Выявление организации цитоскелета инвазивных раковых клеток в 3D

Резюме

В данной статье представлен метод флуоресцентной маркировать коллагена, который может быть дополнительно использован как для исправлений и живых изображений 3D клеточных культурах. Мы также предоставляем оптимизированный протокол для визуализации эндогенных белков цитоскелета клеток, культивированных в 3D среде.

Аннотация

Миграция клеток традиционно изучалось в 2D субстратов. Тем не менее, становится все более очевидным, что существует необходимость изучения миграции клеток в более подходящее 3D среде, которая лучше напоминают размерность физиологических процессов, о котором идет речь. Мигрирующих клетках могут существенно отличаться по своей морфологии и режима миграции в зависимости от того они движутся на 2D или 3D субстратов. В связи с техническими трудностями и несовместимость с большинством стандартных протоколов, структурно-функциональный анализ клеток встроенные в 3D-матрицы все еще остается редкостью. В этой статье описаны способы получения и обработки изображений 3D-культурах клеток рака, либо в виде отдельных клеток или сфероидов. В качестве соответствующего субстрата ЭСУД на миграцию клеток рака, мы используем nonpepsinized коллагена хвоста крысы Я полимеризации при комнатной температуре и флуоресцентной маркировку для визуализации с использованием стандартных конфокальной микроскопии. Эта работа также включает в себя protocол для 3D Иммунофлуоресцентной маркировки эндогенных цитоскелета клетки. Использование этих протоколов мы надеемся внести свой вклад в лучшее описание молекулярного состава, локализации и функции клеточных структур в 3D.

Введение

Области миграции клеток была не боясь в новом трехмерном мире. Это интуитивно изучать миграцию клеток в среде, которая больше всего напоминает физиологическому и, следовательно, трехмерные (3D). Однако в связи с техническими ограничениями, большинство мобильных исследований миграции были проведены анализ клеточного движения по жесткой двумерной (2D) подложки, либо необработанные или покрыты соответствующими внеклеточного матрикса (ЕСМ) белки.

Первые исследования, посвященные миграции клеток в трехмерной решетки коллагена вернуться более 20 лет ^1-3. Однако, только за последние 5 лет стало ясно, что мигрирующие клетки могут существенно отличаться по своей морфологии и режима миграции в зависимости от размерности подложки. В 2D, клетки только контакт подложки с вентральной поверхности с помощью координационных спаек, что приводит к образованию широких плоских выступов (ламеллиподий) свстроенные пальцев, как выступы (филоподии) на их передней кромки. Эти структуры, а также стрессовых волокон, которые соединяют клетки передней к задней кромке, как полагают, важны для клеточного движения в 2D. В 3D матрицы, клетки, как правило, более удлиненные, со всей клеточной поверхности контакта ECM, что приводит к значительным изменениям в формировании и функциональное значение многих из этих структур. Наоборот, другие клеточные функции набирать актуальность в 3D миграции, такие как деформация ядра и структур, участвующих в реконструкции ECM ^4.

Несмотря на эти известные морфологические изменения, а также различия в миграционных режимов ^5-7, которые могут варьироваться в зависимости от ECM и типы клеток, структурного и функционального анализа клеток матрицы встроенных в 3D все еще ​​остается необычным. Работа с толстыми и плотными матрицами 3D осуществляет технические трудности, такие как микроскопия высокого разрешения изображений, и несовместимость с большинством станцийndard протоколы оптимизированы для 2D культур, как и маркировка Иммунофлуоресцентной эндогенных белков. Кроме того, поскольку использование 3D-матриц является относительно новым подходом, исследователи до сих пор изучают наилучшие условия для напоминают в естественных условиях конкретных ситуаций, таких как нормальное стромальных архитектуры различных органов тканей или организации ECM вокруг опухоли. Расхождения в результатах различных групп, касающиеся, например, раковые клетки режимы миграции или существование фокальные адгезии, вызвали некоторые противоречия ^8. Много усилий было недавно посвященный достичь консенсуса с точки зрения ECM химической природы, размер пор, толщина волокна и матрицы жесткости. Много различных типов 3D ЕСМ в настоящее время используются, колеблется от клетки, полученной матрицы с коммерчески доступными Матригель, pepsinized бычьего коллагена I, или nonpepsinized крысиного хвоста коллагена I. Каждый из этих матриц имеет определенные физические и химические свойства, и нужно отношениюTE матрицу выбора физиологический процесс изучается. Кроме того, толщина размер пор и волокна может зависеть от условий полимеризации, например, рН и температуры ^9,10. Связывание и расстояние от жесткой подложки, такие как стекло, можно также изменить упругие свойства матрицы ^10,11.

В этой статье описаны способы получения и обработки изображений 3D-культурах клеток рака, либо в виде отдельных клеток или сфероидов. Способы получения сфероидами раковые клетки были описаны ранее, самыми популярными из которых являются метод висячей капли ^12,13 и агарозном покрытием пластины методом ^14. В качестве соответствующего субстрата ECM рака миграции клеток, nonpepsinized коллагена хвоста крыс I полимеризации при комнатной температуре используется в концентрации 2 мг / мл. Nonpepsinized кислота экстрагированный коллаген I из хвоста крысы удерживает оба N-и С-концевых телопептидов, nonhelical части молекулы коллагена, ответственного за нативный коллаген межмолекулярУлар сшивания и Мышечный стабильности ^15. Вместе, эти условия позволяют образовании коллагена сетей, которые наиболее близко напоминают те, наблюдаемых в естественных условиях ^10. Чтобы обеспечить визуализацию коллагеновых волокон, как в фиксированных и живых культур, подробный протокол предоставляется флуоресцентно этикетке коллагена в пробирке ^10, с использованием 5 - (а-6)-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA), сукцинимидил эфир. Этот протокол был адаптирован из Baici соавт. ^16,17, где флуоресцеинизотиоцианат используется для обозначения растворимых молекул коллагена. Как флуоресцеин, TAMRA представляет собой амино-реактивный флуоресцентный краситель, который реагирует с nonprotonated алифатических аминогрупп белков, таких как свободной аминогруппы на N-конце и, что более важно, боковые аминогруппы лизина. Эта реакция происходит только при щелочном рН, когда аминогруппа лизина в nonprotonated форме. В дополнение к TAMRA быть более стабильными, чем флуоресцеином черезвремя, его спектры излучения падает на оранжевый / красный диапазон (ЕХ / EM = 555/518 нм), что может быть удобно объединены для живого изображения ячейки GFP-меченных белков. Использование растворимого коллагена меченых молекул с амино-активные красители не влияет на процесс полимеризации, ни плотность, размер пор и сшивающего состояния коллагеновой матрицы ^10,16,18,19.

Этот протокол также включает в себя способ для 3D иммунофлуоресцентного маркировки эндогенных белков, который был оптимизирован для обозначения цитоскелета или цитоскелета связанных белков. Окончательный внимание в этом протоколе делается на методах получить изображения с высоким разрешением 3D-культур с помощью конфокальной микроскопии с уменьшением вклада от жестких покровные стекла на напряжение матрицы коллагена.

протокол

1. TAMRA-коллагена I Маркировка

1. Подготовьте 10 мг / мл TAMRA раствора добавлением 2,5 мл ДМСО к прилагаемому 25 мг порошка TAMRA. Растворить его, не вортексе до полного растворения. Хранить при -20 º C и защиты от света.
2. Подготовьте 2 л Маркировка буфера (0,25 М NaHCO _3, 0,4 М NaCl). Регулировка рН до 9,5 с использованием 10 М раствора NaOH. Хранить при температуре 4 º C. С этого момента все операции проводили при 4 º С, если не указано иное и флуоресцентный материал не защищен от света с помощью алюминиевой фольги.
3. Заполните 1 мл одноразовые шприцы с 1 мл высококонцентрированного коллагена хвоста крысы I раствора. Решения высокой концентрации коллагена обычно предоставляются в концентрации приблизительно 10 мг / мл и очень вязкой. Будьте уверены, чтобы работать с ним медленно, чтобы избежать образования пузырьков воздуха.
4. Используя шприц для подкожных инъекций 21 G, вводят коллаген в замоченный 3 мл диализа кассету 10000 MWCO отрезаны. Соблюдайте осторожность во избежание DamaГинг мембрану с иглой. Удалите весь воздух из диализа кассеты, потянув поршень шприца. Диализировать его на ночь против 1 л Маркировка буфера.
5. Смешать 100 мкл 10 мг / мл TAMRA раствора с 900 мкл буфера маркировки. Примечание: Это должно быть сделано как с TAMRA решения и маркировки буфера при комнатной температуре, так как ДМСО замерзает при температуре 4 º C. После смешивания, приносят разбавленный раствор TAMRA назад до 4 º C.
6. Осторожно снимите коллагена из диализной кассеты использованием 2 мл одноразовый шприц с иглой 21 G подкожных. Смешайте 1 мл Диализованный раствор коллагена с 1 мл разбавленного раствора TAMRA с помощью пипетки.
7. Передача коллаген / TAMRA смесь в 2 мл микроцентрифужных трубки и инкубировать в течение ночи с вращением.
8. Передача 2 мл TAMRA меченного коллагена в предварительно замоченного 3 мл кассета диализа и диализ в течение ночи против 1 л маркировка буфера, чтобы удалить избыток свободного красителя.
9. Для восстановления TAMRA-LabELED коллаген коллаген оригинальное решение, поместите диализа кассеты в 1 л 0,2% (объем / объем) раствор уксусной кислоты, рН 4 и диализ в течение ночи.
10. Измерить конечного объема TAMRA меченного коллагена и вычислить ее конечной концентрации, с учетом первоначального объема и концентрации раствора коллагена использованы. Хранить при температуре 4 º C.

2. 3D TAMRA-коллагеновые матрицы с внедренными отдельных клеток

1. Вычисление объема 2 мг / мл коллагена TAMRA-Mix необходимое для эксперимента. Всегда готовьте на 20% больше для учета пипетки убытки в связи с высокой вязкостью коллагена.
2. Готовят раствор 10х PBS и 1 N NaOH. Фильтр-стерилизовать и выдерживают при 4 º C. С этой точки зрения, все операции осуществляются на льду если не указано иное и в стерильных условиях.
3. Смешать 10x PBS и 1 N NaOH в соответствующие объемы для достижения желаемой концентрации коллагена и рН 7,4. Например, для конечного объема 1 млиз TAMRA-Mix коллагена при рН 7,4, объединять 100 мкл 10х PBS с 5 мкл 1 N NaOH. Хорошо перемешать.
4. Добавьте соответствующие объемы обоих TAMRA меченного коллагена и немеченого коллагена в соотношении 1:06 до конечной общей концентрации коллагена 2 мг / мл. Например, при конечном объеме 1 мл 2 мг / мл TAMRA-коллагеновая Mix, добавить 90,48 мкл 3,68 мг / мл TAMRA меченного коллагена и 415,71 мкл 4,01 мг / мл немеченого коллагена. Хорошо перемешайте и медленно с помощью пипетки, избегая образования пузырьков воздуха.
5. Добавить клеток, суспендированных в соответствующем объеме охлажденной клеточной среды без FBS в TAMRA-коллагеновая Mix для получения конечной плотности клеток 10 ⁵ клеток / мл и конечной концентрации коллагена 2 мг / мл. Например, для 1 мл 2 мг / мл TAMRA-коллагеновая Mix, добавьте 388,81 мкл среды, содержащей 10 ^{5 клеток.} Хорошо перемешайте и медленно с помощью пипетки, избегая образования пузырьков воздуха. Подтверждение рН путем тестирования 10 мкл смеси на рН тест секпоездки.
6. Внесите 100 мкл капли TAMRA Коллаген-Mix на чашки со стеклянным дном и дайте ему для полимеризации при комнатной температуре в течение 30-45 мин. 100 мкл капель коллагена имеют типичный диаметр 7 мм и 2 мм. После полимеризации коллагена превращается в беловатые геля. Обратите внимание: Разрешение коллаген для полимеризации без закрытия блюдо будет избежать образования пленки воды вокруг коллагена падения, снижение отрыва от стекла. Чтобы увеличить прилипание, стеклянная посуда может быть, покрытые поли-L-лизин в концентрации 100 мкг / мл.
7. Аккуратно добавьте достаточной питательной среды для покрытия коллагена / Сотовые капель. Избегайте высоких потоков средств массовой информации или резких движений, так как коллаген капли могут легко отделить. Хранить при температуре 37 ° С в 10% CO ₂ увлажненном воздухе имелось достаточно времени для клеток мигрировать в матрице (обычно 1-3 дней).

3. 3D TAMRA-коллагеновые матрицы с внедренными Сфероиды сотовых

1. Вычисление объема 2 мг / мл коллагена TAMRA-МIX необходимое для эксперимента. Всегда готовьте на 20% больше для учета пипетки убытки в связи с высокой вязкостью коллагена.
2. Готовят раствор 10х PBS и 1 N NaOH. Фильтр-стерилизовать и выдерживают при 4 º C. С этой точки зрения, все операции осуществляются на льду если не указано иное и в стерильных условиях.
3. Смешать 10x PBS, 1 N NaOH и клеточные среды без FBS в соответствующие объемы для достижения желаемой концентрации коллагена и рН 7,4. Например, при конечном объеме 1 мл TAMRA-коллагеновая Mix при рН 7,4, объединять 100 мкл 10х PBS, 5 мкл 1 N NaOH и 388,81 мкл среды. Хорошо перемешать.
4. Добавьте соответствующие объемы обоих TAMRA меченного коллагена и немеченого коллагена в соотношении 1:06 до конечной общей концентрации коллагена 2 мг / мл. Например, при конечном объеме 1 мл 2 мг / мл TAMRA-коллагеновая Mix, добавить 90,48 мкл 3,68 мг / мл TAMRA меченного коллагена и 415,71 мкл 4,01 мг / мл UNLAБелед коллагена. Хорошо перемешайте и медленно с помощью пипетки, избегая образования пузырьков воздуха. Подтверждение рН путем тестирования 10 мкл смеси на тест-полоску рН.
5. Внесите 100 мкл капли TAMRA Коллаген-Mix на чашки со стеклянным дном и дать ему возможность инициирования полимеризации в течение 2-5 мин. Это поможет предотвратить гибель сфероидами, слегка увеличив вязкость геля. 100 мкл капель коллагена имеют типичный диаметр 7 мм и 2 мм.
6. Собирайте клетку сфероида и поместить его на чистую чашку Петри. Удалите излишки жидкости и ресуспендируйте его в 10 мкл TAMRA Коллаген-Mix. Это важно для предотвращения разбавления коллагена с клеточные среды.
7. С помощью пипетки P20, собирать коллагена приостановлено сфероида и поместить его в центр верхней части 100 мкл TAMRA Коллаген-Mix капли. Примечание: Не устанавливайте более одного сфероида на коллаген капли, так как они могут влиять друг на друга мощностью, чтобы вторгнуться и / или миграции.
8. Разрешить TAMRA Коллаген-Mix с полиmerize при комнатной температуре в течение 30-45 мин. После полимеризации коллагена превращается в беловатые геля. Обратите внимание: Разрешение коллаген для полимеризации без закрытия блюдо будет избежать образования пленки воды вокруг коллагена падения, снижение отрыва от стекла. Чтобы увеличить прилипание, стеклянная посуда может быть, покрытые поли-L-лизин в концентрации 100 мкг / мл.
9. Аккуратно добавьте достаточной питательной среды для покрытия коллаген / сфероидами капель. Избегайте высоких потоков средств массовой информации или резких движений, так как коллаген капли могут легко отделить.
10. Хранить при температуре 37 ° С в 10% CO ₂ увлажненном воздухе достаточно времени для клеток вторгнуться / мигрировать в матрице (обычно 1-3 дней).

4. 3D Иммунофлуоресцентное окрашивание

1. Осторожно снимите клеточную среду и промойте коллагеновые матрицы, содержащей клетки / сфероидами с PBS.
2. Одновременно устанавливать и извлекать клетки путем инкубации с экстракцией / фиксации буфера (4% PFA, 0,3% Тритон Х-100, 5% сахарозы в PBS) в течение 5 мин. Дополнение буфер с 2 мкМ фаллоидином до 2 мкм Таксол для визуализации цитоскелета или ассоциированных белков цитоскелета.
3. Далее зафиксировать клетки с 4% PFA, 5% сахарозы в PBS в течение 30 мин. Полоскание с 0,05% Твин-20 в PBS.
4. Подготовка первичных решений антител в PBS. Клетки инкубируют с первичными антителами в течение 1 часа при комнатной температуре или в течение ночи при 4 ° С. Убедитесь, добавить достаточно решения охватывают весь падение коллагена. Для 35 мм блюдо со стеклянным дном, 1,5-2 мл раствора будет необходимо. Примечание: Чтобы уменьшить объем раствора антител, нерастворимый в воде барьер, такой как круг линии силиконовой смазкой или кольцо PDMS, могут быть размещены вокруг коллагена капли.
5. Мытье 3x 30 мин с 0,05% Твин-20 в PBS.
6. Подготовка Alexa-вторичных антител, конъюгированных, Alexa-конъюгированного фаллоидина и DAPI решения в PBS. Клетки инкубируют с соответствующими вторичными антителами в течение 2 ч при комнатной температуре.
7. Промыть 3 раза 30 мин с 0,05% Твин-20 в PBS.
8. Удалите излишки жидкости, добавить достаточно монтажа средств массовой информации, чтобы заполнить стеклянной посуде снизу снизу (около 500 мкл) и поместите 24 мм покровное на вершине, чтобы запечатать. Не нажимайте на покровное, чтобы избежать сжатия коллагена падение и повреждение 3D организации.

5. Пример изображения

Классический или вращающийся диск конфокальный микроскоп может быть использован. Перевернутой система должна предпочтительно быть использован для определения расстояния до отображаемого клеток из стеклянным дном. Система, используемая для этой работы представляет собой перевернутую вращающийся диск конфокальной оснащен 40X/1.3NA и 60X/1.4NA нефтью погружения цели (рабочее расстояние 200 мкм и 130 мкм соответственно), Фотометрия CoolSnap HQ2 камера, 1392 х 1040 матрица формирования изображения, 6,45 х 6,45 мкм пикселей и управляется программным обеспечением Metamorph изображений. 405 нм, 491 нм, 561 нм и 633 нм лазеров, как правило, используется на 30-50% мощности, и получить 1 из 2 биннингех 2 с целью снижения времени экспозиции. Микроскоп оснащен лампой рт.ст. и светофильтров для DAPI (отл 400-418 нм; EM 450-465), FITC (отл 478-495; EM 510-555) и Texas Red (отл 560-580; EM 600 -650) для использования с окуляром.

1. С помощью флуоресцентной лампы, поместите объектив 40X в середине коллаген капли. Получите обзор образца, и по оси х и оси. Удостоверьтесь, чтобы не отклоняться более чем на 100 мкм от края геля на оси XY при приобретении изображения, чтобы избежать краевых эффектов. При визуализации сфероидами, убедитесь, что они находятся под цель рабочего расстояния. Изменение цели, если это необходимо.
2. Переключитесь на конфокальной режиме живого изображения. При использовании 561 нм лазер для визуализации TAMRA меченного коллагена, начиная с прозрачным дном определить значение г, при котором волокна коллагена появляться. Это подложки дно и г = 0.
3. С помощью ручки фокусировки, поднимаемся 100 мкм от Z = 0. Только клетки при Z = 100 мкмили выше, должны быть отображены, чтобы избежать напряженности эффект от жесткой стеклянным дном.
4. Выделите ячейки, к изображению. Оптимизация экспозиции камеры раза и мощности лазерного излучения для каждой длины волны. Типичное время экспозиции для DAPI и Alexa-488 фаллоидином находятся между 100-200 мс. Время экспозиции для окрашивания антителами могут отличаться.
5. На конфокальной режиме реального времени с использованием соответствующего лазерного визуализировать фаллоидином окрашивания и используя ручку фокусировки, определить интервал серии Z, установив верхнюю и нижнюю Z значения тока.
6. Определить г-размера шага. Для 40х, используйте 1 мкм. Для 60X, используйте 0,5 мкм. Начать приобретения.

Результаты

Маркировка крысы хвост коллагена я с TAMRA позволяет легко подготовки и визуализации 3D сетей коллагена. Медленное полимеризации при комнатной температуре приводит к образованию коллагена сети с сопоставимыми организации, найденные в естественных условиях ^10.

?...

Обсуждение

Протокол, описанный здесь, чтобы флуоресцентно этикетке коллагена I использованием TAMRA обеспечивает отличный способ, чтобы облегчить визуализацию организации сети коллаген, используя стандартный конфокального микроскопа, снабженного 561 нм лазера. Преимущество этого метода по сравне?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
TAMRA, SE	Invitrogen	C-1171
Rat tail Collagen High Concentration	BD Biosciences	354249
Rat tail Collagen	BD Biosciences	354236
Phalloidin	Sigma	P2141
Taxol (Paxitel)	Sigma	T7402
Mouse anti-alpha Tubulin antibody	Sigma	T9026
Alexa 488 Phalloidin	Invitrogen	A12379
Alexa 633 Goat anti-Mouse antibody	Invitrogen	A21052
DAPI	Invitrogen	D1306
Mounting media	Fisher Scientific	106 226 89
Dialysis Cassette	Pierce	66380
Glass bottom dishes	World Precision Instruments	FD35-100
MetaMorph Microscopy Automation & Image Analysis Software	Molecular Devices
Imaris 7.2.3	Bitplane