする。 Cを育てる卵を大量に分離するために、細菌- エレガンス 8P寒天プレート上NA22（CGC 虫遺伝コンソーシアムを通じて利用可能）を播種。これらのプレートに用いられるペプトンの量は、通常、NGMプレートのために使用される8倍の量である。高いペプトン濃度が厚い層に成長するためにどの反しOP50-、より効率的NA22細菌の成長を支える。

8Pプレートレシピ：

3グラムのNaCl物、20gバクト - ペプトン、30分間の滅菌蒸留水を、オートクレーブ1L中25gの寒天を溶解する。 MgCl 2を 55℃で培地が冷えて、次にコレステロールの滅菌濾過した1ミリリットル（EtOH中5ミリグラム/ ml）を追加し、1の1ミリリットル、MgSO 4を1mlの緩衝液およびKP（500ミリリットルのストック：5gのK 2 HPO 4、30gのKH 2 PO 4、pHは6.00）を25ml。 10センチメートルペトリ皿（25ミリリットル/プレート）内に液体寒天培地を注ぐ。

  1. 翌日、NA22 E. 1mlの各富化ペプトン寒天プレートの表面全体に広がる2XYTメディア（16グラムトリプトン、10gの酵母エキス、滅菌水、pH7.0の1L中に5グラムのNaCl）、37℃で一晩培養した大腸菌中これらの細菌は妊娠成人の大量増殖を支持する厚い層を形成する豊富な食物源を構成している。細菌の増殖を可能にするために、室温で一晩播種したプレートを残す。プロセスは4-5時間37℃でインキュベートすることによって加速することができる。
  2. 播種8Pプレートに飢えた動物を転送します。 5-6 M9バッファーまたはmlの水を使用して飢えNGMプレートを動物に洗い落とし、各8Pプレートにこの懸濁液1〜2 mLを加え。
  3. 動物の成長および増殖をUNT許すILプレートは妊娠大人合流点に移入されます。
  4. Cの調製に必要な卵を隔離溶解溶液5-6ミリリットル用い妊娠成人からの胚細胞を、 エレガンス 。

溶解液のレシピ

新鮮なブリーチの5ミリリットル、10 N NaOHを1.25ミリリットル及び滅菌H 2 Oの18.5ミリリットルこの混合物は、それぞれを使用する前に新たに調製しなければならない。

  1. 卵の緩衝液を使用して妊娠成人から分離された卵を洗う。

卵バッファレシピ

118のNaCl、48のKCl、2mMのCaCl 2を 、2mMのMgCl 2、25mMのHepes、pH7.3の、オスモル濃度340ミリオスモル。

  1. キチナーゼで処理することにより、卵を取り囲んで卵殻を削除します。キチナーゼは酸性pH 25で最大活性を有する酵素である。 2 mg / mlの最終濃度卵緩衝液pH6.5中キチナーゼ（Sigma社、カタログ番号C6137）を溶解する。キチナーゼの在庫を保管無菌15ミリリットル中に1ミリリットルのアリコートで-20℃円錐管での解。アリコートを数ヶ月まで、-20℃までで保存することができる。
  2. Cを育てるピーナッツレクチンで覆われてオートクレーブしたカバーガラス（直径12mm）上の線虫の培養細胞。滅菌水（0.5 mg / ml）を中にピーナッツレクチンを溶かす。ピーナッツレクチン溶液を濾過またはオートクレーブ処理してはならない。また、UV光で処理する必要がない。最長6ヶ月間-20℃で保存2ミリリットルのアリコート。
  3. 完全な細胞培養培地（500ml）をGibco社50mlのウシ胎児血清（熱不活化）、7.7グラムのスクロース（45ミリオスモル）、100 U / mlのペニシリンおよび100μg/ml5mlの/から500ミリリットルL-15培地を含有するストレプトマイシン（2％）。完全培地を、次いで、0.20μmのポアフィルターを用いて濾過する。

卵液と培養液をそれぞれ340の浸透圧および345 mOsmであることに注意してください。実際に、哺乳動物細胞に反して、C.虫細胞が比較的高い浸透圧を持っているそれは、細胞の原形質膜と直接接触するソリューションを調製する場合、カウントに入れる必要がある。これらの試薬 ​​のレシピは1浸透圧計を用いて測定した所望の容量オスモル濃度に達するように調整した。なお、これらのレシピは正確に従っているとの注意をこれらの試薬を調製する際に使用される場合、浸透圧計を使用する必要はない。他のソリューションは、そのレシピここで報告されていないか、またはCを使用するパブリケーションのいずれかで、準備する必要がある場合は、1がosmoterを使用する必要があります培養細胞エレガンス 。

2。卵の分離

  1. これは、（24ウェルプレート）で培養した細胞の12ウェルについて十分な卵を収集するために、少なくとも4 8Pプレートで始めることをお勧めします。
  2. 手順を開始する前にピーナッツレクチン原液の1のチューブを解凍する。 24ウェルプレートのウェルの底にオートクレーブしたカバーガラスを置き、カバーグラスにピーナツレクチンを200μlを加える。 1時間またはuインキュベート細胞ntilめっきされる準備ができている。完全にピーナッツレクチンを削除し、滅菌オートクレーブ処理水1mlで一度井戸を洗浄します。カバースリップからピーナッツレクチンの完全な除去は、細胞凝集を避けるために不可欠である。
  3. 無菌オートクレーブ処理水を用いた寒天平板から妊娠成人を洗ってください。 2の滅菌コニカル50ミリリットルチューブにサスペンションを収集します。チューブ（*）の一番下にあるワームの沈殿を可能にするために、最大5分間氷上でチューブを残す。転送プラスチックピペットを用いて水を除去し、新しい滅菌オートクレーブした水と交換してください。 10分（*）のための200 XG（〜1,200 rpm）で卓上型遠心分離によってペレットワーム。少なくとも3この最後の手順を繰り返します。
  4. 無菌15ミリリットルコニカルチューブにワームを転送し、200×gで10分間（〜1,200 RPM）（*）でそれらをペレット化。だけでなく、チューブの底に菌を収集避けるために、より高い遠心分離速度を使用しないでください。時々、遠心分離後にワームが完全にペレット化されていません。 AFTERは、各洗浄·除去する前に上清を、氷上で5分間チューブを配置します。冷水ワームズチューブの底に沈殿する。
  5. 水を除去し、溶解液5-6 mLを加え（素材のセットアップを参照してください）​​。 5〜10分間静かにサスペンションロックしてから2〜3分ごとに実体顕微鏡下でワームの溶解の監視を開始。懸濁液を一滴も容易に検査のためにカバースリップ上に配置することができる。インキュベーション時間は、漂白剤の鮮度が異なることもあり、漂白剤の小瓶を購入し、毎月新しいボトルを開きます。
  6. 〜ワームの70〜80％が（インキュベーションの開始から10分）を溶解している場合、（素材のセットアップを参照）卵液pH 7.3の9ミリリットルを追加することにより、溶解反応を停止させる。 10分間200×gで（〜1,200 rpm）で懸濁物を遠心分離する。この時点で、オンから卵（*）の再汚染を防止するためにベンチに、上のブンゼンバーナーを有する。
  7. 注意深く滅菌プラスチックトランスファーピペットを用いて上清を除去し、ペレットを洗浄3-4卵のバッファーでX溶液が透明になるまで。各洗浄中に卵のバッファにペレットをよく混ぜにしてください。
  8. 卵を30％ショ糖溶液を用いて動物の死体から分離される。無菌卵液2mlにペレットを再懸濁し、60％ショ糖溶液（無菌卵バッファの株式）の2ミリリットルを追加します。よく混ぜると200 XG（〜1,200 RPM）（*）で20分間遠心する。
  9. 慎重に遠心機からチューブを取り外します。卵は、溶液の上部に浮遊している。 P1000ピペッターおよび滅菌チップを使用して、新しい滅菌15ミリリットルコニカルチューブにすべての卵を移す。
  10. 10分間200×gで（〜1,200 rpm）で遠心チューブに無菌卵緩衝液10mlを追加します。洗浄を3×を繰り返します。卵は完全に洗浄中に卵の緩衝液に再懸濁していることを確認します。

3。胚細胞解離

層流フードを使用して無菌条件下で手順の次のステップを行っています。動物がいる間細菌プレート上でガウン、漂白剤を含む溶解液で洗浄および治療がないがほとんどすべての細菌を排除する必要があります。したがって手順のこの時点で層流フードを使用して卵懸濁液の新たな汚染を防止する。

  1. 再懸濁は、2 mg / mlのキチナーゼ（卵液pH 6.5（*）の株式）の1ミリリットル中に卵をペレット化し、新しい滅菌15ミリリットルコニカルチューブに転送。室温で10から30分間、チューブを揺する。正確なインキュベーション時間は、酵素と部屋の温度の鮮度に応じて変化するので、それぞれの調製物について決定されるべきである。これは、インキュベーションの10分後に反転し、細胞培養、顕微鏡下で卵の監視を開始することをお勧めします。注意：我々の経験では、低pHはキチナーゼ酵素活性を増加させる。このような理由から、我々はキチナーゼ（pHはNaOHを用いて6.5​​に調整した上で報告されたレシピを、）を溶解するためにpH6.5で卵のバッファを使用しています。
  2. 〜卵の殻の80％はで消化されるとキチナーゼ処理（ 図1-B）は 、900×gで3分間（〜2,500 RPM）（*）で遠心分離して卵をペレット化。 P1000ピペッターおよび滅菌チップを使用して、慎重に上清を除去し、L-15培地（*）の3ミリリットルを追加します。
  3. 直径6cmプレートに卵を移し、ゆっくりと18 Gの針を装備した10ミリリットルの無菌注射器を用いて細胞を解離する。新鮮なプラスチック製のシャーレにサスペンションのドロップを配置することにより、顕微鏡下で表示することにより、解離度を監視します。細胞の損傷を防ぐために、この手順の間、注射器内に空気を吸引しないでください。細胞の80％が解離して〜まで解離を継続する。
  4. 滅菌5μmのミリポアフィルターを用いて懸濁液をろ過する。細胞懸濁液は、細胞凝集塊、未消化の卵と孵化した幼虫を除去するためにフィルタリングされなければならない。すべての細胞を回収するためにフィルタを介して新鮮なL-15メディアのさらに4〜5ミリリットルフィルター。 DAを避けるために、濾過工程の間に無理な力を加えないでください。フィルタおよび/または細胞をmaging。

4。細胞を培養

  1. 3分（*）のために900 XG（〜2,500 rpm）で遠心分離により分離した細胞をペレット化。 P1000ピペッターおよび滅菌チップを使用すると、慎重にすべての上清を除去します。完全なL-15培地とプレート1ミリリットル/ウェルでペレット化した細胞を再懸濁します。添加培地の使用量は、8Pプレートの数、プレート上のワームの合流点、および細胞上で行われる実験の種類に依存する。細胞密度を、血球計数器を用いて決定することができる。 〜23万細胞の密度でプレーティングパッチクランプ記録のために個/ cm 2が最適である。
  2. 培地の蒸発を回避するために、湿ったペーパータオルを含むプラスチックタッパーウェア容器に24ウェルプレートを保持する。 20℃、周囲の空気の加湿インキュベーターで容器を保管してください。
  3. 際形態的分化と発現する細胞は、24時間以内に通常の実験のための準備ができているGFPマーカーのイオンが完了している。細胞は、最大2週間培養中に保持することができるが、それらは播種後、通常7〜9日までの最も健康である。媒体は、健康な細胞を維持するために一日一回交換する必要がある。

結果

C.は、培養細胞が分化し、細胞特異的マーカーを発現する線虫

トリパンブルー染色を用いてクリステンセンらは、胚での> 99％を示した虫細胞が単離手順を生き残る。 9日目と22めっき後、それぞれ85％と65％は、まだ1生きている。孤立した胚で虫細胞は、区別するために、基板に接着しなければならない。フォーム塊を接着する?...

ディスカッション

線虫は、開発、行動や老化に関与する遺伝的経路を解読するための強力なモデル生物である。その利便性は、主にそれが遺伝子操作することができる容易さから、その短いライフサイクルから生じる。その便利さにもかかわらず、C.虫には限界があります。 で虫細胞は、そのような小さな電気生理学的及び薬理学的技術、またはこのようなマイクロアレイ解析による遺伝...

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
REAGENTS
Bacto PeptoneVWR International Inc.90000-382
Difco Agar GranulatedVWR International Inc.90000-784
Bacto TryptoneVWR International Inc.90000-284
Bacto Yeast ExtractVWR International Inc.90000-724
Leibovitz's L-15 Medium (1x) LiquidInvitrogen11415-064
Fetal Bovine SerumInvitrogen16140-063
Penicillin-streptomycinSigmaP4333-100ML
Chitinase from Streptomyces GriseusSigmaC6137-25UN
NA22 Escherichia coliCaenorhabditis Genetics Center
Peanut LectinSigmaL0881-10MG
SucroseSigma57903-1KG
D-(+)GlucoseSigma67528-1KG
Ethylene glycol-bis (2-amin–thylether), N,N,N',N'- tetraacidic acid (EGTA)SigmaE0396-25G
HepesSigmaH3375-500G
Cholesterol
NaClSigma57653-1KG
KClSigmaP9333-500G
CaCl2SigmaC1016-500G
MgCl2SigmaM8266-100G
MgSO4SigmaM2643-500 g
K2HPO4SigmaP2222-500G
KH2PO4SigmaP9791-500G
NaOHSigmaS8045-500G
KOHSigmaP1767-500G
Ethanol
Autoclaved distilled H2O
Bleach
EQUIPMENT
101-1000 μl Blue Graduated Pipet TipsUSA Scentific1111-2821
10 ml Sterilized Pipet Individually WrappedUSA Scentific1071-0810
Ergonomic Variable Volume (100-1000 μl) Pipettor with tip ejectorVWR International Inc.89079-974
Portable Pipet Aid, DrummondVWR International Inc.53498-103
Transfer Plastic Pipet SterileVWR International Inc.14670-114
15 ml Conical Tube USA Scentific1475-1611
50 ml Conical TubeUSA Scentific1500-1811
Sterile 18 gauge NeedlesBecton, Dickinson and Co.305196
Sterile 10 ml SyringesBecton, Dickinson and Co.305482
Plastic Syringe Filters Corning 0,20 μm pore size Corning431224
Acrodic 25 mm Syringe filter w/5 μm versapor MembraneVWR International Inc.28144-095
60x15 mm Petri Dish SterileVWR International Inc.82050-548
100x15 mm Petri Dish SterileVWR International Inc.82050-912
12 mm Diameter Glass CoverslipsVWR International Inc.48300-560
Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid Thomas scientific6902A09
Dumont #5- Fine Forceps Fine Science Tools11254-20
Centrifuge 5702Eppendorf022629883
Laminar Flow Hood
Inverted Microscope with x10 objective
Ambient air humidified Incubator

参考文献

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