3D로 침윤성 암 세포의 세포 골격 조직을 공개

요약

이 문서는 찬란 추가 수정 및 3D 세포 배양의 라이브 영상 모두에 사용할 수 있습니다 콜라겐 레이블을하는 방법을 제시한다. 우리는 또한 3D 환경에서 배양 세포의 내생 세포 골격 단백질을 시각화하기 위해 최적화 된 프로토콜을 제공합니다.

초록

세포 이동은 전통적으로 2D 기판에서 공부하고있다. 그러나, 그것은 더 나은 문제의 생리적 인 과정의 차원과 유사 더 적절한 3D 환경에서 세포의 이동을 연구 할 필요가 있다는 것을 점점 더 분명하게되었다. 철새 세포는 실질적으로 그들이 2D 또는 3D 기판에 이동 여부에 따라 그 형태와 마이그레이션 모드에서 다를 수 있습니다. 대부분의 표준 프로토콜, 3D 매트릭스 내에 포함 된 세포의 구조 및 기능 분석과 기술적 인 문제와 비 호환성으로 인해 여전히 드문 남아있다. 이 문서에서는 단일 세포 또는 상체로 하나, 준비 및 3D 암 세포 배양의 이미징을위한 방법을 설명합니다. 암 세포 이동에 적합한 ECM 기판으로, 우리는 내가 상온에서 중합 찬란 표준 공 촛점 현미경을 사용하여 시각화를 촉진하기 위해 표시 nonpepsinized 쥐의 꼬리 콜라겐을 사용합니다. 이 작품은 protoc를 포함내인성 세포의 세포 뼈대의 3D 면역 형광 라벨링 OL. 우리는 분자 구성, 지역화, 그리고 3 차원 세포 구조의 기능을 잘 설명에 기여할 수 있도록 노력하겠습니다 이러한 프로토콜을 사용.

서문

세포 이주의 필드는 새로운 세 번째 차원의 세계로 용감하게 맞서는되었습니다. 그것은 가장 밀접하게 생리 한 유사하고, (3D) 따라서, 입체 환경에서 세포의 이동을 연구하는 직관적이다. 그러나, 기술적 한계로, 대부분의 세포 이동 연구는 치료 또는 적합한 세포 외 기질 (ECM) 단백질을 코팅하거나, 딱딱한 두 개의 차원 (2D) 기판을 통해 세포의 움직임을 분석 해본 적이있다.

입체 콜라겐 격자에서 세포의 이동에 전념 첫 번째 연구 20 년 ^1-3에 돌아갑니다. 그러나, 지난 5 년 동안 그것은 철새 세포가 실질적으로 자신의 형태와 기질의 차원에 따라 마이그레이션 모드에서 다를 수있는 것이 분명되고있다. 2D로, 세포에만 넓은 평지 돌출의 형성 (lamellipodia)의 결과로, 초점 유착을 사용하여 복부 표면과 기판 연락자신의 앞 가장자리에 내장 된 손가락 같은 돌기 (filopodia). 이러한 구조는 함께 후행 가장자리 셀 앞을 연결 스트레스 섬유, 2D로 세포 이동에 중요한 것으로 생각된다. 3D 매트릭스에서 세포 형성과 이러한 구조의 많은 기능 관련에 상당한 변화를 일으키는, ECM 문의 전체 세포 표면으로, 일반적으로 더 연장됩니다. 반대로, 다른 세포의 기능은 ECM 개조 ^4에 관련된 핵 변형 및 구조와 같은 3D 이주 관련을 얻을 수 있습니다.

이러한 알려진 형태 변경뿐만 아니라 ECM과 세포 유형, 3D 매트릭스 내에 포함 된 세포의 구조와 기능 분석에 따라 달라질 수 있습니다 ^5-7 마이그레이션 모드의 차이에도 불구하고 여전히 드문 남아있다. 두께와 밀도 차원 행렬로 작업 기술 등의 고해상도 현미경 이미징 어려움, 대부분의 역에 호환성을 수행ndard 프​​로토콜은 내인성 단백질의 면역 형광 라벨처럼, 2D 문화에 최적화. 3D 매트릭스의 사용은 비교적 새로운 접근 방식이기 때문에 또한, 연구자들은 여전히 밀접하게 같은 다른 조직 기관의 정상적인 기질 아키텍처 나 종양 주변의 ECM 조직과 생체 내 상황에서 특정 닮은 최적의 조건을 조사하고 있습니다. 관련된 다른 그룹에 의한 결과 차이는, 예를 들어, 암 세포 이주의 모드 나 초점 유착의 존재는, 약간의 논쟁 ⁸ 생성 한. 많은 노력이 최근 ECM 화학적 특성, 기공 크기, 섬유 두께, 매트릭스 강성의 측면에서 합의에 도달하기 위해 최선을 다하고있다. 3D ECMs의 많은 다른 유형은 현재 세포 유래 행렬에서 시판 리겔, pepsinized 소 콜라겐 I, 또는 nonpepsinized 쥐의 꼬리 콜라겐 I.이 행렬의 각 특정 물리적, 화학적 특성을 가지고 있으며, RELA 한 요구에 다양한 사용됩니다TE는 생리적 과정의 선택의 행렬이 연구되고있다. 또한, 기공 크기 및 섬유의 두께는 pH와 온도 ^9,10 등의 중합 조건에 따라 달라질 수 있습니다. 유리와 같은 딱딱한 기판에서와 거리 바인딩도 행렬 ^10,11의 탄성 속성을 변경할 수 있습니다.

이 문서에서는 단일 세포 또는 상체로 하나, 준비 및 3D 암 세포 배양의 이미징을위한 방법을 설명합니다. 암 세포 구형 체를 만들기위한 방법은 이전에 매달려 드롭 방식 ^12,13와 아가로 오스 코팅 플레이트 방식 ^14되는 가장 인기있는 것들을 설명하고있다. 암 세포 이동에 적합한 ECM 기판으로, 난 방 온도에서 중합 nonpepsinized 쥐의 꼬리 콜라겐은 2 밀리그램 / ML에서 사용됩니다. Nonpepsinized 산 추출 된 콜라겐 쥐의 꼬리에서 I는 모두 N-및 C-말단 telopeptides, 기본 콜라겐 intermolec에 대한 책임 콜라겐 분자의 nonhelical 부분을 유지ular 가교 fibrilar 안정성 ^15. 함께, 이러한 조건에 가장 가까운 생체 ^10에서 관찰 된 것과 유사하는 콜라겐 네트워크를 형성 할 수 있습니다. 고정 및 생활 문화 모두에서 콜라겐 섬유의 시각화를 허용하려면, 자세한 프로토콜은 찬란 5를 사용 관내 ¹⁰ 콜라겐 레이블을 제공 - (및 6) carboxytetramethylrhodamine (TAMRA), 석신 에스테르. 이 프로토콜은 Baici 등에서 적응되었습니다. 형광 이소 티오 시아 네이트는 수용성 콜라겐 분자의 레이블을 지정하는 데 사용되는 ^{16, 17,.} 형광으로, TAMRA는 N-말단에서 무료 아미노 그룹과, 더 중요한 것은, 라이신의 측면 아미노 그룹으로 단백질의 nonprotonated 지방족 아미노 그룹과 반응하여 아미노 반응 형광 염료이다. 라이신 아미노산 그룹 nonprotonated 형태에있을 때이 반응은 기본적인 pH에서 발생합니다. TAMRA가에 형광보다 더 안정되고 이외에시간은 그것의 방출 스펙트럼은 유용 GFP - 태그 단백질의 라이브 셀 이미징 결합 될 수 레드 / 오렌지 범위 (예 / EM = 518분의 555 nm의)에 빠진다. 아미노 반응성 염료와 수용성 콜라겐라는 분자를 사용하여 중합 공정이나 밀도, 기공 크기 및 콜라겐 매트릭스 ^{10,16,18,19의} 가교 상태에 영향을주지 않습니다.

이 프로토콜은 또한 더 골격이나 골격 관련된 단백질을 라벨에 최적화 된 내인성 단백질의 3 차원 면역 형광 표시하는 방법을 포함하고 있습니다. 이 프로토콜의 마지막 초점은 콜라겐 매트릭스 장력 경질 유리 커버 슬립의 감소 공헌 공 촛점 현미경을 사용하여 3D 문화의 고해상도 영상을 획득하는 방법입니다.

프로토콜

1. TAMRA - 콜라겐 I 라벨링

1. 공급 25 밀리그램 TAMRA 분말에 2.5 ML DMSO를 첨가하여 10 ㎎ / ㎖ TAMRA 솔루션을 준비합니다. 완전 용해 될 때까지 소용돌이로 교반하여 용해. -20 º C에서 보관하고 빛으로부터 보호합니다.
2. 라벨 버퍼 (0.25 M _NaHCO3를, 0.4 M의 NaCl)의 2 L를 준비합니다. 의 NaOH 10 M 용액을 사용하여 9.5로 산도를 조정합니다. 4 º C.에 보관 별도의 언급과 형광 물질은 알루미늄 호일을 사용하여 빛으로부터 보호하지 않는 한이 시점에서, 모든 작업은 4 º C에서 수행됩니다.
3. 고농도 쥐의 꼬리 콜라겐 I은 용액 1 ㎖와 1 ML 일회용 주사기를 채우십시오. 고농도 콜라겐 솔루션은 일반적으로 10 ㎎ / ㎖ 정도의 농도에서 제공하는 매우 점성 있습니다. 공기 거품의 형성을 피하기 위해 천천히 조작해야합니다.
4. 21 G 피하 주사 바늘을 사용하여, MWCO가 끊어 10,000 presoaked 3 ML 투석 카세트에 콜라겐을 주입. DAMA 않도록주의하십시오바늘로 막 끼울. 주사기 피스톤을 당겨 투석 카세트에서 모든 공기를 제거합니다. 라벨 버퍼 1 L에 하룻밤을 Dialyze.
5. 라벨 버퍼 900 μL와 10 ㎎ / ㎖ TAMRA 용액 100 μl를 섞는다. 참고 : DMSO 4 º C.에 얼어 때문에 이것은 상온에서 TAMRA 솔루션 및 라벨링 버퍼를 모두 수행해야 혼합 한 후, 희석 TAMRA 솔루션은 4 º C로 다시 가져
6. 조심스럽게 21 G 피하 주사 바늘로 2 ㎖ 일회용 주사기를 사용하여 투석 카세트에서 콜라겐을 제거합니다. pipetting하여 희석 TAMRA 용액 1 ㎖와 투석 콜라겐 용액 1 ㎖를 혼합한다.
7. 2 ML의 microcentrifuge 튜브에 콜라겐 / TAMRA 믹스를 이동하고 회전 밤새 품어.
8. presoaked 3 ML 투석 카세트에 TAMRA - 라벨 콜라겐 2 ㎖를 전송하고 무료 색소의 과잉을 제거하는 버퍼 레이블의 1 L에 하룻밤 dialyze.
9. TAMRA-실험실을 복원하려면콜라겐 원래 솔루션으로 모델링 콜라겐, 0.2 %의 1 L (v / v)의 아세트산 용액, pH를 4로 투석 카세트를 넣고 하룻밤 dialyze.
10. TAMRA - 라벨 콜라겐의 최종 부피를 측정하여 사용 콜라겐 용액의 초기 볼륨과 집중을 고려하여 최종 농도를 계산한다. 4 º C.에 저장

2. 임베디드 단일 세포와 3D TAMRA-콜라겐 매트릭스

1. 실험에 필요한 2 MG / ML TAMRA-콜라겐 믹스의 볼륨을 계산합니다. 항상 콜라겐 높은 점성으로 인한 손실을 피펫을 고려하여 20 % 이상을 준비합니다.
2. 10X PBS 1 N NaOH를 재고 솔루션을 준비합니다. 4 º C.에 필터 소독 및 유지 관리 별도의 언급과 무균 조건 하에서 않는 한이 시점에서, 모든 작업이 얼음에 수행됩니다.
3. 원하는 콜라겐 농도와 산도 7.4을 달성하기 위해 적절한 양의 10 배 PBS와 1 N NaOH를 섞는다. 예를 들어, 1 ML의 최종 볼륨pH가 7.4 TAMRA-콜라겐 믹스, 1N NaOH를 5 μL와 배 PBS 100 μl를 결합합니다. 잘 섞는다.
4. TAMRA - 라벨 콜라겐과 2 MG / ML의 최종 합계 콜라겐 농도를 달성하기 위해 1:6 비율로 레이블 콜라겐 양의 적절한 볼륨을 추가합니다. 예를 들어, 2 MG / ML TAMRA-콜라겐 믹스 1 ML의 최종 볼륨, 3.68 밀리그램 / ML TAMRA - 라벨 콜라겐과 4.01 ㎎ / 레이블 콜라겐 ML의 415.71 μL의 90.48 μl를 추가합니다. 공기 거품의 형성을 방지 pipetting하여 잘 천천히 섞는다.
5. 10 ⁵ 세포 / ㎖, 2 MG / ML의 최종 콜라겐 농도의 최종 세포 농도를 얻기 위해 TAMRA-콜라겐 믹스에 FBS하지 않고 냉장 전지 매체의 적절한 볼륨 부유 세포를 추가합니다. 예를 들어, 2 MG / ML TAMRA-콜라겐 믹스 1 ㎖를 들어, 10 ⁵ 세포를 포함하는 미디어 388.81 μl를 추가합니다. 공기 거품의 형성을 방지 pipetting하여 잘 천천히 섞는다. 산도 시험의에 믹스의 10 μl를 테스트하여 산도를 확인여행.
6. TAMRA-콜라겐 유리 바닥 요리 위에 혼합하고 30 ~ 45 분 동안 실온에서 중합 할 수 있도록 피펫 100 μL 상품 가격이 할인되었습니다. 100 μL 콜라겐 상품 7 mm의 전형적인 지름 높은 2mm이다. 중합 할 때, 콜라겐 화이트 흉내 젤로 바뀝니다. 참고 : 콜라겐 요리를 닫지 않고 중합하도록 허용하면 유리에서 박리 감소, 콜라겐 드롭 주위에 물 필름의 형성을 방지합니다. 준수를 높이기 위해 유리 접시가 100 ㎍ / ㎖에 폴리-L-라이신 코팅 할 수 있습니다.
7. 조심스럽게 콜라겐 / 셀 방울을 커버하기에 충분한 문화 매체를 추가합니다. 콜라겐 상품을 쉽게 분리 할 수​​ 있기 때문에 미디어 또는 갑작스러운 움직임의 높은 플럭스을 피하십시오. 매트릭스 (일반적으로 1~3일)에서 마이그레이션하는 세포에 충분한 시간 동안 10 %의 CO ₂ 가습 공기 37 º C에서 보관하십시오.

3. 임베디드 셀 상체와 3D TAMRA-콜라겐 매트릭스

1. 2 MG / ML TAMRA-콜라겐 M의 볼륨을 계산실험에 필요한 IX. 항상 콜라겐 높은 점성으로 인한 손실을 피펫을 고려하여 20 % 이상을 준비합니다.
2. 10X PBS 1 N NaOH를 재고 솔루션을 준비합니다. 4 º C.에 필터 소독 및 유지 관리 별도의 언급과 무균 조건 하에서 않는 한이 시점에서, 모든 작업이 얼음에 수행됩니다.
3. 10X PBS를 혼합, 적절한 양의 FBS가없는 1 N 수산화 나트륨과 세포 미디어 원하는 콜라겐 농도와 산도 7.4을 달성하기 위해. 예를 들어, 산도 7.4 TAMRA-콜라겐 믹스 1 ML의 최종 볼륨, 10X PBS 100 μL, 1 N NaOH를 5 μL와 미디어의 388.81 μl를 결합합니다. 잘 섞는다.
4. TAMRA - 라벨 콜라겐과 2 MG / ML의 최종 합계 콜라겐 농도를 달성하기 위해 1:6 비율로 레이블 콜라겐 양의 적절한 볼륨을 추가합니다. 예를 들어, 2 MG / ML TAMRA-콜라겐 믹스 1 ML의 최종 볼륨, 3.68 밀리그램 / ML TAMRA - 라벨 콜라겐 90.48 μL와 UNLA의 4.01 MG / ML의 415.71 μl를 추가beled 콜라겐. 공기 거품의 형성을 방지 pipetting하여 잘 천천히 섞는다. 산도 테스트 스트립에 믹스의 10 μl를 테스트하여 산도를 확인합니다.
5. TAMRA-콜라겐 유리 바닥 요리 위에 혼합하고 2-5 분 동안 중합을 개시 할 수 있도록 피펫 100 μL 상품 가격이 할인되었습니다. 이 약간 겔 점도를 증가시켜 상체의 침몰을 방지하는 데 도움이됩니다. 100 μL 콜라겐 상품 7 mm의 전형적인 지름 높은 2mm이다.
6. 셀 회전 타원체를 수집하고 깨끗한 페트리 접시에 놓습니다. 액체의 초과를 제거하고 TAMRA-콜라겐 믹스 10 μL에 resuspend을. 이 세포 미디어 콜라겐의 희석을 방지하는 것이 중요합니다.
7. P20 피펫을 사용하여 콜라겐 회전 타원체 중단 수집하고 100 μL TAMRA-콜라겐 믹스 드롭의 상단 중앙에 놓습니다. 참고 :이 침입 및 / 또는 마이그레이션 서로 능력에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 콜라겐 드롭 당 하나 이상의 회전 타원체를 놓지 마십시오.
8. 폴리에 TAMRA-콜라겐 믹스 허용30-45 분 동안 실온에서 merize. 중합 할 때, 콜라겐 화이트 흉내 젤로 바뀝니다. 참고 : 콜라겐 요리를 닫지 않고 중합하도록 허용하면 유리에서 박리 감소, 콜라겐 드롭 주위에 물 필름의 형성을 방지합니다. 준수를 높이기 위해 유리 접시가 100 ㎍ / ㎖에 폴리-L-라이신 코팅 할 수 있습니다.
9. 조심스럽게 콜라겐 / 상체 방울을 커버하기에 충분한 문화 매체를 추가합니다. 콜라겐 상품을 쉽게 분리 할 수​​ 있기 때문에 미디어 또는 갑작스러운 움직임의 높은 플럭스을 피하십시오.
10. 셀이 매트릭스 (일반적으로 1~3일)에 침입 / 마이그레이션하려면 충분한 시간 동안 10 %의 CO ₂ 가습 공기 37 º C에서 보관하십시오.

4. 3D 면역 형광 염색

1. 조심스럽게 전지 매체를 제거하고 PBS로 세포 / 상체를 포함하는 콜라겐 매트릭스를 헹구십시오.
2. 동시에 수정 및 추출 / 고정 버퍼 (4 % PB의 PFA, 0.3 % 트리톤 X-100, 5 % 자당과 잠복기 세포를 추출5 분 S). 2 μM의 Phalloidin의와 뼈대 또는 골격 관련 단백질의 시각화를위한 탁솔 2 μM로 버퍼를 보충합니다.
3. 4 % PFA, 30 분 동안 PBS에서 5 % 자당과 세포를 더 수정합니다. 0.05 % PBS에서 트윈-20와 린스.
4. PBS의 기본 항체 솔루션을 준비합니다. 실온에서 또는 하룻​​밤 º C. 적어도 1 시간 동안 일차 항체와 세포를 배양 전체 콜라겐의 저하를 커버하기에 충분한 솔루션을 추가해야합니다. 35mm 유리 바닥 요리의 경우, 솔루션의 1.5 ML이 필요합니다. 주 : 항체 용액의 부피를 줄이기 위해 같은 실리콘 그리스 나 PDMS 링 써클 라인으로 불용성 장벽, 콜라겐 드롭 주위에 배치 할 수 있습니다.
5. 0.05 % PBS에서 트윈-20과 배 30 분 씻으십시오.
6. 알렉사 - 복합 이차 항체를 PBS의 알렉사 - 복합 phalloidin의와 DAPI 솔루션을 준비합니다. 실온에서 2 시간 동안 적절한 보조 항체와 세포를 품어.
7. 배 3 세척0.05 % PBS에서 트윈-20와 0 분.
8. 액체의 과잉을 제거 유리 바닥 접시 바닥 (약 500 μL)를 채우고 밀봉 상단에 24mm의 coverslip에 배치하는 미디어를 마운트만큼 추가 할 수 있습니다. 콜라겐 드롭을 압축하고 3D 조직의 손상을 방지하기 위해 coverslip을 아래로 누르지 마십시오.

5. 샘플 이미지

클래식이나 회전 디스크 공 촛점 현미경을 사용할 수 있습니다. 역 시스템은 우선적으로 유리 바닥에서 몇 군데 세포의 거리를 결정하는 데 사용되어야한다. 이 작품에 사용 된 시스템은 40X/1.3NA 및 60X/1.4NA 기름 침지 목표 (각각 거리가 200 ㎛ 및 130 μm의, 일), 배광 CoolSNAP HQ2 카메라 1392 X 1040 장착 거꾸로 공 촛점 스피닝 디스크입니다 이미지 배열, 6.45 X 6.45 μm의 픽셀 Metamorph 이미징 소프트웨어에 의해 제어됩니다. 405 nm의 491 nm의 561 nm의 및 633 nm의 레이저는 일반적으로 30 % ~ 50 % 전력에서 사용되는, 1을 획득하고 2 비닝 (binning)X 2 노출 시간을 줄일 수 있습니다. , FITC (당일 478-495, 그들 510-555) 텍사스 레드 (당일 560-580; 현미경은 DAPI (EM 450-465 당일 400-418 nm의)에 대한 수은 램프 및 필터 큐브 장착되어 EM (600) -650) 눈 조각으로 사용할 수 있습니다.

1. 형광등 사용, 콜라겐 드롭의 중간에서 40X 목표를 놓습니다. XY 축과 Z 축 모두에서 샘플의 개요를 얻을. 가장자리 효과를 방지하기 위해 이미지를 획득 할 때 XY 축 젤 가장자리에서 100 개 이상의 μm의 이탈하지 않도록합니다. 때 영상 상체, 그들은 목적 작동 거리의 밑에 있는지 확인하십시오. 필요한 경우 목적을 변경합니다.
2. 공 촛점 라이브 영상 모드로 전환합니다. 콜라겐 섬유가 나타나기 시작하는 Z 값을 결정하는 유리 바닥에서 시작, TAMRA - 라벨 콜라겐을 시각화하기 위해 561 nm의 레이저를 사용하여. 이 기판 바닥이며, Z = 0.
3. 초점 노브를 사용하여, Z = 0 ~ 100 μm의를 이동합니다. Z = 100 μm의에서 세포만을이상은 경질 유리 바닥에서 긴장 효과를 방지하기 위해 몇 군데해야한다.
4. 이미지 셀을 선택합니다. 각 파장에 대한 카메라의 노출 시간과 레이저 파워를 최적화합니다. DAPI와 알렉사 - 488 Phalloidin의에 대한 일반적인 노출 시간은 100 ~ 200 밀리 초 사이입니다. 항체 염색법에 대한 노출 시간이 다를 수 있습니다.
5. 염색 초점 노브를 사용하여 Phalloidin의를 시각화하기 위해 적절한 레이저를 이용하여 공 촛점 라이브 모드에서 전류 상단과 하단의 Z 값을 설정하여 Z 시리즈 간격을 정의합니다.
6. Z-스텝 크기를 정의합니다. 40X 목적을 위해, 1 ㎛를 사용합니다. 60X의 경우, 0.5 μm의를 사용합니다. 획득을 시작합니다.

결과

TAMRA와 쥐 꼬리 콜라겐 I에 레이블을 지정하면 3D 콜라겐 네트워크를 쉽게 준비 및 시각화 할 수 있습니다. 생체 내 ^10에있는 것과 유사한 조직과 콜라겐 네트워크의 형성에 실내 온도 결과에서 느린 중합.

여기에 우리가 상체로 및 단일 세포로 모두 CT26 암 세포의 세포 뼈대의 면역 염색을위한 프로토콜을 제시한다. 더 골격을 유지하려면, 버퍼는 각각 레?...

토론

프로토콜은 찬란 나는 561 nm의 레이저가 장착 된 표준 공 촛점 현미경을 사용하여 콜라겐 네트워크 조직을 쉽게 시각화 할 수 있도록하는 훌륭한 방법을 제공 TAMRA를 사용하여 콜라겐 레이블을 여기에 설명. 반사 공 촛점 현미경에 비해이 기술의 장점은 3D 매트릭스에 깊이 이미지 콜라겐 섬유의 기능입니다. 섬유 반사 강도와 대비 레이저 광 흡수와 산란에 의한 깊이를 실질적으로 감소. 섬유는 영...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
TAMRA, SE	Invitrogen	C-1171
Rat tail Collagen High Concentration	BD Biosciences	354249
Rat tail Collagen	BD Biosciences	354236
Phalloidin	Sigma	P2141
Taxol (Paxitel)	Sigma	T7402
Mouse anti-alpha Tubulin antibody	Sigma	T9026
Alexa 488 Phalloidin	Invitrogen	A12379
Alexa 633 Goat anti-Mouse antibody	Invitrogen	A21052
DAPI	Invitrogen	D1306
Mounting media	Fisher Scientific	106 226 89
Dialysis Cassette	Pierce	66380
Glass bottom dishes	World Precision Instruments	FD35-100
MetaMorph Microscopy Automation & Image Analysis Software	Molecular Devices
Imaris 7.2.3	Bitplane