Un procédé de culture embryonnaire<em&gt; C. elegans</em&gt; Cellules

Résumé

Nous décrivons ici un protocole révisé pour la culture à grande échelle de l'embryon C. elegans cellules. Embryonnaire C. elegans cellules cultivées in vitro à l'aide de cette méthode, semblent différencier récapituler et l'expression de gènes d'une manière spécifique de la cellule. Les techniques qui nécessitent un accès direct à des cellules ou à l'isolement de types de cellules spécifiques à partir d'autres tissus peuvent être appliquées sur C. elegans cellules cultivées.

Résumé

C. elegans est un puissant système de modèle, dans lequel des techniques génétiques et moléculaires sont facilement applicables. Jusqu'à récemment, cependant, les techniques qui nécessitent un accès direct à des cellules et l'isolement de types cellulaires spécifiques, ne pouvaient pas être appliquées dans C. elegans. Cette limitation est due au fait que les tissus sont confinés à l'intérieur d'une cuticule sous pression qui n'est pas facilement digéré par traitement avec des enzymes et / ou des détergents. Basé sur les premiers travaux de pionnier par Laird Bloom, Christensen et ses collègues ¹ développé une méthode robuste pour la culture de C. elegans cellules embryonnaires à grande échelle. Les oeufs sont isolés des adultes gravides par traitement avec l'eau de Javel / NaOH et ensuite traitées avec chitinase pour enlever les coquilles. Les cellules embryonnaires sont alors dissociées par pipetage manuel et étalées sur substrat de verre recouvert dans les médias de sérum enrichi. Dans les 24 heures de cellules d'isolement commencer à se différencier en changeant la morphologie et en exprimant Marke spécifique de cellulers. C. elegans cellules cultivées en utilisant cette méthode survivre jusqu'à deux semaines in vitro et ont été utilisés pour électrophysiologique, immunochimique, et l'imagerie des analyses aussi bien qu'ils ont été triés et utilisés pour microarray profilage.

Introduction

Caenorhabditis elegans (C. elegans) est un organisme modèle puissant pour l'étude des bases moléculaires de la fonction cellulaire, la différenciation et le comportement. Alors que son génome, les voies métaboliques et biosynthétiques sont similaires chez les vertébrés », sa traçabilité génétique et moléculaire sont beaucoup plus ^2. Parmi ses avantages sont sa taille et simple anatomie, son cycle de vie rapide (3 jours à 25 ° C), durée de vie courte (2 semaines) et un grand nombre de descendants (> 200). En raison de sa nature hermaphrodite et cycle de vie court, les manipulations génétiques et moléculaires sont simples dans C. elegans, y compris la génération d'animaux transgéniques ^3,4 et l'application de techniques de knock-down gènes tels que l'ARN interférence ^5. C. corps et la coquille elegans sont transparents. Par conséquent les cellules peuvent être facilement visualisés à la fois l'adulte et l'embryon au microscope standard. Au cours des 40 dernières années, le C. elegans communauté a créé des ressources inestimables pour C. recherche elegans notamment une grande collection de mutants, KO et transgéniques, une description détaillée de l'anatomie et de développement ^6,7, y compris la reconstruction complète du système nerveux ^8, et un génome entièrement séquencé qui est bien annoté et disponible à toute la communauté ( www.wormbase.com ).

Malgré les nombreux avantages, certaines approches expérimentales ont été difficiles en C. elegans. Ceux-ci comprennent ceux qui nécessitent l'accès à la membrane plasmique des cellules et l'isolement des tissus ou types cellulaires. En effet C. elegans tissus sont confinés à l'intérieur de son squelette hydrostatique sous pression, qui n'est pas facilement digéré par traitement enzymatique ou détergents. À la fin de 1990 Miriam Goodman et Janet Richmond pionnier des méthodes pour les enregistrements électrophysiologiques C. elegansles neurones et les cellules musculaires in situ ^9,10. Bien que ces méthodes nous ont donné des informations importantes sur neuronale et la fonction musculaire in vivo, ils sont difficiles et à faible débit. Des méthodes alternatives pour étudier la fonction des cellules in vivo ont été développés, notamment dans la plupart imagerie calcique in vivo en utilisant des capteurs de calcium génétiquement codés comme GCamP et cameleon ^11-13. Ces méthodes cependant, ne permettent pas l'utilisation d'outils pharmacologiques parce qu'ils sont appliqués sur des animaux vivants intacts.

La première tentative de culture C. cellules elegans in vitro à grande échelle a été faite par Laird Bloom lors de la préparation de sa thèse de doctorat ^14. Malheureusement, les difficultés rencontrées avec une mauvaise adhérence des cellules sur le substrat, la différenciation cellulaire et la survie médiocre ont empêché la mise en place de ce protocole rapide comme un procédé de culture cellulaire robuste. En 1995, Edgar et ses collègues ont publié une procédurepour enquêter sur la division cellulaire et de la morphogenèse par l'isolement et la culture d'un seul C. elegans embryons ^15. Les cellules embryonnaires obtenues par digestion des coquilles d'œufs avec une combinaison de traitement enzymatique et la dissociation d'emploi, ont continué à proliférer, produisant jusqu'à ~ 500 cellules ^15. Par la suite, Leung et collègues cultivées un petit nombre de blastomères d'étudier la morphogenèse intestinale. Ils ont montré que in vitro une blastomère isolé E produite cellules intestinales polarisées qui ont créé une structure analogue à celle de la lumière intestinale par l'interaction avec l'autre à travers les jonctions adhérentes apical ^16. Buechner et ses collègues ont également fait état ​​d'une méthode similaire pour la culture C. elegans cellules embryonnaires in vitro ^17.

Sur la base de ces premiers travaux, Christensen et ses collègues ont développé un protocole robuste pour la culture embryonnaire C. elegans cellules in vitro ^1. Ilsa montré que C isolé. elegans cellules peuvent se différencier en différents types de cellules et de maintenir les caractéristiques qu'ils possèdent in vivo, y compris l'expression de marqueurs spécifiques des cellules. Plusieurs techniques qui sont difficiles in vivo, peuvent être appliqués sur isolé C. elegans cellules embryonnaires. Il s'agit notamment de ^{1,18 19} électrophysiologique, l'imagerie et les techniques immunochimiques ^20,21, ainsi que l'isolement de types de cellules spécifiques par cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour la construction de banques d'ADNc spécifiques de cellules ^22,23. techniques de knock-down de gènes tels que l'ARN interférence (ARNi) peuvent être appliqués sur cultivées C. elegans cellules ¹ et une méthode de marquage métabolique roman utilisant azido-sucre comme un outil pour la découverte de la glycoprotéine a été récemment développé pour in vitro en culture C. elegans cellules ^24.

En conclusion, le procédé de culture de cellules élargit la gamme of techniques qui peuvent être appliquées à l'C. modèle elegans dans un effort pour déchiffrer la fonction des gènes dans le contexte d'un organisme vivant. Nous décrivons ici le protocole pour la culture de C. elegans cellules embryonnaires in vitro, qui est en grande partie basée sur le premier protocole décrit par Christiansen et ses collègues ^1.

Protocole

Les astérisques (*) indiquent des étapes nouvelles ou modifiées par rapport à Christensen et al. ^Une

Une. Matériel d'installation

1. Le mode opératoire de culture cellulaire nécessite de grandes quantités d'oeufs isolés des adultes gravides. Cultivez C. elegans sur 8P plaques de gélose ensemencée avec NA22 (disponible sur le C. elegans Consortium génétique - CGC) des bactéries à isoler de grandes quantités d'œufs. Dans ces plaques la quantité de peptone utilisée est 8 fois le montant qui est normalement utilisé pour les plaques NGM. La concentration de peptone supérieur soutient la croissance des bactéries NA22 plus efficace, qui, contrairement à OP50, grandir en couches épaisses.

8P plaques recette:

Dissoudre 3 g de NaCl, 20 g de Bacto-peptone, 25 g d'agar dans 1 litre d'eau distillée stérile et autoclave pendant 30 min. Laisser refroidir le milieu à 55 ° C puis ajouter stérile filtrés 1 ml de cholestérol (5 mg / ml dans de l'éthanol), 1 ml de 1 _MgCl2, 1 ml de MgSO ₄ et 25 ml de tampon KP (stock de 500 ml: 5 g de K ₂ HPO _4, 30 g de KH ₂ PO _4, pH 6,00). Verser le milieu de gélose de liquide dans des boîtes de Pétri de 10 cm (25 ml / plaque).

2. Le jour suivant, réparties sur toute la surface de chaque plaque de gélose peptone enrichi avec 1 ml de NA22 E. coli cultivées pendant une nuit dans un milieu YT 2x (16 g de tryptone, 10 g d'extrait de levure, 5 g de NaCl dans 1 litre d'eau stérile, pH 7,0) à 37 ° C. Ces bactéries constituent une source de nourriture abondante qui formera une couche épaisse de soutenir la croissance de grandes quantités d'adultes gravides. Laisser plaques ensemencées pendant une nuit à température ambiante pour permettre la croissance de la bactérie. Le procédé peut être accélérée par incubation à 37 ° C pendant 4-5 h.
3. Transfert animaux affamés à ensemencées 8P plaques. Lavez les animaux dans une assiette NGM affamés utilisant 5-6 ml de tampon M9 ou de l'eau et ajouter 1-2 ml de cette suspension à chaque plaque 8P.
4. Permettre la croissance et la multiplication des animaux untIL les plaques sont remplis au confluent des adultes gravides.
5. Isoler les œufs nécessaires à la préparation de C. elegans, à partir de cellules embryonnaires adultes gravides à l'aide de 5-6 ml de solution de lyse.

solution de lyse recette

5 ml d'eau de Javel, frais de 1,25 ml de NaOH 10 N et 18,5 ml de H ₂ O. stérile Ce mélange doit être préparée avant chaque utilisation.

6. Lavez les oeufs isolés des adultes gravides en utilisant un tampon d'oeuf:

recette de tampon Egg

118 mM de NaCl, 48 mM de KCl, 2 mM de _CaCl2, 2 mM _MgCl2, 25 mM Hepes, pH 7,3, osmolarité de 340 mOsm.

7. Retirer la coquille qui entoure les œufs par traitement avec chitinase. Chitinase est une enzyme avec une activité plus élevée à pH acide ^25. Dissoudre chitinase (Sigma, catalogue no. C6137) dans le tampon pH 6,5 oeuf à une concentration finale de 2 mg / ml. Rangez la chitinase actionssolution à -20 ° C en aliquotes de 1 ml dans des tubes coniques de 15 ml stériles. Des aliquotes peuvent être stockées à -20 ° C jusqu'à quelques mois.
8. Cultivez C. elegans cellules cultivées sur des lamelles couvre-autoclavées (diamètre 12 mm) recouverte d'arachide lectine. Dissoudre la lectine d'arachide dans de l'eau stérile (0,5 mg / ml). solution de lectine d'arachide ne doit pas être filtré ou autoclave. Il ne nécessite aussi être traités avec de la lumière UV. Magasin aliquotes de 2 ml à -20 ° C pour un maximum de 6 mois.
9. Complete milieu de culture de cellules (500 ml) contient 500 ml de milieu L-15 de culture à partir de Gibco, à 50 ml de sérum bovin fœtal (inactivé par la chaleur), 7,7 g de saccharose (45 mOsm), 5 ml de 100 U / ml de pénicilline et de 100 pg / ml de streptomycine (2%). Le milieu complet est ensuite filtré en utilisant un filtre à pores de 0,20 um.

On notera que la mémoire tampon d'oeuf et le milieu de culture ont une osmolarité de 340 mOsm et 345 respectivement. En effet, contrairement aux cellules de mammifères, C. cellules elegans ont un niveau relativement élevé osmolaritéqui doit être pris en compte lors de la préparation des solutions qui vont venir en contact direct avec la membrane plasmique des cellules. Les recettes de ces réactifs ont été ajustés pour atteindre l'osmolarité souhaitée, qui a été mesurée à l'aide d'un osmomètre ^1. Il n'est pas nécessaire d'utiliser un osmomètre si ces recettes sont suivies à la lettre et les soins sont utilisés dans la préparation de ces réactifs. Cependant, il faut utiliser un Osmoter si d'autres solutions doivent être préparés, dont les recettes ne sont pas signalés ici ou dans l'une des publications qui utilisent C. elegans cellules cultivées.

2. Isolation des oeufs

1. Il est recommandé de commencer avec au moins quatre 8P plaques de recueillir suffisamment d'œufs pour 12 puits de cellules cultivées (dans des plaques à 24 puits).
2. Avant de commencer la procédure décongeler un tube de solution arachide lectine du stock. Placer les lamelles autoclave au fond des puits dans une plaque à 24 puits et ajouter 200 ul de la lectine d'arachide pour les lamelles. Incuber pendant 1 heure ou uusqu'à les cellules sont prêtes à être plaqué. Supprimer complètement la lectine d'arachide et laver les puits une fois avec 1 ml d'eau stérile autoclave. L'élimination complète de la lectine d'arachide à partir des lamelles couvre-objet est essentielle pour éviter l'agglutination des cellules.
3. Laver les adultes gravides hors les plaques d'agar avec de l'eau stérile à l'autoclave. Recueillir la suspension en deux tube conique stérile de 50 ml. Laisser les tubes sur de la glace pendant jusqu'à 5 minutes pour permettre la précipitation des vers à la partie inférieure des tubes (*). Retirer l'eau avec une pipette de transfert en plastique et la remplacer avec de l'eau stérile frais autoclave. Pellet vers par table centrifugation à 200 xg (~ 1200 rpm) pendant 10 min (*). Répétez cette dernière étape au moins 3.
4. Transfert vers dans un tube de 15 ml conique stérile et un culot eux à 200 xg (~ 1200 rpm) pendant 10 min (*). Ne pas utiliser de plus grande vitesse de centrifugation pour éviter de recueillir des bactéries au fond du tube aussi bien. Parfois, après centrifugations les vers ne sont pas complètement culot. After chaque lavage et avant le retrait du surnageant, placer les tubes pendant 5 min sur la glace. Dans les vers de l'eau glacée pour précipiter le fond du tube.
5. Retirer l'eau et ajouter 5-6 ml de solution de lyse (voir Matériel mis en place). Basculez la suspension doucement pendant 5-10 minutes et ensuite commencer à surveiller ver lyse au microscope stéréoscopique chaque 2-3 min. Une goutte de suspension peut aussi être placée sur une lamelle couvre-objet pour faciliter l'inspection. Le temps d'incubation varie en fonction de la fraîcheur de l'eau de Javel; acheter de petites bouteilles d'eau de Javel et d'ouvrir une nouvelle bouteille chaque mois.
6. Lorsque ~ 70-80% de vers sont lysées (10 min à partir du début de l'incubation), arrêter la réaction de lyse en ajoutant 9 ml d'oeuf tampon pH 7,3 (voir Matériel mis en place). Centrifuger la suspension à 200 xg (~ 1200 rpm) pendant 10 min. De ce point sur un bec Bunsen sur, sur le banc pour éviter la recontamination des oeufs (*).
7. Retirez délicatement le surnageant à l'aide d'un transfert en plastique pipette stérile et laver le culot 3-4x avec un tampon d'oeuf jusqu'à ce que la solution est claire. Assurez-vous de mélanger le bien de granulés dans la mémoire tampon de l'œuf au cours de chaque cycle de lavage.
8. Les oeufs sont séparés des carcasses d'animaux en utilisant une solution de saccharose à 30%. Remettre en suspension le culot dans 2 ml de tampon d'oeuf stérile et ajouter une solution de saccharose à 2 ml de 60% (dans du tampon de magasin d'oeuf stérile). Bien mélanger et centrifuger pendant 20 min à 200 xg (~ 1200 rpm) (*).
9. Retirez délicatement les tubes de la centrifugeuse. Les œufs flottent à la surface de la solution. Aide d'une pipette P1000 et embouts stériles, transférer tous les oeufs dans un tube conique de 15 ml stériles frais.
10. Ajouter 10 ml de tampon d'oeuf stérile au tube et centrifuger à 200 x g (~ 1200 tpm) pendant 10 min. Répétez le lavage 3 x. Assurez-vous que les oeufs sont complètement remis en suspension dans le tampon d'oeufs pendant chaque cycle de lavage.

3. La dissociation des cellules embryonnaires

Effectuer les étapes suivantes de la procédure en conditions stériles sous une hotte à flux laminaire. Alors que les animaux sontrobe de bactéries plaques, les lavages et le traitement avec la solution de lyse contenant l'eau de Javel devrait éliminer la plupart sinon toutes les bactéries. Ainsi, à l'aide d'une hotte laminaire à ce stade de la procédure empêche une nouvelle contamination de la suspension d'oeuf.

1. Reprendre oeufs culot dans 1 ml de 2 mg / ml chitinase (stock tampon dans l'oeuf un pH de 6,5 (*)) et de les transférer à un nouveau tube de 15 ml conique stérile. Basculez le tube pour 10-30 min à température ambiante. Le temps d'incubation exacte varie en fonction de la fraîcheur de l'enzyme et de la température de la pièce et doit donc être déterminée pour chaque préparation. Il est recommandé de commencer à surveiller les œufs sous un microscope de culture cellulaire inversée après 10 min d'incubation. Remarque: dans notre expérience, un pH faible augmente l'activité enzymatique de la chitinase. Pour cette raison, on utilise un tampon d'oeuf à pH 6,5 pour dissoudre chitinase (recette indiquée ci-dessus, où le pH est ajusté à 6,5 avec du NaOH).
2. Lorsque ~ 80% des coquilles d'oeufs sont digérés par l'traitement de la chitinase (Figures 1 AB), les oeufs culot par centrifugation à 900 x g (~ 2500 tpm) pendant 3 min (*). Aide d'une pipette P1000 et embouts stériles, retirer délicatement le surnageant et ajouter 3 ml de milieu L-15 (*).
3. Transférer les oeufs dans une plaque de 6 cm de diamètre et de dissocier les cellules doucement à l'aide d'une seringue stérile de 10 ml équipée d'une aiguille 18 G. Surveiller le degré de dissociation en plaçant une goutte de suspension dans une boîte de Petri en matière plastique douce et par la visualisation au microscope. Ne pas aspirer de l'air dans la seringue au cours de cette procédure pour éviter d'endommager les cellules. Continuer jusqu'à ce que la dissociation ~ 80% des cellules sont dissociées.
4. Filtrer la suspension en utilisant un 5 um filtre Millipore stérile. Les suspensions cellulaires doivent être filtrés afin d'éliminer les grumeaux de cellules, les œufs non digérés et larves écloses. Filtrer 4-5 ml supplémentaires de frais L-15 médias à travers le filtre pour récupérer toutes les cellules. Ne pas utiliser une force excessive lors de l'étape de filtration pour éviter damaging le filtre et / ou les cellules.

4. La culture de cellules

1. Pellet les cellules dissociées par centrifugation à 900 x g (~ 2500 tpm) pendant 3 min (*). Aide d'une pipette P1000 et embouts stériles enlevez soigneusement tout le surnageant. Remettre en suspension le culot cellulaire dans complet milieu L-15 et la plaque 1 ml / puits. La quantité de milieu ajoutée est fonction du nombre de plaques utilisées 8P, la confluence des vers sur les plaques, et le type d'expériences qui seront effectuées sur les cellules. La densité cellulaire peut être déterminée en utilisant un hématimètre. Pour les enregistrements de patch-clamp de placage de densité de ~ 230 000 cellules / cm ² est optimal.
2. Conservez la plaque de 24 puits dans un récipient en plastique contenant Tupperware serviettes en papier humide pour éviter l'évaporation de milieu de culture. Stocker le récipient dans un incubateur humidifié à 20 ° C et l'air ambiant.
3. Les cellules sont généralement prêt pour les expériences dans les 24 h lorsque la différenciation morphologique et expression de marqueurs de la GFP sont terminées. Les cellules peuvent être maintenues en culture pendant 2 semaines, mais ils sont généralement plus sain jusqu'à 7-9 jours après placage. Le milieu doit être remplacé une fois par jour pour maintenir les cellules saines.

Résultats

C. elegans cellules cultivées se différencient et cellules expriment des marqueurs spécifiques

Christensen et ses collègues à l'aide de la coloration au bleu trypan démontré que> 99% des embryonnaire C. elegans cellules survivent à la procédure d'isolement. Au jour 9 et 22 après l'étalement, 85% et 65%, respectivement, sont encore vivantes ^1. Isolé embryonnaire C. cellules elegans doivent adhérer à un substrat afin de d...

Discussion

C. elegans est un organisme modèle puissant pour déchiffrer les voies génétiques impliqués dans le développement, le comportement et le vieillissement. Sa commodité provient principalement de la facilité avec laquelle il peut être manipulé génétiquement et de son cycle de vie court. Malgré sa commodité, C. elegans a ses limites. C. cellules elegans sont minuscules et confinée à l'intérieur d'une cuticule sous pression qui limite l'application des procédé...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Bacto Peptone	VWR International Inc.	90000-382
Difco Agar Granulated	VWR International Inc.	90000-784
Bacto Tryptone	VWR International Inc.	90000-284
Bacto Yeast Extract	VWR International Inc.	90000-724
Leibovitz's L-15 Medium (1x) Liquid	Invitrogen	11415-064
Fetal Bovine Serum	Invitrogen	16140-063
Penicillin-streptomycin	Sigma	P4333-100ML
Chitinase from Streptomyces Griseus	Sigma	C6137-25UN
NA22 Escherichia coli	Caenorhabditis Genetics Center
Peanut Lectin	Sigma	L0881-10MG
Sucrose	Sigma	57903-1KG
D-(+)Glucose	Sigma	67528-1KG
Ethylene glycol-bis (2-amin–thylether), N,N,N',N'- tetraacidic acid (EGTA)	Sigma	E0396-25G
Hepes	Sigma	H3375-500G
Cholesterol
NaCl	Sigma	57653-1KG
KCl	Sigma	P9333-500G
CaCl2	Sigma	C1016-500G
MgCl2	Sigma	M8266-100G
MgSO4	Sigma	M2643-500 g
K2HPO4	Sigma	P2222-500G
KH2PO4	Sigma	P9791-500G
NaOH	Sigma	S8045-500G
KOH	Sigma	P1767-500G
Ethanol
Autoclaved distilled H2O
Bleach
EQUIPMENT
101-1000 μl Blue Graduated Pipet Tips	USA Scentific	1111-2821
10 ml Sterilized Pipet Individually Wrapped	USA Scentific	1071-0810
Ergonomic Variable Volume (100-1000 μl) Pipettor with tip ejector	VWR International Inc.	89079-974
Portable Pipet Aid, Drummond	VWR International Inc.	53498-103
Transfer Plastic Pipet Sterile	VWR International Inc.	14670-114
15 ml Conical Tube	USA Scentific	1475-1611
50 ml Conical Tube	USA Scentific	1500-1811
Sterile 18 gauge Needles	Becton, Dickinson and Co.	305196
Sterile 10 ml Syringes	Becton, Dickinson and Co.	305482
Plastic Syringe Filters Corning 0,20 μm pore size	Corning	431224
Acrodic 25 mm Syringe filter w/5 μm versapor Membrane	VWR International Inc.	28144-095
60x15 mm Petri Dish Sterile	VWR International Inc.	82050-548
100x15 mm Petri Dish Sterile	VWR International Inc.	82050-912
12 mm Diameter Glass Coverslips	VWR International Inc.	48300-560
Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid	Thomas scientific	6902A09
Dumont #5- Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Centrifuge 5702	Eppendorf	022629883
Laminar Flow Hood
Inverted Microscope with x10 objective
Ambient air humidified Incubator