Un metodo per la coltura embrionale<em&gt; C. elegans</em&gt; Celle

Riepilogo

Descriviamo qui un protocollo riveduto per la cultura su larga scala di embrionale C. elegans cellule. Embryonic C. elegans cellule coltivate in vitro utilizzando questo metodo, sembrano differenziare e ricapitolare l'espressione di geni in maniera specifica cella. Tecniche che richiedono l'accesso diretto alle cellule o l'isolamento di specifici tipi cellulari da altri tessuti possono essere applicati su C. elegans cellule in coltura.

Abstract

C. elegans è un potente sistema modello, in cui le tecniche genetiche e molecolari sono facilmente applicabili. Fino a poco tempo però, tecniche che richiedono l'accesso diretto alle cellule e isolamento di specifici tipi cellulari, potrebbero non essere applicate in C. elegans. Questa limitazione è dovuta al fatto che i tessuti sono confinati all'interno di una cuticola pressurizzato che non è facilmente digeribile mediante trattamento con enzimi e / o detergenti. Basata su lavoro di pioniere da Laird Bloom, Christensen e colleghi ¹ sviluppato un metodo affidabile per la coltura di C. elegans cellule embrionali in larga scala. Le uova sono isolati dagli adulti gravide mediante trattamento con candeggina / NaOH e successivamente trattati con chitinase per rimuovere i gusci d'uovo. Le cellule embrionali sono poi dissociate da pipettaggio manuale e piastrati su substrato di vetro ricoperto nei media siero arricchito. Entro 24 ore di celle di isolamento cominciare a differenziare cambiando la morfologia ed esprimendo cellule marke specificars. C. elegans cellule coltivate utilizzando questo metodo sopravvivono superiore 2 settimane in vitro e sono stati utilizzati per elettrofisiologica, immunochimici, imaging analisi così come sono state filtrate e utilizzati per microarray profiling.

Introduzione

Caenorhabditis elegans (C. elegans) è un potente organismo modello per studiare le basi molecolari della funzione cellulare, differenziamento, e il comportamento. Mentre il suo genoma, vie metaboliche e biosintetiche sono simili ai vertebrati ', la sua trattabilità genetica e molecolare sono di gran lunga maggiore ^2. Tra i suoi vantaggi sono la sua dimensione e semplice anatomia, il suo rapido ciclo di vita (3 giorni a 25 ° C), di breve durata (2 settimane) e il gran numero di figli (> 200). Grazie alla sua natura ermafrodita e breve ciclo di vita, manipolazioni molecolari e genetici sono semplici in C. elegans, compresa la generazione di animali transgenici ^3,4 e l'applicazione di tecniche di gene irrisori come RNA interference ^5. C. corpo elegans e guscio d'uovo sono trasparenti. Pertanto cellule possono essere facilmente visualizzati sia l'adulto e l'embrione utilizzando microscopia standard. Negli ultimi 40 anni, il C. elegans comunità ha creato risorse preziose per C. ricerca elegans cui una grande raccolta di mutanti, ko e transgenici, una descrizione dettagliata di anatomia e sviluppo ^6,7, compresa la completa ricostruzione del sistema nervoso ^8, e un genoma completamente sequenziato che è ben annotato e disponibile per tutta la comunità ( www.wormbase.com ).

Nonostante i numerosi vantaggi, alcuni approcci sperimentali sono stati difficili in C. elegans. Questi includono quelli che richiedono l'accessibilità alla membrana plasmatica delle cellule e l'isolamento di tessuti o tipi cellulari. Infatti C. tessuti elegans sono confinate all'interno della sua pressione scheletro idrostatico, che non è facilmente digerito dal trattamento enzimatico o detergenti. Alla fine degli anni 1990 Miriam Goodman e Janet Richmond pionieri metodi di registrazioni elettrofisiologiche di C. elegansneuroni e cellule muscolari in situ ^9,10. Mentre questi metodi ci ha dato importanti intuizioni neuronale e la funzione muscolare in vivo, sono impegnativi e bassa velocità. Erano stati sviluppati metodi alternativi per studiare la funzione delle cellule in vivo, per lo più in particolare nel calcio di imaging in vivo utilizzando sensori di calcio geneticamente codificato come GCamP e cameleon ^11-13. Questi metodi, però, non consentono l'utilizzo di strumenti farmacologici poiché applicati su animali viventi intatti.

Il primo tentativo di coltura C. elegans cellule in vitro in grande scala è stata fatta da Laird Bloom durante la preparazione della sua tesi di dottorato di ricerca ^14. Purtroppo, le difficoltà incontrate con scarsa adesione delle cellule al substrato, la differenziazione cellulare e la sopravvivenza povero impedito la creazione di questo protocollo presto come metodo di coltura cellulare robusto. Nel 1995 Edgar e colleghi hanno pubblicato una proceduraper indagare la divisione cellulare e la morfogenesi da isolamento e la coltura di una singola C. elegans embrioni ^15. Cellule embrionali ottenuti per digestione dei gusci d'uovo con una combinazione di trattamento enzimatico e dissociazione manuale, hanno continuato a proliferare, producendo fino a ~ 500 celle ^15. Successivamente, Leung e collaboratori hanno coltivato un piccolo numero di blastomeri di studiare morfogenesi intestinale. Essi hanno dimostrato che uno vitro isolato E blastomere prodotta in cellule intestinali polarizzate che ha creato una struttura analoga a lume intestinale interagendo tra loro attraverso adherens apicali svincoli ^16. Buechner e colleghi hanno anche segnalato un metodo simile per la coltura C. elegans cellule embrionali in vitro ^17.

Sulla base di questo primo lavoro, Christensen e colleghi hanno sviluppato un protocollo robusto per la coltura embrionale C. elegans cellule in vitro ^1. Essiha dimostrato che isolato C. elegans cellule possono differenziarsi in vari tipi di cellule e preservare le caratteristiche che possiedono in vivo, compresa l'espressione di marcatori cellula-specifici. Diverse tecniche che sono impegnativi in vivo, possono essere applicati su isolato C. elegans cellule embrionali. Questi includono elettrofisiologico ^{1,18 19,} imaging e tecniche immunochimiche ^20,21, così come l'isolamento di specifici tipi cellulari da cellule fluorescenti-Activated (FACS) per la costruzione di librerie di cDNA cellula-specifici ^22,23. Gene knockdown tecniche come RNA interference (RNAi) possono essere applicati su coltura C. elegans celle ¹ e un metodo di marcatura metabolica romanzo utilizzando Azido zucchero come strumento per la scoperta glicoproteina è stato recentemente sviluppato per C. coltivate in vitro elegans cellule ^24.

In conclusione, il metodo di coltura cellulare espande la matrice of tecniche che possono essere applicate al C. modello elegans nel tentativo di decifrare funzione genica nel contesto di un organismo vivente. Descriviamo qui il protocollo per la coltura di C. elegans cellule embrionali in vitro, che è in gran parte basata sul protocollo prima descritto da Christiansen e colleghi ^1.

Protocollo

Asterischi (*) indicano passaggi nuovi o modificati rispetto alla Christensen et al. ¹

1. Setup materiale

1. La procedura di coltura cellulare richiede grandi quantità di uova isolato dagli adulti gravide. Crescere C. elegans su 8P piastre di agar seminato con NA22 (disponibile attraverso il C. elegans Consorzio genetica - CGC) batteri per isolare grandi quantità di uova. In queste tavole la quantità di peptone usata è 8 volte l'importo che viene normalmente utilizzato per piastre NGM. La concentrazione peptone superiore sostiene la crescita di batteri NA22 più efficiente, che contrariamente a OP50-, crescere in strati spessi.

8P piatti ricetta:

Sciogliere 3 g di NaCl, 20 g Bacto-Peptone, 25 g di agar in 1 L di acqua distillata sterile e autoclave per 30 min. Lasciare il mezzo raffreddare a 55 ° C e poi aggiungere filtrata sterile 1 ml di colesterolo (5 mg / ml in EtOH), 1 ml di 1 MgCl ₂, 1 ml di _MgSO4 e 25 ml di tampone KP (Stock di 500 ml: 5 g K ₂ HPO _4, 30 g di KH ₂ PO _4, pH 6,00). Versare agar liquido in 10 centimetri piastre di Petri (25 ml / piastra).

2. Il giorno successivo sviluppa l'intera superficie di ciascuna piastra di agar peptone arricchito con 1 ml di NA22 E. coli overnight coltivate in mezzi 2xYT (16 g di triptone, estratto di lievito 10 g, 5 g di NaCl in 1 L di acqua sterile, pH 7,0) a 37 ° C. Questi batteri costituiscono una fonte di cibo abbondante che formerà uno strato spesso sostenere la crescita di grandi quantità di adulti gravide. Lasciare le piastre seminate notte a temperatura ambiente per consentire la crescita dei batteri. Il processo può essere accelerato mediante incubazione a 37 ° C per 4-5 ore.
3. Di trasferire gli animali affamati per seminate 8P piatti. Lavare gli animali fuori un piatto NGM affamato con 5-6 ml di tampone M9 o acqua e aggiungere 1-2 ml di questa sospensione di ogni piatto 8P.
4. Consentire la crescita e la moltiplicazione degli animali untIL le piastre sono popolati a confluenza dagli adulti gravide.
5. Isolare le uova necessarie per la preparazione di C. elegans cellule embrionali, dagli adulti gravide con 5-6 ml di soluzione di lisi.

Soluzione di lisi ricetta

5 ml di Fresh Bleach, 1,25 ml di NaOH 10 N e 18,5 ml di H ₂ O. sterile Questa miscela deve essere preparata fresca prima di ogni utilizzo.

6. Lavare le uova isolate dagli adulti gravide con tampone uovo:

Tampone Egg ricetta

118 mM NaCl, KCl 48 mM, 2 mM CaCl _2, 2 mM MgCl _2, 25 mM Hepes, pH 7,3, osmolarità 340 mOsm.

7. Rimuovere il guscio che circonda le uova per trattamento con chitinasi. Chitinasi è un enzima con attività massima a pH acido ^25. Sciogliere chitinasi (Sigma, catalogo n. C6137) in uovo tampone pH 6,5 ad una concentrazione finale di 2 mg / ml. Conservare il chitinasi magazzinosoluzione a -20 ° C in aliquote da 1 ml a 15 ml provette coniche sterili. Aliquote possono essere conservati a -20 ° C fino a pochi mesi.
8. Crescere C. cellule in coltura elegans su vetrini in autoclave (diametro 12 mm) rivestiti di arachidi lectina. Sciogliere arachidi lectina in acqua sterile (0,5 mg / ml). Soluzione lectina Peanut non deve essere filtrata o in autoclave. Inoltre non deve essere trattato con luce UV. Negozio 2 ml aliquote a -20 ° C per 6 mesi.
9. Mezzo completo di coltura cellulare (500 ml) contiene 500 ml L-15 terreno di coltura da Gibco, 50 ml di siero fetale bovino (inattivato con il calore), 7,7 g di saccarosio (45 mOsm), 5 ml di 100 U / ml penicillina e 100 mg / ml di streptomicina (2%). Il terreno completo viene quindi filtrato usando un filtro pori 0.20 micron.

Si noti che il buffer uovo e il mezzo di coltura hanno rispettivamente osmolarità di 340 e 345 mOsm. Infatti, contrariamente a cellule di mammifero, C. cellule elegans hanno una relativamente alta osmolaritàche deve essere preso in conteggio quando la preparazione di soluzioni che entreranno in contatto diretto con la membrana plasmatica delle cellule. Le ricette di questi reagenti sono stati adeguati per raggiungere l'osmolarità desiderato, che è stata misurata utilizzando un osmometer ^1. Non è necessario usare un osmometer se queste ricette sono seguite esattamente e cura viene utilizzato nella preparazione di questi reagenti. Tuttavia, si dovrebbe utilizzare un Osmoter se altre soluzioni devono essere preparate, le cui ricette non sono riportati qui o in una delle pubblicazioni che utilizzano C. elegans cellule in coltura.

2. Isolamento Egg

1. Si consiglia di iniziare con almeno quattro 8P piastre per raccogliere abbastanza uova per 12 pozzetti di cellule in coltura (in piastre da 24 pozzetti).
2. Prima di iniziare la procedura di scongelare un tubo di arachidi lectina soluzione stock. Posizionare coprioggetti autoclave al fondo dei pozzetti in una piastra da 24 pozzetti e aggiungere 200 ml di arachidi lectina alle lamelle. Incubare per 1 ora o di uino le cellule sono pronte per essere placcato. Rimuovere completamente i lectina di arachidi e lavare i pozzetti una volta con 1 ml di acqua sterile autoclave. La rimozione completa della lectina arachidi dalle coprioggetti essenziali per evitare aggregazione delle cellule.
3. Lavare il numero di adulti gravide al largo delle piastre di agar con acqua autoclave sterile. Raccogliere la sospensione in due sterile conica tubo da 50 ml. Lasciare le provette in ghiaccio per 5 minuti per consentire la precipitazione dei vermi nella parte inferiore dei tubi (*). Rimuovere l'acqua con una pipetta di trasferimento di plastica e sostituirla con acqua fresca autoclave sterile. Pellet worm da tavolo centrifugazione a 200 g (circa 1200 rpm) per 10 minuti (*). Ripetere quest'ultimo passaggio almeno 3.
4. Trasferire vermi in un tubo da 15 ml sterile e pellet a 200 g (circa 1200 rpm) per 10 min (*). Non utilizzare maggiore velocità di centrifugazione per evitare di raccogliere i batteri nella parte inferiore del tubo pure. A volte, dopo centrifugazioni i vermi non sono completamente pellet. After ogni lavaggio e prima del ritiro il surnatante, posizionare le provette per 5 minuti in ghiaccio. In refrigerata vermi acqua precipitano sul fondo della provetta.
5. Rimuovere l'acqua e aggiungere 5-6 ml di soluzione di lisi (vedi Material istituito). Rock the sospensione delicatamente per 5-10 minuti e poi iniziare il monitoraggio verme lisi con lo stereomicroscopio ogni 2-3 min. Una goccia di sospensione può essere posizionato anche su un vetrino per ispezioni. Il tempo di incubazione varia a seconda della freschezza della candeggina; acquistare piccole bottiglie di candeggina e aprire una nuova bottiglia ogni mese.
6. Quando ~ 70-80% di vermi vengono lisate (10 min dall'inizio dell'incubazione), arrestare la reazione di lisi aggiungendo 9 ml di tampone a pH 7.3 uovo (vedi Materiale impostato). Centrifugare la sospensione a 200 g (circa 1200 rpm) per 10 min. Da questo punto in un becco Bunsen su, sul banco per impedire la contaminazione delle uova (*).
7. Rimuovere con cautela il surnatante con una pipetta di trasferimento sterile in plastica e lavare il pellet 3-4x con tampone uovo fino a quando la soluzione è limpida. Assicurarsi di mescolare il bene pellet nel buffer uovo durante ogni lavaggio.
8. Le uova sono separate dalle carcasse animali usando la soluzione di saccarosio al 30%. Risospendere il pellet in 2 ml di tampone sterile uovo e aggiungere la soluzione di saccarosio 2 ml di 60% (magazzino in tampone uovo sterile). Mescolare bene e centrifugare per 20 minuti a 200 g (circa 1200 rpm) (*).
9. Rimuovere con cautela le provette dalla centrifuga. Le uova sono galleggianti nella parte superiore della soluzione. Usando una pipetta P1000 e punte sterili, trasferire tutte le uova in un tubo conico freschi 15 ml sterili.
10. Aggiungere 10 ml di tampone sterile uovo al tubo e centrifugare a 200 xg (~ 1.200 rpm) per 10 min. Ripetere il lavaggio 3 x. Assicurarsi che le uova sono completamente risospese in buffer uovo durante ogni lavaggio.

3. Cellule embrionali Dissociazione

Condurre le fasi successive della procedura in condizioni sterili utilizzando una cappa a flusso laminare. Mentre gli animali sonocamice su batteri lastre, i lavaggi e il trattamento con la soluzione di lisi contenente candeggina dovrebbe eliminare la maggior parte se non tutti i batteri. Quindi, usando una cappa laminare a questo punto del procedimento impedisce nuova contaminazione della sospensione uovo.

1. Risospendere uova pellet in 1 ml di 2 mg / ml chitinasi (magazzino in uovo tampone a pH 6.5 (*)) e trasferirli in un nuovo tubo da 15 ml sterile. Muovere la provetta per 10-30 minuti a temperatura ambiente. Il tempo esatto di incubazione varia a seconda della freschezza dell'enzima e la temperatura della stanza e dovrebbe quindi essere determinata per ogni preparazione. Si raccomanda di iniziare a monitorare le uova sotto un microscopio coltura cellulare invertita dopo 10 min di incubazione. Nota: nella nostra esperienza, basso pH aumenta l'attività enzimatica chitinasi. Per questo motivo utilizziamo tampone di uovo a pH 6,5 per sciogliere chitinasi (ricetta sopra riportato, dove il pH è regolato a 6,5 ​​con NaOH).
2. Quando ~ 80% dei gusci d'uovo sono digeriti daltrattamento chitinasi (Figure 1 AB), agglomerare le uova per centrifugazione a 900 xg (~ 2.500 rpm) per 3 minuti (*). Usando una pipetta P1000 e punte sterili, rimuovere con attenzione il surnatante e aggiungere 3 ml di L-15 (*).
3. Trasferire le uova in un piatto del diametro di 6 cm ed dissociare delicatamente le cellule utilizzando una siringa da 10 ml sterile dotata di un ago G 18. Monitorare il grado di dissociazione mettendo una goccia di sospensione in una piastra di Petri di plastica fresco e visualizzazione al microscopio. Non aspirare aria nella siringa durante questa procedura per evitare di danneggiare le cellule. Continuare la dissociazione fino al ~ 80% delle cellule sono dissociato.
4. Filtrare la sospensione con una sterile 5 micron filtro Millipore. Le sospensioni cellulari devono essere filtrati per eliminare grumi di cellule, uova non digeriti e larve schiuse. Filtrare supplementari 4-5 ml di fresco L-15 media attraverso il filtro di recuperare tutte le cellule. Non esercitare una forza eccessiva durante la fase di filtrazione per evitare daMaging del filtro e / o le cellule.

4. Coltura di cellule

1. Agglomerare le cellule dissociate mediante centrifugazione a 900 xg (~ 2.500 rpm) per 3 minuti (*). Usando una pipetta P1000 e punte sterili rimuovere con attenzione tutto il surnatante. Risospendere le cellule in pellet completo L-15 e la piastra 1 ml / pozzetto. La quantità del mezzo aggiunto dipende dal numero di piastre 8P utilizzato, la confluenza dei vermi sulle piastre, e il tipo di esperimenti che verranno eseguiti sulle cellule. La densità delle cellule può essere determinata utilizzando un emocitometro. Per le registrazioni di patch-clamp placcatura densità di circa 230.000 cellule / cm ² è ottimale.
2. Mantenere la piastra 24 pozzetti in un contenitore Tupperware di plastica contenente asciugamani di carta bagnati per evitare l'evaporazione del terreno di coltura. Conservare il contenitore in un incubatore umidificato a 20 ° C e l'aria ambiente.
3. Le cellule sono di solito pronti per gli esperimenti entro 24 ore quando la differenziazione morfologica ed espressoione di marcatori GFP sono completi. Le celle possono essere tenuti in coltura per un massimo di 2 settimane, ma di solito sono più sani fino a 7-9 giorni dopo la placcatura. Il mezzo deve essere sostituito una volta al giorno per mantenere le cellule sane.

Risultati

C. elegans cellule in coltura e differenziare cellule espresso marcatori specifici

Christensen e colleghi utilizzando trypan colorazione blu hanno dimostrato che il> 99% dei embrionale C. cellule elegans sopravvivono alla procedura di isolamento. Al giorno 9 e 22 dopo la placcatura, 85% e 65%, rispettivamente, sono ancora vivi ^1. Isolato embrionale C. cellule elegans devono aderire ad un substrato al fine di differenziare. Le cellule ch...

Discussione

C. elegans è un potente organismo modello per decifrare i meccanismi genetici coinvolti nello sviluppo, il comportamento e l'invecchiamento. La sua convenienza deriva principalmente dalla facilità con cui può essere geneticamente manipolato e dal suo ciclo di vita breve. Nonostante la sua convenienza, C. elegans ha i suoi limiti. C. elegans cellule sono minuscole e confinato all'interno di una cuticola pressurizzata che limita l'applicazione di metodi che richiedono l'access...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Bacto Peptone	VWR International Inc.	90000-382
Difco Agar Granulated	VWR International Inc.	90000-784
Bacto Tryptone	VWR International Inc.	90000-284
Bacto Yeast Extract	VWR International Inc.	90000-724
Leibovitz's L-15 Medium (1x) Liquid	Invitrogen	11415-064
Fetal Bovine Serum	Invitrogen	16140-063
Penicillin-streptomycin	Sigma	P4333-100ML
Chitinase from Streptomyces Griseus	Sigma	C6137-25UN
NA22 Escherichia coli	Caenorhabditis Genetics Center
Peanut Lectin	Sigma	L0881-10MG
Sucrose	Sigma	57903-1KG
D-(+)Glucose	Sigma	67528-1KG
Ethylene glycol-bis (2-amin–thylether), N,N,N',N'- tetraacidic acid (EGTA)	Sigma	E0396-25G
Hepes	Sigma	H3375-500G
Cholesterol
NaCl	Sigma	57653-1KG
KCl	Sigma	P9333-500G
CaCl2	Sigma	C1016-500G
MgCl2	Sigma	M8266-100G
MgSO4	Sigma	M2643-500 g
K2HPO4	Sigma	P2222-500G
KH2PO4	Sigma	P9791-500G
NaOH	Sigma	S8045-500G
KOH	Sigma	P1767-500G
Ethanol
Autoclaved distilled H2O
Bleach
EQUIPMENT
101-1000 μl Blue Graduated Pipet Tips	USA Scentific	1111-2821
10 ml Sterilized Pipet Individually Wrapped	USA Scentific	1071-0810
Ergonomic Variable Volume (100-1000 μl) Pipettor with tip ejector	VWR International Inc.	89079-974
Portable Pipet Aid, Drummond	VWR International Inc.	53498-103
Transfer Plastic Pipet Sterile	VWR International Inc.	14670-114
15 ml Conical Tube	USA Scentific	1475-1611
50 ml Conical Tube	USA Scentific	1500-1811
Sterile 18 gauge Needles	Becton, Dickinson and Co.	305196
Sterile 10 ml Syringes	Becton, Dickinson and Co.	305482
Plastic Syringe Filters Corning 0,20 μm pore size	Corning	431224
Acrodic 25 mm Syringe filter w/5 μm versapor Membrane	VWR International Inc.	28144-095
60x15 mm Petri Dish Sterile	VWR International Inc.	82050-548
100x15 mm Petri Dish Sterile	VWR International Inc.	82050-912
12 mm Diameter Glass Coverslips	VWR International Inc.	48300-560
Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid	Thomas scientific	6902A09
Dumont #5- Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Centrifuge 5702	Eppendorf	022629883
Laminar Flow Hood
Inverted Microscope with x10 objective
Ambient air humidified Incubator