חושף את ארגון cytoskeletal של תאי סרטן פולשני ב-3D

Summary

מאמר זה מציג שיטה לתייג קולגן שניתן להשתמש בו גם תיקון נוסף ולהדמית חיה של תרביות תאי 3D fluorescently. כמו כן אנו מספקים פרוטוקול מותאם לדמיין חלבוני cytoskeletal אנדוגניים של תאים בתרבית בסביבות 3D.

Abstract

נדידת תאים באופן מסורתי נחקרה במצעי 2D. עם זאת, זה הפך להיות ברור יותר ויותר שיש צורך ללמוד את נדידת תאים בסביבות 3D מתאימות יותר, שדומים יותר טוב הממדיות של התהליכים הפיסיולוגיים בשאלה. תאים נודדים באופן משמעותי יכולים להיות שונה במורפולוגיה ובמצב של הגירה שלהם, תלוי אם הם נעים על מצעי 2D או 3D. בשל קשיים טכניים ותאימויות עם פרוטוקולים הסטנדרטיים ביותר, ניתוח מבני ותפקודי של תאים מוטבעים בתוך מטריצות 3D עדיין נדיר. מאמר זה מתאר שיטות להכנה והדמיה של תרביות תאים סרטניים 3D, או כתאים או spheroids בודדים. כמצע ECM מתאים לנדידת תאי סרטן, אנחנו משתמשים בקולגן זנב חולדת nonpepsinized אני polymerized בטמפרטורת חדר, ושכותרתו fluorescently כדי להקל הדמיה באמצעות מיקרוסקופים confocal סטנדרטיים. עבודה זו כוללת גם protocol תיוג immunofluorescent 3D של שלד תא תא אנדוגני. שימוש בפרוטוקולים אלה אנו מקווים לתרום לתיאור טוב יותר של ההרכב המולקולרי, לוקליזציה, ופונקציות של מבנים הסלולר ב-3D.

Introduction

התחום של נדידת תאים כבר braving אל עולם הממד השלישי החדש. זה אינטואיטיבי ללמוד נדידת תאים בסביבה הדומה ביותר הפיזיולוגי אחת, ולכן, תלת ממדי (3D). עם זאת, בשל מגבלות טכניות, מחקרי נדידת התאים ביותר נעשו ניתוח תנועת תא על פני מצעים דו ממד (2D) נוקשים, או ללא טיפול או מצופה עם מטריקס (ECM) חלבונים תאיים מתאימים.

המחקרים הראשונים המוקדשים לנדידת תאים בשלושה סריגי קולגן ממדיים לחזור מעל 20 שנים ^1-3. עם זאת, רק ב -5 השנים האחרונות זה הפך להיות ברור כי תאים נודדים באופן מהותי יכולים שיהיו שונים במורפולוגיה ובמצב של הגירה בהתאם ממדי של המצע שלהם. ב 2D, תאים פנו מצע עם פני השטח הגחון שלהם באמצעות הידבקויות מוקד בלבד, וכתוצאה מכך היווצרות של בליטות שטוחות רחבות (lamellipodia) עםבליטות דמויות אצבע מוטבעות (filopodia) בקצה המוביל שלהם. מבנים אלה, יחד עם סיבי מתח המחברים את התא הקדמי לקצה הנגרר, הם האמינו להיות מכריע עבור תנועת תא ב2D. במטריצות 3D, תאים הם בדרך כלל מוארכים יותר, עם תא השטח כולו יצירת קשר עם ECM, גורמים לשינויים ניכרים במבנה ואת הרלוונטיות של פעילות של רבים ממבנים אלה. לעומת זאת, תכונות סלולריות אחרות להשיג רלוונטיות בהגירת 3D, כגון עיוות גרעינית ומבנים מעורבים בECM שיפוץ ^4.

למרות שינויים אלה ידועים מורפולוגיים, כמו גם הבדלים במצבי הגירת ^5-7, אשר יכול להשתנות בהתאם לECM וסוגי תאים, ניתוח מבני ותפקודי של תאים מוטבעים בתוך מטריצות 3D עדיין יוצא דופן. עבודה עם מטריצות 3D עבות וצפופות נושא קשיים טכניים, כגון הדמיה מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה, וחוסר תאימות עם מרבית staפרוטוקולי ndard מותאמים לתרבויות 2D, כמו תיוג immunofluorescent של חלבונים אנדוגניים. כמו כן, משום שהשימוש במטריצות 3D הוא גישה חדשה יחסית, חוקרים עדיין בודקים את התנאים הטובים ביותר לדומים למצבים ספציפיים בvivo, כגון ארכיטקטורת סטרומה נורמלית של איברים או רקמות שונות בארגון ECM סביב גידול. הבדלים בתוצאות על ידי קבוצות שונות הנוגעות, למשל, מצבי סרטן תאים של הגירה או קיומן של הידבקויות מוקד, יצרו מחלוקת ^8. הרבה מאמץ הוקדשה לאחרונה כדי להגיע להסכמה במונחים של ECM אופי כימי, גודל נקבובית, עובי סיבים, ומטריצת קשיחות. סוגים רבים ושונים של ECMS 3D משמשים כיום, שונים ממטריצות נגזרות סלולריים לmatrigel זמין מסחרי, קולגן שור pepsinized אני, או קולגן זנב החולדה nonpepsinized י כל אחד מהמטריצות האלה יש תכונות פיסיקליות וכימיות ספציפיות ואחד צריך רלהte המטריצה ​​של בחירה לתהליך הפיזיולוגי הנלמד. בנוסף, עובי וגודל נקבובית סיבים יכול להיות תלוי בתנאים פילמור, כגון pH וטמפרטורה ^9,10. קשירה ולמרחק ממצעים קשיחים כגון זכוכית, ניתן גם לשנות את תכונות האלסטיות של המטריצה ^​​10,11.

מאמר זה מתאר שיטות להכנה והדמיה של תרביות תאים סרטניים 3D, או כתאים או spheroids בודדים. שיטות להכנת spheroids תאים סרטניים בעבר תאר, את אלה הפופולריים ביותר להיות שיטת טיפה התלויה ^12,13 ושיטת צלחת agarose המצופה ^14. כמצע ECM מתאים לנדידת תאי סרטן, קולגן זנב החולדה nonpepsinized אני polymerized בטמפרטורת חדר, הוא משמש ב2 מ"ג / מ"ל. קולגן חומצת החילוץ Nonpepsinized אני מזנב חולדה שומר שני טרמינל C-N-וtelopeptides, חלקי nonhelical של מולקולת הקולגן אחראי להאם של קולגן intermoleccrosslinking תואר בלבד ויציבות fibrilar ^15. יחד, בתנאים אלה יאפשר היווצרות של רשתות קולגן שדומים באופן הדוק ביותר את אלה שנצפו בvivo ^10. כדי לאפשר הדמיה של סיבי קולגן, הן בתרבויות קבועות וחיים, פרוטוקול מפורט מסופק לתייג הקולגן במבחנה ¹⁰ באמצעות 5 fluorescently - (ו- 6)-carboxytetramethylrhodamine (טמרה), אסתר succinimidyl. פרוטוקול זה הותאם מBaici et al. ^16,17, בי isothiocyanate ההעמסה משמש לתייג מולקולות מסיסים קולגן. וכהעמסה, טמרה היא צבע פלואורסצנטי אמינו-reactive שמגיב עם קבוצות nonprotonated aliphatic אמינו של חלבונים, כגון קבוצת אמינו החופשית בN-הסופית, וחשוב יותר, קבוצה אמינית הצד של lysines. תגובה זו מתרחשת רק ב-pH הבסיסי, כאשר קבוצת אמינו ליזין היא בצורת nonprotonated. בנוסף לטמרה להיות יציבה יותר מהעמסה עלזמן, ספקטרום הפליטה שלה נופל על מגוון הכתום / אדום (= 555/518 ננומטר לשעבר / EM), אשר יכול להיות משולב מועילה להדמית תא חי של חלבוני ה-GFP-מתויגים. שימוש במולקולות מסיסים קולגן שכותרתו עם צבעי אמינו תגובתי אינו משפיעה על תהליך פילמור ולא הצפיפות, הגודל נקבובית ומעמד crosslinking של מטריצת הקולגן ^10,16,18,19.

פרוטוקול זה כולל גם את שיטה לתיוג immunofluorescent 3D של חלבונים אנדוגניים, אשר עבר אופטימיזציה נוספת לתייג את שלד התא או חלבונים הקשורים cytoskeleton. המיקוד הסופי של פרוטוקול זה הוא על שיטות לרכוש תמונות ברזולוציה גבוהה של תרבויות 3D באמצעות מיקרוסקופיה confocal עם תרומה מופחתת מcoverslips הזכוכית הנוקשים על מתח מטריצת הקולגן.

Protocol

1. טמרה-קולגן אני תיוג

1. הכן פתרון טמרה מ"ל 10 מ"ג / 2.5 מ"ל על ידי הוספת DMSO ל25 מ"ג האבקה סיפקה טמרה. לפזר אותו על ידי vortexing עד לפירוק מוחלט. חנות ב -20 מעלות צלזיוס, ולהגן מפני אור.
2. להכין 2 ליטר של הצפת תיוג (0.25 מ _'3 NaHCO, 0.4 מ' NaCl). כדי להתאים את pH 9.5 באמצעות פתרון M 10 של NaOH. לשמור על 4 מעלות צלסיוס מנקודה זו, כל הפעולות מתבצעות ב4 º C, אלא אם כן חומר האמור וניאון אחרת הוא מוגן מפני אור באמצעות רדיד אלומיניום.
3. מלא מזרק חד פעמי 1 מ"ל עם 1 מ"ל של קולגן עכברוש זנב המרוכז מאוד פתרון. פתרונות קולגן ריכוז גבוהים ניתנים בדרך כלל בריכוזים סביב 10 מ"ג / מ"ל ​​והם מאוד צמיג. הקפד לתפעל אותו לאט, כדי למנוע היווצרות של בועות אוויר.
4. באמצעות מחט 21 G מזרק, להזריק קולגן לקלטת presoaked 3 מיליליטר דיאליזה של 10,000 MWCO נותק. השתמש בזהירות כדי להימנע מDamaגינג הקרום עם המחט. הסר את כל האוויר מקלטת הדיאליזה על ידי משיכת הבוכנה המזרק. Dialyze אותו הלילה נגד 1 ליטר של הצפת תיוג.
5. מערבבים 100 μl של פתרון טמרה מ"ל 10 מ"ג / 900 עם μl של הצפת תיוג. הערה: זה צריך להיעשות עם שני פתרון טמרה והצפת תיוג בטמפרטורת חדר מאז DMSO קופא על 4 מעלות צלסיוס לאחר ערבוב, להביא את פתרון טמרה המדולל בחזרה עד 4 מעלות צלסיוס
6. מוציא בזהירות את קולגן מקלטת הדיאליזה באמצעות מזרק חד פעמי 2 מ"ל עם מחט 21 G מזרק. מערבבים 1 מ"ל של פתרון קולגן dialyzed עם 1 מ"ל של תמיסה מדוללת טמרה ידי pipetting.
7. העבר קולגן / תמהיל טמרה לתוך צינור microcentrifuge 2 מ"ל ו דגירה לילה עם רוטציה.
8. העבר 2 מ"ל של קולגן טמרה שכותרתו לתוך קלטת presoaked 3 מיליליטר דיאליזה וdialyze הלילה נגד 1 ליטר של תיוג הצפת כדי להסיר את העודפים של צבע ללא תשלום.
9. כדי לשחזר במעבדת טמרהקולגן eLED לפתרון המקורי קולגן, הצב את קלטת הדיאליזה לתוך 1 ליטר של 0.2% (V / V) פתרון חומצה אצטית, pH 4, וdialyze בן לילה.
10. מדוד את הנפח הסופי של קולגן טמרה שכותרתו ולחשב הריכוז הסופי שלו, בהתחשב בהיקף הראשוני והריכוז של פתרון קולגן בשימוש. חנות ב 4 המעלות צלסיוס

2. מטריצות 3D טמרה-קולגן עם תאים בודדים משובצים

1. חישוב הנפח של 2-Mix טמרה קולגן מ"ג / מ"ל ​​ההכרחי לניסוי. תמיד להכין 20% יותר לחשבון עבור pipetting הפסדים בשל צמיגות הגבוהה קולגן.
2. הכן פתרון מניות של PBS 10x ו1 N NaOH. מסנן לעקר ולשמור על 4 מעלות צלסיוס מנקודה זו, כל הפעולות מתבצעות על קרח אלא אם צוין אחרת ובתנאים סטריליים.
3. מערבבים PBS 10x ו1 N NaOH בכמויות מתאימות כדי להשיג את הריכוז הרצוי וקולגן pH 7.4. לדוגמה, עבור נפח סופי של 1 מ"למיקס של טמרה-קולגן ב-pH 7.4, לשלב μl 100 של PBS 10x עם 5 μl של 1N NaOH. מערבבים היטב.
4. הוסף את הנפחים המתאימים של שניהם קולגן טמרה שכותרתו וקולגן ללא תווית ביחס 01:06 להשיג ריכוז קולגן כולל סופי של 2 מ"ג / מ"ל. לדוגמה, עבור נפח סופי של 1 מ"ל של 2 מיקס טמרה-קולגן מ"ג / מ"ל, להוסיף 90.48 μl של קולגן טמרה שכותרת מ"ג / מ"ל ​​3.68 ו415.71 μl של 4.01 מ"ג / מ"ל ​​של קולגן ללא תווית. מערבבים היטב ולאט לאט על ידי pipetting, הימנעות היווצרות של בועות אוויר.
5. הוסף תאים תלויים בנפח המתאים של מדיום סלולרי צונן ללא FBS לתערובת טמרה-קולגן כדי להשיג צפיפות תאים סופית של 10 ⁵ תאים / מ"ל וריכוז קולגן סופי של 2 מ"ג / מ"ל. לדוגמה, עבור 1 מ"ל של 2 מיקס טמרה-קולגן מ"ג / מ"ל, להוסיף 388.81 μl של מדיה המכיל 10 ⁵ תאים. מערבבים היטב ולאט לאט על ידי pipetting, הימנעות היווצרות של בועות אוויר. לאשר את החומציות על ידי בדיקת 10 μl של התמהיל במבחן ה-pH שלטיול.
6. 100 טיפות μl פיפטה של ​​מיקס טמרה-קולגן על מנות תחתיות זכוכית ולאפשר לו לפלמר בטמפרטורת חדר למשך 30-45 דקות. יש 100 טיפות קולגן μl קוטר טיפוסי של 7 מ"מ והם 2 מ"מ. כאשר polymerized, קולגן הופך לג'ל איש לבן. שים לב: מתן האפשרות לקולגן לפלמר מבלי לסגור את המנה תהיה למנוע היווצרות של סרט מים סביב ירידת קולגן, הפחתת ניתוק מהזכוכית. כדי להגדיל את הדבקות, יכולות להיות מצופים מנות זכוכית עם פולי-L-ליזין ב100 מיקרוגרם / מ"ל.
7. מוסיף בזהירות מדיום התרבות מספיק כדי לכסות את טיפות קולגן / תא. הימנע מנתיבים גבוהים של תקשורת או תנועות פתאומיות מאז טיפות קולגן יכולות בקלות לנתק. שמור על C º 37 10% באוויר humidified CO _{2 למשך} מספיק זמן לתאים לנדוד במטריצה ​​(בדרך כלל 1-3 ימים).

3. מטריצות 3D טמרה-קולגן עם spheroids הסלולרי משובץ

1. חישוב הנפח של 2 מ"ג / מיליליטר טמרה-M קולגןIX ההכרחי לניסוי. תמיד להכין 20% יותר לחשבון עבור pipetting הפסדים בשל צמיגות הגבוהה קולגן.
2. הכן פתרון מניות של PBS 10x ו1 N NaOH. מסנן לעקר ולשמור על 4 מעלות צלסיוס מנקודה זו, כל הפעולות מתבצעות על קרח אלא אם צוין אחרת ובתנאים סטריליים.
3. מערבבים PBS 10x, 1 N NaOH ותקשורת סלולרי ללא FBS בכמויות מתאימות כדי להשיג את ריכוז קולגן הרצוי וpH 7.4. לדוגמה, עבור נפח סופי של 1 מ"ל של מיקס טמרה-קולגן ב-pH 7.4, לשלב μl 100 של PBS 10x, 5 μl של 1 N NaOH ו388.81 μl של תקשורת. מערבבים היטב.
4. הוסף את הנפחים המתאימים של שניהם קולגן טמרה שכותרתו וקולגן ללא תווית ביחס 01:06 להשיג ריכוז קולגן כולל סופי של 2 מ"ג / מ"ל. לדוגמה, עבור נפח סופי של 1 מ"ל של 2 מיקס טמרה-קולגן מ"ג / מ"ל, להוסיף 90.48 μl של קולגן טמרה שכותרתו 3.68 מ"ג / מ"ל ​​ו 415.71 μl של 4.01 מ"ג / מ"ל ​​של unlaקולגן beled. מערבבים היטב ולאט לאט על ידי pipetting, הימנעות היווצרות של בועות אוויר. לאשר את החומציות על ידי בדיקת 10 μl של התמהיל על רצועת בדיקת חומציות.
5. 100 טיפות μl פיפטה של ​​מיקס טמרה-קולגן על מנות תחתיות זכוכית ולאפשר לו ליזום פילמור במשך 2-5 דקות. זה יעזור כדי למנוע טביעתה של spheroids ידי מעט מגביר את צמיגות הג'ל. יש 100 טיפות קולגן μl קוטר טיפוסי של 7 מ"מ והם 2 מ"מ.
6. לאסוף אליפטית תא ולמקם אותו על צלחת פטרי נקי. הסר את כל עודף של נוזל וresuspend זה ב10 μl של מיקס טמרה-קולגן. זה חשוב כדי למנוע דילול של קולגן עם תקשורת סלולרי.
7. בעזרת פיפטה P20, לאסוף קולגן המושעה אליפטית ולמקם אותו בחלק העליון של מרכז ירידת מיקס טמרה-קולגן μl 100. הערה: אין יותר ממקום אחד לכל טיפת אליפטית קולגן, כיוון שהם יכולים להשפיע על כל קיבולת אחרת לפלוש ו / או להעביר.
8. לאפשר מיקס טמרה-קולגן לפוליmerize בטמפרטורת חדר למשך 30-45 דקות. כאשר polymerized, קולגן הופך לג'ל איש לבן. שים לב: מתן האפשרות לקולגן לפלמר מבלי לסגור את המנה תהיה למנוע היווצרות של סרט מים סביב ירידת קולגן, הפחתת ניתוק מהזכוכית. כדי להגדיל את הדבקות, יכולות להיות מצופים מנות זכוכית עם פולי-L-ליזין ב100 מיקרוגרם / מ"ל.
9. מוסיף בזהירות מדיום התרבות מספיק כדי לכסות את טיפות spheroids קולגן /. הימנע מנתיבים גבוהים של תקשורת או תנועות פתאומיות מאז טיפות קולגן יכולות בקלות לנתק.
10. שמור על C º 37 10% באוויר humidified CO _{2 למשך} מספיק זמן לתאים לפלוש / להעביר במטריצה ​​(בדרך כלל 1-3 ימים).

4. מכתים immunofluorescence 3D

1. מוציא בזהירות את התקשורת הסלולרי ולשטוף את מטריצות קולגן המכילות תאים / spheroids עם PBS.
2. במקביל לתקן ולחלץ תאים על ידי דוגרים עם חיץ חילוץ / קיבעון (PFA 4%,, סוכרוז 0.3% טריטון X-100 של 5% בPBS) למשך 5 דקות. להשלים עם חיץ Phalloidin מיקרומטר 2 ו 2 מיקרומטר טקסול להדמיה של שלד תא או חלבונים הקשורים cytoskeleton.
3. יתר על כן לתקן את התאים עם PFA 4%, 5% סוכרוז ב-PBS למשך 30 דקות. לשטוף עם 0.05% Tween-20 ב-PBS.
4. פתרונות נוגדנים עיקריים להכין PBS. דגירה תאים עם נוגדנים ראשוניים במשך שעה לפחות 1 בטמפרטורת חדר או הלילה ב 4 המעלות צלסיוס הקפד להוסיף מספיק פתרון כדי לכסות את ירידת קולגן כולו. לצלחת תחתית זכוכית 35 מ"מ, 1.5-2 מ"ל של תמיסה יהיה צורך בכך. הערה: כדי להפחית את עוצמת הקול של פתרון נוגדן, מכשול בלתי מסיס מים, כגון קו מעגל גריז סיליקון או טבעת PDMS, ניתן להציב סביב ירידת קולגן.
5. שטוף 30 דקות 3x עם 0.05% Tween-20 ב-PBS.
6. הכן את נוגדנים משני אלקסה-מצומדות, phalloidin אלקסה מצומדות ופתרונות DAPI PBS. דגירה תאים עם הנוגדנים משני המתאימים עבור 2 שעות בטמפרטורת חדר.
7. לשטוף 3x 30 דקות עם 0.05% Tween-20 ב-PBS.
8. להסיר עודפים של נוזל, להוסיף מספיק הרכבה תקשורת כדי למלא את תחתית צלחת תחתית הזכוכית (μl כ 500) ומניח על גבי coverslip 24 מ"מ כדי לאטום. אל תלחץ כלפי מטה את coverslip כדי למנוע דחיסת טיפת קולגן ופגיעה בארגון 3D.

5. הדמיה לדוגמה

ניתן להשתמש במיקרוסקופי confocal דיסק קלאסי או ספינינג. מעדיף מערכת הפוכה יש להשתמש כדי לקבוע את המרחק של התאים צלמו מתחתית הכוס. המערכת המשמשת לעבודה זו היא דיסק מסתובב confocal הפוכה מצויד במטרות נפט הטבילה 60X/1.4NA (עובד מרחקים 200 מיקרומטר ו130 מיקרומטר, בהתאמה) ו40X/1.3NA, מצלמה Photometrics CoolSNAP HQ2, 1392 x 1040 מערך הדמיה, 6.45 6.45 x מיקרומטר פיקסלים ונשלט על ידי תוכנת ההדמיה Metamorph. 405 ננומטר, 491 ננומטר, 561 ננומטר, ו633 ננומטר לייזרים משמשים בדרך כלל 30-50% בצריכת החשמל, ולקבל 1 binning של 2X 2 כדי להפחית את זמני חשיפה. מיקרוסקופ מצויד גם עם מנורה כספית וקוביות לסנן DAPI (400-418 ננומטר EXC; em 450-465), FITC (exc 478-495; 510-555) וטקסס אדומה (exc 560-580; 600 -650) להשתמש בעינית.

1. באמצעות מנורת הניאון, הצב את מטרת 40X באמצע טיפת קולגן. קבל סקירה כללית של המדגם, הן בציר XY וציר z. הקפד לא לסטות יותר מ -100 מיקרומטר מקצה ג'ל על ציר XY בעת רכישה את התמונות, כדי למנוע השפעות קצה. כאשר spheroids הדמיה, לוודא שהם מתחת למרחק העבודה האובייקטיבי. שינוי אובייקטיבי אם מתאים.
2. לעבור למצב ההדמיה לחיות confocal. על ידי שימוש בלייזר ננומטר 561 לדמיין קולגן טמרה שכותרתו, החל מתחתית הכוס לקבוע את ערך Z שבו סיבי קולגן להתחיל להופיע. זהו המצע התחתון וZ = 0.
3. באמצעות כפתור הפוקוס, ללכת עד 100 מיקרומטר מZ = 0. תאים רק ב z = 100 מיקרומטראו לעיל צריך להיות צילמו כדי למנוע תופעות מתח מתחתית הזכוכית הנוקשה.
4. בחר את התאים לתמונה. לייעל את זמני חשיפת מצלמה וכוח לייזר לכל אורך גל. זמני חשיפה אופייניים עבור DAPI וAlexa-488 Phalloidin הם בין 100-200 אלפיות שני. זמני חשיפה למכתים נוגדן עשויים להשתנות.
5. במצב חי confocal באמצעות לייזר המתאים כדי להמחיש את phalloidin מכתים ובאמצעות כפתור הפוקוס, להגדיר את מרווח סדרת Z על ידי קביעת ערכי z עליונים ותחתונים לנוכחיים.
6. הגדר את גודל Z-הצעד. למטרות 40X, השתמש 1 מיקרומטר. ל60x, השתמש 0.5 מיקרומטר. התחל רכישה.

תוצאות

תיוג עכברוש זנב קולגן אני עם טמרה מאפשר הכנה קלה ויזואליזציה של רשתות קולגן 3D. פילמור איטי בטמפרטורת חדר בתוצאות היווצרות של רשתות קולגן עם ארגון דומה לאלה שנמצאו בvivo ^10.

כאן אנו מציגים פרוטוקול למכתים immunofluorescence של cytoskel...

Discussion

הפרוטוקול מתואר כאן לתייג קולגן fluorescently אני משתמש בטמרה מספקת שיטה מצוינת כדי לאפשר הדמיה קלה של ארגון רשת קולגן, באמצעות מיקרוסקופ confocal סטנדרטי מצוידים בליזר ננומטר 561. יתרון של שיטה זו בהשוואה למיקרוסקופיה confocal ההחזרה הוא יכולת סיבי קולגן תמונה עמוקות יותר לתוך מט?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
TAMRA, SE	Invitrogen	C-1171
Rat tail Collagen High Concentration	BD Biosciences	354249
Rat tail Collagen	BD Biosciences	354236
Phalloidin	Sigma	P2141
Taxol (Paxitel)	Sigma	T7402
Mouse anti-alpha Tubulin antibody	Sigma	T9026
Alexa 488 Phalloidin	Invitrogen	A12379
Alexa 633 Goat anti-Mouse antibody	Invitrogen	A21052
DAPI	Invitrogen	D1306
Mounting media	Fisher Scientific	106 226 89
Dialysis Cassette	Pierce	66380
Glass bottom dishes	World Precision Instruments	FD35-100
MetaMorph Microscopy Automation & Image Analysis Software	Molecular Devices
Imaris 7.2.3	Bitplane