在3D揭示侵入性癌症细胞骨架组织

摘要

本文提出了一种荧光标记的胶原蛋白，可以进一步用于修复和实时成像的三维细胞培养的方法。我们还提供了一个可视化优化的协议在3D的环境中培养的细胞内源性细胞骨架蛋白。

摘要

在传统上一直在2D基板研究细胞迁移。然而，它已成为越来越明显的是，需要研究更合适的3D环境，更好地类似于维度的生理过程中细胞迁移。游走细胞实质上的不同，其形态和模式的迁移取决于他们是否正在2D或3D基板上。由于与大多数标准协议，细胞内嵌入3D矩阵的结构和功能分析的技术困难和不兼容性仍然屡见不鲜。本文介绍了编制和成像3D细胞培养的方法，无论是作为单细胞或球体。肿瘤细胞迁移作为一个适当的细胞外基质底物，我们使用nonpepsinized的大鼠尾I型胶原在室温下聚合，荧光标记，以方便使用标准的共聚焦显微镜的可视化。这项工作还包括一个协议传输醇三维​​免疫荧光标记的内源性细胞骨架。使用这些协议，我们希望能有助于更好地描述的分子组成，定位，细胞结构和功能在3D。

引言

细胞迁移的领域已经进入全新的第三维世界冒着。它是最近似于生理的一个，因此，三维（3D）的环境中，直观地研究细胞迁移。然而，由于技术的限制，大多数细胞迁移的研究已被被分析细胞的运动刚性的两维（2D）基板之间，未经处理或涂以适当的细胞外基质（ECM）蛋白。

第一个致力于研究细胞迁移的三维胶原蛋白晶格回去^1-3超过20年。然而，仅在过去的5年中，它已成为游走细胞实质上的不同，其形态和模式的迁移取决于基材的维。在2D中，细胞只接触基底腹面使用焦距粘连，从而形成了宽阔平坦的突起（lamellipodia上）与嵌入式的指状突起（丝状伪足），他们的领先优势。这些结构中，一起连接的单元的从前至后缘的应力纤维，被认为是在2D细胞运动的关键。在三维基质中，细胞通常是更细长，与整个细胞表面接触的ECM，许多这些结构的形成和功能的相关性造成了相当大的变化。相反，其他细胞的功能，获得相关的三维偏移，如参与ECM重塑⁴核变形和结构。

尽管这些已知的形态学改变，以及迁移模式^5-7，可取决于对ECM和类型的细胞，嵌入在三维基质中的细胞的结构和功能的分析的差异仍然不寻常的。又浓又密的3D矩阵进行技术困难，如高分辨率的显微成像和不兼容性与大多数站优化的ndard协议为2D的文化，如内源性蛋白免疫荧光标记。此外，因为使用的3D矩阵是一个相对较新的方法，研究人员仍在调查酷似具体在体内的情况，如不同的组织器官或ECM肿瘤组织周围的正常基质结构的最佳条件。在结果中关于不同群体的差异，例如，肿瘤细胞迁移模式或粘着斑的存在，产生了一些争议^8。很多努力，最近一直致力于ECM化学性质，孔径，纤维厚度和刚度矩阵方面达成了共识。三维的ECM的许多不同类型的当前使用，不同，从细胞衍生的矩阵市售基质胶，pepsinized牛胶原I或nonpepsinized鼠尾胶原一，这些矩阵中的每一个都具有特定的物理和化学性质，并需要相对德选择矩阵的生理过程正在研究中。此外，孔径和纤维厚度可以依赖于聚合条件下，如pH值和温度^9,10。的绑定和距离，可从硬质基材，例如玻璃，也可以改变基体^10,11的弹性性能。

本文介绍了编制和成像3D细胞培养的方法，无论是作为单细胞或球体。使肿瘤细胞球粒的方法前面已经描述的，最流行 ​​的是悬滴法^12,13和琼脂糖涂层板的方法^14。肿瘤细胞迁移作为一个适当的细胞外基质底物，nonpepsinized大鼠尾I型胶原聚合在室温，用2毫克/毫升。 Nonpepsinized酸提取胶原蛋白我从鼠尾保留N和C-末端的端肽，的​​nonhelical部分负责天然胶原intermolec的胶原蛋白分子ular的交联和fibrilar的的稳定性^15。总之，这些条件允许的情况下形成的胶原网络¹⁰ 在体内观察到的那些最相似的。一个详细的协议，以允许可视化的胶原纤维，无论是在固定和活的文化，提供荧光标记胶原蛋白在体外 ^10，使用5 - （6） -羧基四甲基罗丹明（TAMRA），琥珀酰亚胺基酯。该协议是改编自拜辞等^。16,17，用来标记异硫氰酸荧光素可溶性胶原蛋白分子。 ，TAMRA荧光素反应，质子化脂族氨基基团的蛋白质，如上面的N-末端的自由氨基基团，而更重要的是，侧氨基的赖氨酸的氨基的反应性荧光染料。该反应只发生在碱性pH值下，当赖氨酸的氨基质子化的形式。除了TAMRA更稳定，比荧光时间的推移，其发射光谱落在范围橙/红（EX / EM = 555/518纳米），它可以有效地活细胞成像GFP标记的蛋白质相结合。使用与氨基反应性染料的水溶性胶原蛋白标记的分子不影响聚合反应的过程中，还是的密度，微孔尺寸和胶原基质的交联状态^{10,16,18,19。}

此协议还包括一个三维的内源性蛋白，其已被进一步优化标记细胞骨架或细胞骨架相关蛋白的免疫荧光标记的方法。此协议的最终焦点是获得高分辨率图像，利用共聚焦显微镜的3D文化与刚性盖玻片贡献减少胶原基质张力的方法。

研究方案

1。 TAMRA-I型胶原贴标

1. 制备10毫克/毫升TAMRA的溶液，加入2.5毫升DMSO中提供的25毫克TAMRA粉末。溶解它通过涡旋，直到完全溶解。储存于-20ºC和避光。
2. 准备2 L的标记缓冲液（0.25 M，0.4 M氯化钠的NaHCO _3）。调节pH值至9.5，用10 M的NaOH溶液。保持在4℃从这一点来说，所有的操作都​​在4℃，除非另有说明外，荧光材料从光用铝箔保护。
3. 填充高度集中的大鼠尾I型胶原溶液用1毫升1毫升一次性注射器。高浓度的胶原蛋白的解决方案通常是设置在大约10毫克/毫升的浓度，是非常粘稠的。一定要慢慢地操纵它，以避免形成气泡。
4. 使用一个21 G注射器针头，注射胶原蛋白预浸3毫升透析盒10000截留分子量切断。谨慎使用，以避免大马动，由膜用针。删除所有空气透析盒拉动注射器的活塞。 1 L的标记缓冲液透析过夜。
5. 用900微升标记缓冲液，100微升10毫克/毫升TAMRA溶液混合。注：这应该是做TAMRA解决方案和贴标缓冲器，在室温下，因为DMSO冻结在4℃混合后，带来摊薄TAMRA解决方案4℃
6. 小心地取出胶原蛋白，用2毫升的一次性注射器用21 G皮下注射针头从透析盒。用1ml稀释的TAMRA溶液用移液管将1毫升的透析过的胶原蛋白溶液。
7. 到2毫升离心管中传输胶原/ TAMRA混合的旋转孵育过夜。
8. 成预浸3毫升透析盒TAMRA标记的胶原蛋白的2毫升转移和对1 L的标记缓冲液，以除去过量的游离的染料中透析过夜。
9. 要恢复TAMRA实验室ELED胶原蛋白，胶原蛋白原溶液，透析盒放置到1升0.2％（体积/体积）的乙酸溶液中，pH值为4，并透析过夜。
10. 测量TAMRA标记的胶原蛋白的最终体积，并计算它的最终浓度，考虑到所用的胶原蛋白溶液的初始体积和浓度。贮存在4℃

2。 3D TAMRA-胶原嵌入式单细胞矩阵

1. 计算2 mg / ml的TAMRA-胶原蛋白混合的实验所需的体积。一定要准备20％以上，考虑到移液损耗，由于胶原蛋白的高粘度。
2. 准备股票10X PBS和1 N氢氧化钠溶液。过滤消毒，并保持在4℃从这点来说，所有的操作都​​在冰上进行，除非另有说明，并在无菌条件下。
3. 混合10倍的PBS和1N的NaOH在适当体积，以达到预期的胶原蛋白浓度和pH值7.4。例如，对于1毫升的最终体积TAMRA-胶原蛋白在pH 7.4混合，结合用5μl的1N的NaOH100μl的10倍PBS。拌匀。
4. 添加适当的两个TAMRA标记的胶原蛋白和未标记的胶原蛋白在1:6的比例，以实现最终的总胶原浓度为2毫克/毫升的体积。例如，对于2 mg / ml的TAMRA-胶原蛋白混合，最终体积为1毫升，添加90.48微升3.68毫克/毫升TAMRA标记的胶原蛋白和4.01毫克/毫升的未标记的胶原蛋白415.71微升。拌匀，慢慢移液，避免形成气泡。
5. 添加细胞悬浮在适当体积的不含FBS的冷冻细胞培养基的TAMRA-胶原蛋白混合以获得最终的细胞密度为10 ⁵个细胞/ ml和一个最终的胶原蛋白的浓度为2毫克/毫升。例如，对于1毫升2毫克/毫升TAMRA-胶原蛋白混合，添加388.81微升含有10 ⁵个细胞的培养基。拌匀，慢慢移液，避免形成气泡。确认pH值的pH值试验通过测试10微升混合之旅。
6. 移液管加入100μl滴TAMRA-胶原蛋白混合到玻璃底菜，并允许它在室温下放置30-45分钟，以聚合。将100μl的胶原蛋白滴有一个典型的直径为7mm，是2毫米高。胶原蛋白的聚合，变成白色上下的凝胶。注意：允许胶原蛋白的聚合，但不关闭烹调避免形成水膜周围的胶原蛋白的下降，降低玻璃的脱离。为了提高依从性，玻璃菜可以涂有聚-L-赖氨酸在100微克/毫升。
7. 小心地将足够的培养基，以弥补胶原蛋白/细胞下降。胶原滴避免高通量媒体或突然运动，因为可以很容易地分离。请在37℃在10％CO ₂的加湿空气中足够长的时间（通常为1-3天），在基体中用于细胞迁移。

3。 3D TAMRA-胶原嵌入式细胞球体的矩阵

1. 计算体积的2毫克/毫升TAMRA-胶原蛋白中号㈨实验所必需的。一定要准备20％以上，考虑到移液损耗，由于胶原蛋白的高粘度。
2. 准备股票10X PBS和1 N氢氧化钠溶液。过滤消毒，并保持在4℃从这点来说，所有的操作都​​在冰上进行，除非另有说明，并在无菌条件下。
3. 混合10倍的PBS，1 N NaOH和在适当的卷不含FBS的细胞培养基，以实现所需的胶原蛋白的浓度和pH值7.4。例如，对于在pH 7.4，最终体积为1毫升的TAMRA-胶原蛋白混合，结合100μl的10倍PBS，5微升的1 N NaOH和388.81微升介质。拌匀。
4. 添加适当的两个TAMRA标记的胶原蛋白和未标记的胶原蛋白在1:6的比例，以实现最终的总胶原浓度为2毫克/毫升的体积。例如，对于2 mg / ml的TAMRA-胶原蛋白混合，最终体积为1毫升，加入90.48微升3.68毫克/毫升TAMRA标记的胶原蛋白和415.71微升4.01毫克/毫升UNLA贝莱德胶原蛋白。拌匀，慢慢移液，避免形成气泡。确认测试的pH试纸条上的混合10μl的pH值。
5. 吸取100微升滴TAMRA骨胶原混合到玻璃底菜，并允许2-5分钟，引发聚合。这将有助于防止下沉的球体凝胶粘度略有增加。将100μl的胶原蛋白滴有一个典型的直径为7mm，是2毫米高。
6. 收集的细胞球体，并把它放在一个干净的培养皿。删除任何多余的液体，悬浮在10微升TAMRA-胶原混合。这是重要的，以防止细胞培养基中的胶原蛋白稀释。
7. 使用一个P20吸管，收集胶原蛋白悬浮球体，并把它放在中心顶部的100微升TAMRA-胶原混合降。注意：不要放置多个球体每胶原蛋白的下降，因为它们可以相互影响的入侵和/或迁移能力。
8. 允许TAMRA-胶原混合聚merize在室温下放置30-45分钟。胶原蛋白的聚合，变成白色上下的凝胶。注意：允许胶原蛋白的聚合，但不关闭烹调避免形成水膜周围的胶原蛋白的下降，降低玻璃的脱离。为了提高依从性，玻璃菜可以涂有聚-L-赖氨酸在100微克/毫升。
9. 小心地将足够的培养基，以弥补胶原/球体滴。胶原滴避免高通量媒体或突然运动，因为可以很容易地分离。
10. 细胞入侵/迁移在基体中（通常为1-3天）足够长的时间保持在37℃在10％CO ₂的加湿空气。

4。三维免疫荧光染色

1. 小心取出细胞培养基及胶原基质含有细胞/球体用PBS冲洗。
2. 同时固定和提取与提取/固定缓冲液（4％PFA，0.3％的Triton X-100，5％蔗糖的PB孵育细胞S）5分钟。补充2μM鬼笔环肽和2μM紫杉醇骨架或细胞骨架相关蛋白可视化的缓冲区。
3. 进一步固定细胞，用4％PFA，5％蔗糖磷酸缓冲液30分钟。用0.05％Tween-20的PBS冲洗。
4. 准备在PBS的主要抗体解决方案。在室温下至少1小时或4℃过夜孵育初级抗体细胞请一定要补充足够的解决方案，覆盖整个胶原蛋白降。对于一个35毫米的玻璃底菜，长1.5-2毫升的解决方案将是必要的。注意：为了减少体积的抗体溶液，不溶于水的屏障，如圆线的硅脂或硅橡胶环，可放置周围胶原下拉。
5. 用0.05％Tween-20的PBS洗3次30分钟。
6. 准备Alexa的标记的二抗，Alexa的共轭毒伞和DAPI在PBS的解决方案。孵育细胞与适当的二抗在室温下搅拌2小时。
7. 洗3X 30分钟用0.05％Tween-20的PBS。
8. 删除多余的液体，补充足够的安装媒体，填补了玻璃底菜底（约500微升），顶部放置一个24毫米盖玻片密封。请勿按压盖玻片，避免压缩胶原蛋白的下降和损坏的三维组织。

5。样品成​​像

Classic或纺丝盘共聚焦显微镜都可以使用。一个倒置的系统应优先被用来确定从玻璃底部的成像单元的距离。该系统用于这项工作是一个倒立共轭焦配备一个40X/1.3NA和60X/1.4NA的油浸物镜（工作距离200微米和130微米，分别），光度CoolSNAP HQ2摄像头，1392 x 1040的旋转盘成像阵列，6.45 x 6.45微米像素的MetaMorph成像软件和控制。 405纳米，491纳米，561纳米和633纳米激光器通常用于在30-50％的功率，获得1和2的分级×2，以减少曝光时间。该显微镜还配备了一个汞灯泡和过滤器立方体（EXC 400-418纳米; EM 450-465）DAPI，FITC（EXC 478-495 510-555 EM）和德克萨斯红（EXC 560-580; EM 600 -650），用眼片。

1. 使用的荧光灯中，将40倍物镜上面的中间的胶原下降。获得的样品，在xy轴和z轴​​的概述。确保不偏离超过100μm，从凝胶中的xy轴的边缘时，获取的图像，以避免边缘效应。当成像球状体，确保他们是根据客观的工作距离。更改目标（如适用）。
2. 切换到聚焦实时成像模式。通过使用在561纳米的激光，以可视化的TAMRA标记的胶原蛋白，从玻璃底部开始确定的z值，当胶原纤维开始出现。这是在基板的底部和z = 0处。
3. 使用对焦旋钮，100微米Z = 0。只有在z = 100微米的细胞或以上应进行成像，避免紧张的影响，从硬质玻璃底部。
4. 选择单元格图像。优化相机的曝光时间和激光功率为每个波长。典型的DAPI和Alexa-488鬼笔环肽的曝光时间是100-200毫秒之间。抗体染色的曝光时间可能会发生变化。
5. 在使用适当的激光共聚焦活模式，以可视化的鬼笔环肽染色，并使用聚焦旋钮，定义z系列间隔设置顶部和底部z值电流。
6. 定义的z步长。 40X的目标，用1微米。 60X，使用0.5微米。开始收购。

结果

TAMRA标记鼠尾I型胶原，使一个简单的编制和可视化三维胶原网络。在室温下缓慢聚合的查询结果发现在体内 ¹⁰的具有可比性的组织中形成的胶原蛋白网络。

在这里，我们提出了一个协议CT26癌症细胞骨架的免疫荧光染色，球体和单细胞。为了更好地保护细胞骨架，缓冲器增加了未标记的鬼笔环肽和紫杉醇，已知F-肌动蛋白和微管稳定的药物，分别。此外?...

讨论

这里描述的协议，我使用TAMRA提供了一个很好的方法，让简单的​​可视化的胶原网络组织，通过使用标准的配备了一个561 nm激光共聚焦显微镜，荧光标记胶原蛋白。这种技术的一个优点，相对于反射率的共聚焦显微镜图像的胶原纤维深入到3D矩阵的能力。纤维反射的强度和对比度显着衰退的深度，由于激光的光吸收和散射。此外，胶原纤维的方向可以是一个主要的障碍时使用反射共焦显微镜中，...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
TAMRA, SE	Invitrogen	C-1171
Rat tail Collagen High Concentration	BD Biosciences	354249
Rat tail Collagen	BD Biosciences	354236
Phalloidin	Sigma	P2141
Taxol (Paxitel)	Sigma	T7402
Mouse anti-alpha Tubulin antibody	Sigma	T9026
Alexa 488 Phalloidin	Invitrogen	A12379
Alexa 633 Goat anti-Mouse antibody	Invitrogen	A21052
DAPI	Invitrogen	D1306
Mounting media	Fisher Scientific	106 226 89
Dialysis Cassette	Pierce	66380
Glass bottom dishes	World Precision Instruments	FD35-100
MetaMorph Microscopy Automation & Image Analysis Software	Molecular Devices
Imaris 7.2.3	Bitplane