Kültürleme Embriyonik için bir yöntem<em&gt; C. elegans</em&gt; Hücreler

Özet

Biz embriyonik C. büyük ölçekli kültür için burada bir revize protokol açıklar hücreleri elegans. Embriyonik C. elegans Bu yöntemi kullanarak, in vitro olarak kültürlenmiş hücreler, bir hücre özel bir şekilde genlerin ekspresyonunu ayırt ve özetlemek için görünür. Doğrudan hücrelere erişimi ya da diğer dokulardan özel hücre tiplerinin izolasyonu gerektiren C teknikleri uygulanabilir kültür hücreleri elegans.

Özet

C. elegans genetik ve moleküler teknikler kolay uygulanabilir olduğu güçlü bir model sistem vardır. Yakın zamana kadar olsa da, hücreler ve özel hücre tiplerinin izolasyonu doğrudan erişim gerektiren teknikleri, C de uygulanamadı elegans. Bu sınırlama, dokuların kolayca enzimler ve / veya deterjan ile muamele ile sindirilmeyen bir basınçlı kütikül içinde sınırlı olmasından kaynaklanıyordu. Laird Bloom, Christensen ve ¹ C kültürleme için sağlam bir yöntem geliştirdi meslektaşları tarafından erken öncü çalışmalara dayanarak Büyük ölçekli embriyonik hücreleri elegans. Yumurta ağartıcı / NaOH ile işlenerek gebe yetişkin izole edilmiş ve daha sonra da yumurta kabuğu kaldırmak için çitinaz ile tedavi edilir. Embriyonik hücreler daha sonra el ile pipetleme ayrılmış ve serum zenginleştirilmiş ortam içinde alt-tabaka kaplı cam üzerine kaplanmıştır. Izolasyon hücrelerin 24 saat içinde morfolojisi değiştirerek ve hücre spesifik marke ifade ederek ayırt başlarrs. C. elegans, bu yöntem kullanılarak kültür hücreleri, in vitro olarak 2 hafta kadar hayatta kalma ve elektrofizyolojik, immünokimyasal için kullanılmıştır ve bu kriteri ve mikroarray kullanılmaktadır gibi görüntüleme de analiz eder.

Giriş

Caenorhabditis elegans (C. elegans) hücresel fonksiyonun, farklılaşma ve davranış moleküler temellerini araştıran güçlü bir model organizmadır. Genom, metabolik ve biyosentetik yollar omurgalılar 'benzer olmakla birlikte, genetik ve moleküler tractability ² çok daha fazladır. Avantajları arasında, onun büyüklüğü ve basit anatomi, onun hızlı yaşam döngüsü (25 ° C'de 3 gün), kısa ömürlü (2 hafta) ve yavrular çok sayıda (> 200) vardır. Nedeniyle hermaphroditic doğası ve kısa yaşam döngüsü, moleküler ve genetik manipülasyonlar C. basittir transgenik hayvanlarda ^3,4 ve bu RNA girişim ⁵ gibi gen knock-down tekniklerin uygulanması da dahil olacak elegans. C. elegans vücut ve yumurta kabuğu şeffaf. Bu nedenle hücreleri kolayca yetişkin ve standart mikroskopi kullanılarak embriyo hem de görülebilir. Son 40 yıl içinde, C. elegans topluluk C için çok değerli bir kaynak yarattı mutantlar, tırnakları ve transgeniklerinin geniş bir koleksiyon, sinir sistemi ⁸ tam yeniden yapılanma dahil anatomi ve geliştirme ^6,7 ayrıntılı bir açıklama, ve de açıklamalı ve bütün topluma mevcuttur tamamen sıralı genom (dahil elegans araştırma www.wormbase.com ).

Sayısız avantajlara rağmen, bazı deneysel yaklaşımlar C. zorlu olmuştur elegans. Bu dokular ya da hücre tiplerinin hücre ve tecrit plazma zarına erişim gerektiren olanları içerir. Gerçekten C. elegans dokular kolayca enzimatik muamele ya da deterjanların tarafından sindirilir değil onun basınçlı hidrostatik iskelet, içinde hapsedilir. 1990'ların sonunda Miriam Goodman ve Janet Richmond C elektrofizyolojik kayıtlar için yöntemler öncülük elegansin situ ^9,10 nöronlar ve kas hücreleri. Bu yöntemler bize nöronal ve in vivo kas fonksiyonu önemli bilgiler verirken, onlar zor ve düşük verim vardır. In vivo olarak, hücre fonksiyonlarını incelemek için alternatif yöntemler çoğunlukla, özellikle bu tür GCamP ve cameleon ^11-13 genetik olarak kodlanmış kalsiyum sensörler kullanılarak kalsiyum vivo görüntüleme, geliştirilmiştir. Onlar bozulmadan yaşayan hayvanlar üzerinde uygulanır çünkü bu olsa yöntemleri, farmakolojik araçların kullanımına izin vermez.

Kültür C'de ilk girişimi Büyük ölçekli in vitro hücre elegans doktora tezi ¹⁴ hazırlanmasında Laird Bloom tarafından yapıldı. Ne yazık ki, zorluklar substrata hücrelerin zayıf yapışması ile karşılaşılan, zayıf hücre farklılaşması ve hayatta kalma güçlü bir hücre kültür yöntemi olarak bu erken protokol kurulmasını engelledi. 1995 yılında Edgar ve arkadaşları bir prosedür yayınladıTek bir C izolasyonu ve kültürü ile hücre bölünmesini ve morfogenetiğine araştırmak. elegans ¹⁵ embriyolar. Tedavisi ve enzimatik ayrışma manuel bir kombinasyonu ile yumurta kabuğu sindirilmesi ile elde edilen embriyonik hücreler, ~ 500 hücre ¹⁵ kadar üreten, çoğalmaya devam etti. Daha sonra, Leung ve arkadaşları bağırsak morfogenetiğine çalışma blastomerlerin küçük bir sayıda kültüre. Bunlar, bir in vitro izole edilmiş E blastomere apikal adherens birleşme ¹⁶ üzerinden birbirleri ile etkileşerek intestinal lümene benzer bir yapı oluşturulur polarize bağırsak hücreleri tarafından üretilebilir olduğunu gösterdi. Buechner ve arkadaşları, kültürleme C için benzer bir yöntem rapor etmiştir. ^17, in vitro olarak embriyonik hücreleri elegans.

Bu erken çalışmalara dayanarak, Christensen ve arkadaşları embriyonik C kültürleme için sağlam bir protokol geliştirmiştir. elegans vitro ¹ hücreler. Onlarbu izole edilmiş C göstermiştir. elegans hücreler, çeşitli hücre tipleri farklılaşmak ve hücreye özel markörlerin ekspresyonu dahil olmak üzere, in vivo olarak sahip olduğu özellikleri muhafaza edebilir. In vivo olarak zor olan çeşitli teknikler, izole edilmiş C uygulanabilir embriyonik hücreleri elegans. Bu elektrofizyolojik ^{1,18 19,} görüntü işleme ve immünokimyasal teknikleri ^20,21, hem de hücreye özgü cDNA kütüphanelerinin ^22,23 inşası için (FACS) floresan aktive hücre spesifik hücre tipleri izolasyonunu içerir. Bu tür RNA girişim (RNAi) olarak Gene demonte teknikleri kültürlenmiş C uygulanabilir elegans hücreler ¹ ve glikoprotein keşfi için bir araç olarak Azido-şeker kullanarak yeni bir metabolik etiketleme yöntemi, son zamanlarda in vitro kültürlenmiştir C için geliştirilmiştir elegans hücreleri, ^24.

Sonuç olarak, hücre kültürü yöntemi dizi o genişletirC. uygulanabilir f teknikleri Bir canlı organizmanın bağlamında gen fonksiyonunu çözmek için bir çaba elegans modeli. Biz C kültürleme için buraya protokolü açıklamak büyük ölçüde birinci Christiansen ve arkadaşları ¹ tarafından tarif edilen protokole göre in vitro olduğu, embriyonik hücreler elegans.

Protokol

Christensen ve diğerleri ile karşılaştırıldığında, Yıldız (*), yeni ya da değiştirilmiş adımlarını gösterir. ¹

1.. Malzeme Kur

1. Hücre kültürü prosedür gebe yetişkin izole edilmiş yumurtaların büyük miktarda gerektirir. C'yi büyüyecek yumurtaların büyük miktarda izole etmek için bakteriler - elegans 8P agar plakaları üzerinde NA22 (CGC C. elegans Genetik Consortium kullanılabilir) ile ekildi. Bu plakalar kullanılmıştır pepton miktarı normal olarak NGM plakalar için kullanılan 8 kez miktardır. Daha yüksek pepton konsantrasyonu OP50-, kalın tabakalar halinde büyümeye ki aksine, daha verimli NA22 bakterilerin gelişimini devam ettirir.

8P plakaları tarifi:

3 g NaCl, 20 g Bacto-pepton, 30 dakika süre ile, steril damıtılmış su ve otoklav içinde 1 L 25 g agar çözülür. 55 ° C'de orta serin ve daha sonra 1 ml 1 _MgCl2 kolesterol steril olarak filtreden geçirilmiş, 1 ml EtOH (5 mg / ml), ekleme, MgSO ₄ ile 1 ml KP tamponu (500 ml stok: 5 g ₂ K HPO _4, 30 g KH ₂ PO _4, pH 6.00) 25 ml. 10 cm Petri kutularına (25 ml / plaka) sıvı agar ortam dökün.

2. Ertesi gün NA22 E: 1 ml her bir zenginleştirilmiş pepton agar levhasının tüm yüzeyi yayılmış 2XYT ortamı (16 g tripton, 10 g maya ekstresi, steril su, pH 7.0, 1 L NaCl 5 g) 37 ° C sıcaklıkta gece boyunca kültürlendi coli Bu bakteriler gravid yetişkinlerin büyük miktarlarda büyümeyi destekleyen kalın bir tabaka oluşturacak bol bir besin kaynağı oluşturmaktadır. Bakterilerin büyümesine izin vermek üzere gece boyunca oda sıcaklığında tohumlanmış plakaları bırakın. Bu süreç, 4-5 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edilerek hızlandırılabilir.
3. Numaralı seribaşı 8P plakalarına hasret hayvanları aktarın. 5-6 M9 tampon veya ml su kullanılarak bir hasret NGM plaka hayvanları yıkayın ve her 8P plaka bu süspansiyonun 1-2 ml ekleyin.
4. Hayvanların büyüme ve çarpma unt izinil plakaları gebe yetişkinler tarafından izdiham doldurulur.
5. C. hazırlanması için gerekli olan yumurta izole lizis çözeltisi 5-6 ml kullanarak gebe yetişkinlerden embriyonik hücreler, elegans.

Lysis çözelti tarifi

Taze Bleach 5 mi, 10 N NaOH ve 1.25 ml steril _H2O 18.5 mi Bu karışım, her kullanımdan önce taze olarak hazırlanmalıdır.

6. Yumurta tampon kullanarak gebe yetişkinlerden izole yumurta yıkayın:

Yumurta tampon tarifi

118 mM NaCl, 48 mM KCI, 2 mM _CaCl2, 2 mM _MgCl2, 25 mM Hepes, pH 7.3, 340 mOsm ozmolarite.

7. Çitinaz ile muamele edilerek yumurta çevreleyen yumurtaların çıkarın. Kitinaz asidik pH ²⁵ ile en yüksek aktiviteye sahip bir enzimdir. 2 mg / ml 'lik bir nihai konsantrasyonda yumurta tamponu pH 6.5 içinde kitin (Sigma, katalog no. C6137) içinde çözülür. Şitinaz stok saklamaksteril 15 ml konik tüplerde 1 ml alikotlar içinde -20 ° C'de çözelti. Bu süspansiyonun tam bölenleri bir kaç ay için -20 ° C de muhafaza edilebilir.
8. C'yi büyüyecek fıstık lektinle kaplı otoklavlanmıştır lamelleri (12 mm çap) üzerinde elegans kültür hücreleri. Steril su (0.5 mg / ml) içinde fıstık lektin çözülür. Fıstık lektin çözelti filtre otoklave olmamalıdır. Ayrıca, UV ışığı ile muamele edilmesi gerekmez. 6 aya kadar -20 ° C'de saklayın 2 ml lik bir kısmı.
9. Tam hücre kültür ortamı (500 mi) Gibco, 50 ml cenin sığır serumu (ısı ile deaktive edilmiş), 7.7 g sükroz (45 mOsm), 100 U / ml penisilin ve 100 ug, 5 ml / 500 ml L-15 kültür ortam içeren ml Streptomisin (% 2). Tam ortam daha sonra bir 0.20 mikron gözenek filtresi kullanılarak filtre edilir.

Yumurta tampon ve kültür ortamı, sırasıyla 340 ve 345 mOsm osmolaritesini sahip olduğunu unutmayın. Gerçekten de, memeli hücrelerinin aksine, C. elegans hücrelerin nispeten yüksek ozmotik basıncı vardırbu hücrelerin plazma membran ile doğrudan temas edecek çözümler hazırlanırken saymak içine alınması gerekir. Bu reaktiflerin tarifleri bir osmometre ¹ kullanılarak ölçülmüştür istenen ozmolarite ulaşmak için ayarlanmıştır. Bu tarifleri tam olarak takip edilmektedir ve bakım Bu reaktif maddelerin hazırlanmasında kullanıldığında bir osmometre kullanmak gerekli değildir. Diğer çözümler, yemek tarifleri burada rapor edilmez veya C'yi kullanmak yayınların herhangi hazırlanmış olması, gerekiyorsa Ancak, tek bir osmoter kullanmalısınız kültür hücreleri elegans.

2. Yumurta İzolasyon

1. Bu (24 oyuklu plakalar içerisinde) kültürlenmiş hücrelerin 12 kuyu için yeterli yumurta toplamak için en az dört 8P plakaları ile başlamak için tavsiye edilir.
2. Prosedüre başlamadan önce fıstık lektin stok solüsyonu bir tüpü eritin. Bir 24-çukurlu plaka içindeki kuyuların altındaki otoklav lamelleri yerleştirin ve lamelleri fıstık lektin 200 ul ekle. 1 saat ya da u inkübentil hücreler kaplama hazırdır. Tamamen fıstık lektin çıkarın ve steril otoklavlanmış 1 ml su ile bir kez kuyu yıkayın. Lamelleri fıstık lektininin tam çıkarılması hücre topaklanma kaçınmak için gereklidir.
3. Steril otoklava su kullanarak agar plakaları kapalı gebe yetişkin yıkayın. İki steril konik 50 ml tüp içine süspansiyon toplayın. Tüplerin (*) altındaki solucanlar çökelmesine izin verecek şekilde 5 dakika boyunca buz üzerinde tüpler bırakın. Bir transfer plastik bir pipet ile su çıkarmak ve taze steril otoklavlanmıştır su ile değiştirin. 200 xg 10 dakika boyunca (~ 1.200 rpm) (*) masa üstü santrifüj ile solucanlar Pelet. En az 3, bu son adımı tekrarlayın.
4. Bir steril 15 ml konik bir tüp içine transfer solucanlar ve 200 x g'de 10 dakika boyunca (~ 1,200 rpm) (*) onları pelet. Hem tüpün altındaki bakteri toplama önlemek için daha yüksek bir hız santrifüj kullanmayın. Bazen santrifüj işlemi sonrasında tamamen solucanlar topak değildir. After Her bir yıkama ve temizleme önce yüzer madde, buz üzerinde 5 dakika boyunca tüpleri. Soğutulmuş su solucanlar tüpün dibine çökme olmamıştır.
5. Su çıkarmak ve parçalama çözüm 5-6 ml ekleyin (Malzeme kurmak bakınız). 5-10 dakika boyunca yavaşça süspansiyon kaya ve daha sonra her 2-3 dk stereomicroscope altında solucan lisizine izleme başlar. Süspansiyonun bir damla daha kolay kontrolü için bir lamel üzerine yerleştirilebilir. Kuluçka süresi ağartıcının tazelik bağlı olarak değişir; ağartıcının küçük şişe satın almak ve her ay yeni bir şişe açın.
6. ~% 70-80 oranında solucan (İnkübasyonun başından itibaren 10 dakika) lize ne olursa olsun (Malzeme ayarlamak için bkz) yumurta tamponu, pH 7.3 içinde 9 ml eklenerek parçalama reaksiyonu durdurun. 10 dakika boyunca 200 x g'de (1200 rpm ~) de süspansiyonu santrifüj. Yumurta (*) yeniden kirlenmesini önlemek için bankta bir Bunsen beki var Bu noktadan itibaren.
7. Dikkatlice steril plastik transfer pipet kullanarak süpernatant kaldırmak ve pelet 3-4 yıkayınçözüm açıktır x yumurta tamponu ile kadar. Her bir yıkama sırasında yumurta tamponunda pelet iyice karıştırın emin olun.
8. Yumurta% 30 sukroz çözeltisi kullanılarak Hayvan karkaslarının ayrılır. Steril yumurta tampon, 2 ml pelet yeniden süspanse edin ve 2 ml% 60 sukroz çözeltisi (steril yumurta tamponunda stoku) ekleyin. İyice karıştırın ve 200 x g (~ 1200 rpm) (*) 20 dakika boyunca santrifüj.
9. Dikkatlice santrifüj tüpleri çıkarın. Yumurtalar çözeltisinin üstünde yüzen. P1000 pipet ve steril ipuçlarını kullanarak, yeni bir steril 15 ml konik tüp içine tüm yumurta transferi.
10. 10 dakika boyunca 200 x g (~ 1200 rpm) ve santrifüj tüpüne steril yumurta tampon 10 ml ilave edilir. Yıkandıkları 3 x tekrarlayın. Yumurtalar Tamamen her yıkama sırasında yumurta tampon içinde tekrar süspanse edilir emin olun.

3. Embriyonik hücreler Ayrılma

Laminer akış kapağı steril şartlar altında Prosedürün sonraki adımlar Davranış. Hayvanlar datüm bakteri değilse en ortadan kaldırmak gerekir bakteri plakalarının, yıkama ve ağartma maddesi içeren lizis çözeltisi ile muamele elbise. Bu durumda, prosedür, bu noktada, bir laminar bir başlık kullanılarak yumurta süspansiyonu yeni bir kirlenmesini önler.

1. 2 mg / ml kitinaz (yumurta tamponu pH 6.5 (*) stok), 1 ml topak haline yumurta yeniden süspanse edin ve yeni bir steril 15 ml konik tüp aktarın. Oda sıcaklığında 10-30 dakika boyunca tüp sallayın. Kesin inkübasyon süresi, enzimin ve oda sıcaklığının tazelik göre değişen ve bu nedenle her hazırlanması için belirlenmelidir. Bu inkübasyon 10 dakika sonra, ters çevrilmiş bir hücre kültürü mikroskop altında yumurta izlemeye başlamak için tavsiye edilir. Not: bizim deneyim, düşük pH şitinaz enzimatik aktivitesini arttırır. Bu nedenle, biz kitinaz (pH NaOH ile 6.5 'e ayarlanır yukarıda belirtilen tarifi) eritmek için pH 6.5' de yumurta tampon kullanın.
2. ~ Yumurtalarında% 80'i tarafından sindirilir zamankitinaz tedavisi (Şekil 1 AB), 900 x g'de 3 dakika boyunca (~ 2,500 rpm) (*) santrifüjleme ile yumurta pelet. P1000 pipet ve steril ipuçlarını kullanarak, dikkatlice süpernatant kaldırmak ve L-15 orta 3 ml (*) ekleyin.
3. 6 cm çaplı plaka içine yumurta aktarın ve yavaşça bir 18 G iğne ile donatılmış bir 10 ml'lik steril bir şırınga kullanılarak hücreleri ayırmak. Yeni bir plastik Petri kabı içine bir süspansiyon damla yerleştirerek ve mikroskop altında görüntüleyerek ayrışma derecesini izlemek. Zarar hücreleri önlemek için bu işlem sırasında enjektör içine hava aspire etmeyin. Hücrelerin% 80 ayrışmış olan ~ kadar ayrışma devam edin.
4. Steril 5 um Millipore filtresi kullanılarak süspansiyon filtre. Hücre süspansiyonları, hücre kümeleri, sindirilmemiş yumurta ve larvalarına yumurtadan çıkarmak için filtre edilmelidir. Tüm hücreleri kurtarmak için filtre boyunca taze L-15 ortamı ilave 4-5 ml filtre. Dekar önlemek için filtrasyon aşaması sırasında aşırı güç kullanmayınfiltresi ve / veya hücreleri maging.

4. Hücre Kültürleme

1. 3 dakika boyunca (*) için 900 x g (~ 2,500 rpm) santrifüjleme ile ayrışmış hücreleri Pelet. P1000 pipet ve steril ipuçlarını kullanarak dikkatlice süpernatant kaldırmak. Tüm L-15, orta ve plakanın 1 ml / oyuk olarak pelet hücreleri yeniden süspanse edin. Ilave ortamın miktarı, kullanılan 8P plakaların sayısı, plakalar üzerinde solucanların birleştiği ve hücreler üzerinde yapılacak deneyler türüne bağlıdır. Hücre yoğunluğu bir hemositometre kullanılarak belirlenebilir. ~ 230.000 hücre / cm ² optimal yoğunluk kaplama yama-kelepçe kayıtları için.
2. Kültür ortamının buharlaşmasını önlemek için ıslak kağıt havlu içeren plastik bir kap içinde Tupperware 24 kuyu plakası tutun. 20 ° C ve çevre havası ile nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde kabı saklayın.
3. Hücreler genellikle 24 saat içinde deneyler için hazır olduğunda morfolojik ayrım ve ekspresGFP belirteçlerin iyon tamamlandı. Hücreler kadar 2 hafta boyunca kültür içinde tutulur, fakat bunlar genellikle kaplama sonrası 7-9 gün kadar en sağlıklı. Ortam, sağlıklı hücreleri korumak için günde bir değiştirilmesi gerekir.

Sonuçlar

C. kültür hücreleri spesifik belirteçler farklılaştırmak ve ekspres hücre elegans

Christensen ve tripan mavi lekelemesi kullanılarak arkadaşları göstermiştir ki, embriyonik C>% 99 elegans hücreler izolasyon prosedürü hayatta. 9 gün sonra kaplama ve 22, sırasıyla% 85 ve% 65, hala ^1. hayatta. İzole embriyonik C. elegans hücreleri ayırt etmek için bir alt-tabaka için uygun olmalıdır. Form kümeleri uymadığı ve ...

Tartışmalar

C. elegans gelişim, davranış ve yaşlanma ile ilgili genetik yollar deşifre için güçlü bir model organizmadır. Onun rahatlığı öncelikle genetik manipüle edilebilme kolaylığından ve kısa yaşam döngüsü kaynaklanıyor. Onun kolaylık rağmen, C. elegans sınırlamaları vardır. C elegans hücreler son derece küçük ve bu mikro-dizi analizi ile gen ekspresyon profili olarak, doğrudan bu tür elektrofizyolojik ve farmakolojik teknikleri gibi hücrelere erişim, veya özel ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Bacto Peptone	VWR International Inc.	90000-382
Difco Agar Granulated	VWR International Inc.	90000-784
Bacto Tryptone	VWR International Inc.	90000-284
Bacto Yeast Extract	VWR International Inc.	90000-724
Leibovitz's L-15 Medium (1x) Liquid	Invitrogen	11415-064
Fetal Bovine Serum	Invitrogen	16140-063
Penicillin-streptomycin	Sigma	P4333-100ML
Chitinase from Streptomyces Griseus	Sigma	C6137-25UN
NA22 Escherichia coli	Caenorhabditis Genetics Center
Peanut Lectin	Sigma	L0881-10MG
Sucrose	Sigma	57903-1KG
D-(+)Glucose	Sigma	67528-1KG
Ethylene glycol-bis (2-amin–thylether), N,N,N',N'- tetraacidic acid (EGTA)	Sigma	E0396-25G
Hepes	Sigma	H3375-500G
Cholesterol
NaCl	Sigma	57653-1KG
KCl	Sigma	P9333-500G
CaCl2	Sigma	C1016-500G
MgCl2	Sigma	M8266-100G
MgSO4	Sigma	M2643-500 g
K2HPO4	Sigma	P2222-500G
KH2PO4	Sigma	P9791-500G
NaOH	Sigma	S8045-500G
KOH	Sigma	P1767-500G
Ethanol
Autoclaved distilled H2O
Bleach
EQUIPMENT
101-1000 μl Blue Graduated Pipet Tips	USA Scentific	1111-2821
10 ml Sterilized Pipet Individually Wrapped	USA Scentific	1071-0810
Ergonomic Variable Volume (100-1000 μl) Pipettor with tip ejector	VWR International Inc.	89079-974
Portable Pipet Aid, Drummond	VWR International Inc.	53498-103
Transfer Plastic Pipet Sterile	VWR International Inc.	14670-114
15 ml Conical Tube	USA Scentific	1475-1611
50 ml Conical Tube	USA Scentific	1500-1811
Sterile 18 gauge Needles	Becton, Dickinson and Co.	305196
Sterile 10 ml Syringes	Becton, Dickinson and Co.	305482
Plastic Syringe Filters Corning 0,20 μm pore size	Corning	431224
Acrodic 25 mm Syringe filter w/5 μm versapor Membrane	VWR International Inc.	28144-095
60x15 mm Petri Dish Sterile	VWR International Inc.	82050-548
100x15 mm Petri Dish Sterile	VWR International Inc.	82050-912
12 mm Diameter Glass Coverslips	VWR International Inc.	48300-560
Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid	Thomas scientific	6902A09
Dumont #5- Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Centrifuge 5702	Eppendorf	022629883
Laminar Flow Hood
Inverted Microscope with x10 objective
Ambient air humidified Incubator