La revelación de la organización del citoesqueleto de las células de cáncer invasivo en 3D

Resumen

Este artículo presenta un método para etiquetar fluorescencia colágeno que se puede utilizar tanto para fijar aún más y formación de imágenes en vivo de cultivos de células 3D. También ofrecemos un protocolo optimizado para visualizar las proteínas del citoesqueleto endógenas de las células cultivadas en entornos 3D.

Resumen

La migración celular tradicionalmente se ha estudiado en 2D sustratos. Sin embargo, se ha vuelto cada vez más evidente que hay una necesidad de estudiar la migración celular en entornos 3D más apropiadas, que mejor se asemejan a la dimensionalidad de los procesos fisiológicos en cuestión. Células migratorias pueden diferir sustancialmente en su morfología y el modo de la migración en función de si se están moviendo sobre sustratos de 2D o 3D. Debido a dificultades técnicas e incompatibilidades con la mayoría de protocolos estándar, análisis estructural y funcional de las células incrustadas en 3D matrices todavía sigue siendo poco común. Este artículo describe métodos para la preparación y formación de imágenes de cultivos de células de cáncer de 3D, ya sea como células individuales o esferoides. Como un sustrato de ECM apropiada para la migración de células del cáncer, utilizamos nonpepsinized colágeno de cola de rata que polimeriza a temperatura ambiente y la etiqueta fluorescente para facilitar la visualización usando microscopios confocales estándar. Este trabajo también incluye un protocol para el etiquetado de inmunofluorescencia 3D del citoesqueleto celular endógeno. El uso de estos protocolos que esperamos contribuir a una mejor descripción de la composición molecular, localización y funciones de las estructuras celulares en 3D.

Introducción

El campo de la migración de las células ha sido haciendo frente al nuevo mundo tridimensional. Es intuitivo para estudiar la migración de células en un entorno que se asemeja lo más de cerca sus propiedades fisiológicas y, por lo tanto, en tres dimensiones (3D). Sin embargo, debido a limitaciones técnicas, los estudios de migración mayoría de los teléfonos se han realizado análisis de movimiento de la célula a través de sustratos de dos dimensiones (2D) rígidos, bien no tratados o recubiertos con proteínas de la matriz extracelular (ECM apropiados).

Los primeros estudios dedicados a la migración de células en tres dimensiones celosías colágeno se remontan más de 20 años ^1-3. Sin embargo, sólo en los últimos 5 años se ha hecho evidente que las células migratorias podrían diferir sustancialmente en su morfología y el modo de la migración en función de la dimensionalidad del sustrato. En 2D, las células sólo en contacto con el sustrato con su superficie ventral utilizando adhesiones focales, lo que resulta en la formación de protuberancias planas grandes (lamelipodios) conprotuberancias en forma de dedos incrustados (filopodios) en su borde delantero. Estas estructuras, junto con las fibras de estrés que conectan la parte delantera de células al borde de salida, se cree que son cruciales para el movimiento celular en 2D. En las matrices en 3D, las células son generalmente más alargada, con toda la superficie de la célula en contacto con el ECM, causando cambios considerables en la formación y la relevancia funcional de muchas de estas estructuras. Por el contrario, otras características celulares ganan relevancia en la migración 3D, tales como la deformación nuclear y estructuras implicadas en la remodelación de ECM ^4.

A pesar de estas alteraciones morfológicas conocidos, así como las diferencias en los modos de migración ^5-7, que pueden variar dependiendo de la ECM y tipos de células, análisis estructural y funcional de las células embebidas dentro de las matrices 3D sigue siendo inusual. Trabajar con gruesas y densas matrices 3D lleva dificultades técnicas, como las imágenes de microscopía de alta resolución e incompatibilidades con la mayoría staprotocolos ndard optimizado para los cultivos en 2D, como el etiquetado de inmunofluorescencia de las proteínas endógenas. También, debido a que el uso de matrices 3D es un enfoque relativamente nuevo, los investigadores todavía están investigando las mejores condiciones para parecerse estrechamente específico en situaciones in vivo, tales como la arquitectura del estroma normal de los diferentes órganos de tejidos o la organización de ECM alrededor de un tumor. Las discrepancias en los resultados de los diferentes grupos en relación, por ejemplo, los modos de células de cáncer de la migración o la existencia de adherencias focales, han generado cierta controversia ^8. Un gran esfuerzo se ha dedicado recientemente a llegar a un consenso en cuanto a ECM naturaleza química, tamaño de poro, el grosor de la fibra, y la matriz de rigidez. Actualmente se utilizan muchos tipos diferentes de ECMs 3D, variando de matrices derivadas de células de matrigel disponible en el mercado, el colágeno bovino pepsinado I, o nonpepsinized cola de rata colágeno I. Cada una de estas matrices tiene propiedades físicas y químicas específicas y hay que relate la matriz de elección para el proceso fisiológico en estudio. Además, el tamaño y espesor de fibra de poro puede depender de las condiciones de polimerización, tales como el pH y la temperatura de ^9,10. La unión a y la distancia a partir de sustratos rígidos como el vidrio, también puede cambiar las propiedades elásticas de la matriz de ^10,11.

Este artículo describe métodos para la preparación y formación de imágenes de cultivos de células de cáncer de 3D, ya sea como células individuales o esferoides. Se han descrito previamente métodos para preparar esferoides celulares de cáncer, los más populares son el método de la gota colgante ^12,13 y el método de la placa de agarosa-revestido ^14. Como un sustrato de ECM apropiada para la migración de células del cáncer, nonpepsinized colágeno de cola de rata que polimeriza a temperatura ambiente se utiliza en 2 mg / ml. Nonpepsinized colágeno extraídas con ácido I a partir de la cola de rata retiene ambos N-y C-terminal de telopéptidos, partes no helicoidales de la molécula de colágeno responsables de colágeno nativo intermoleccular reticulación y la estabilidad fibrilar ^15. En conjunto, estas condiciones permiten la formación de redes de colágeno que más se parecen mucho a los observados in vivo ^10. Para permitir la visualización de las fibras de colágeno, tanto en cultivos fijados y de vida, se proporciona un protocolo detallado para etiquetar fluorescencia colágeno in vitro ¹⁰ usando 5 - (y-6)-carboxitetrametilrodamina (TAMRA), éster de succinimidilo. Este protocolo ha sido adaptado de Baici et al. ^16,17, donde se utiliza isotiocianato de fluoresceína para etiquetar moléculas de colágeno solubles. Como fluoresceína, TAMRA es un colorante fluorescente amino-reactivo que reacciona con grupos amino alifáticos nonprotonated de proteínas, tales como el grupo amino libre en el extremo N-terminal y, más importante, el grupo amino de lisinas lado. Esta reacción sólo se produce a pH básico, cuando el grupo amino de la lisina está en la forma nonprotonated. Además de TAMRA ser más estable que fluoresceína sobretiempo, sus espectros de emisión se halla en la gama de color naranja / rojo (ex / em = 555/518 nm), lo que puede ser ventajoso combinar para imágenes de células vivas de las proteínas GFP-etiquetados. Uso de colágeno moléculas marcadas con colorantes solubles amino-reactivos no afecta el proceso de polimerización ni la densidad, tamaño de poro y el estado de la reticulación de la matriz de colágeno ^10,16,18,19.

Este protocolo también incluye un método para el etiquetado de inmunofluorescencia 3D de las proteínas endógenas, que se ha optimizado para etiquetar el citoesqueleto o proteínas asociadas citoesqueleto. El enfoque final de este protocolo es sobre los métodos para adquirir imágenes de alta resolución de las culturas 3D mediante microscopía confocal con un menor aporte de cubreobjetos de vidrio rígidos de la tensión matriz de colágeno.

Protocolo

1. TAMRA-colágeno I Etiquetado

1. Preparar a 10 mg / ml solución TAMRA añadiendo 2,5 ml de DMSO al 25 mg polvo suministrado TAMRA. Disolver que por agitación hasta disolución completa. Almacenar a -20 º C y protegido de la luz.
2. Prepare 2 L de Etiquetado Buffer (0,25 M _NaHCO3 0,4 M NaCl). Ajustar el pH a 9,5 utilizando solución 10 M de NaOH. Conservar a 4 º C. A partir de este momento, todas las operaciones se llevan a cabo a 4 º C menos que el material de otro modo indicado y fluorescentes se protegió de la luz con papel de aluminio.
3. Llene una jeringa desechable de 1 ml con 1 ml de la alta concentración de colágeno de cola de rata solución que yo. Soluciones de colágeno de alta concentración se proporcionan típicamente a concentraciones alrededor de 10 mg / ml y son muy viscoso. Asegúrese de manipular lentamente para evitar la formación de burbujas de aire.
4. Con un G aguja hipodérmica 21, inyectar el colágeno en un casete de diálisis 3 ml presoaked de 10.000 MWCO cortada. Tenga cuidado para evitar damaging la membrana con la aguja. Extraiga todo el aire del cassette de diálisis tirando hacia arriba del émbolo de la jeringa. Dializar durante la noche frente a 1 L de tampón de Etiquetado.
5. Mezclar 100 l de 10 mg / ml de solución de TAMRA con 900 l de tampón de Etiquetado. Nota: Esto debe hacerse tanto con solución TAMRA y Buffer Etiquetado a temperatura ambiente ya DMSO se congela a 4 º C. Después de mezclar, llevar la solución TAMRA diluida de nuevo a 4 º C.
6. Retire con cuidado el colágeno de la casete de diálisis con una jeringa desechable de 2 ml con una G aguja hipodérmica 21. Mezclar 1 ml de la solución de colágeno dializada con 1 ml de solución diluida TAMRA por pipeteado.
7. Transferir el colágeno / TAMRA mezcla en un tubo de microcentrífuga de 2 ml y se incuba durante la noche con rotación.
8. Transferir el 2 ml de colágeno marcado con TAMRA en un casete de diálisis presoaked 3 ml y se dializa durante la noche contra 1 L de tampón de Etiquetado para eliminar el exceso de colorante libre.
9. Para restaurar el TAMRA-laboratorioELED colágeno a la solución original de colágeno, colocar el casete de diálisis en 1 l de 0,2% (v / v) de ácido acético, pH 4, y dializa durante la noche.
10. Medir el volumen final del colágeno marcado con TAMRA y calcular su concentración final, teniendo en cuenta el volumen inicial y la concentración de la solución de colágeno utilizado. Conservar a 4 º C.

2. 3D TAMRA-colágeno matrices con células individuales integrados

1. Calcular el volumen de 2 mg / ml Mezclar TAMRA-colágeno necesario para el experimento. Siempre prepare 20% más para dar cuenta de pipeteado pérdidas debido a la alta viscosidad de colágeno.
2. Preparar una solución madre de PBS 10x y NaOH 1. Filtrar a esterilizar y mantener a 4 º C. A partir de este punto, todas las operaciones se llevan a cabo en hielo a menos que se indique lo contrario y en condiciones estériles.
3. Mezclar 10x PBS y NaOH 1 N en volúmenes apropiados para conseguir la concentración deseada de colágeno y pH 7,4. Por ejemplo, para un volumen final de 1 mlde TAMRA-Colágeno mezcla a pH 7,4, se combinan 100 l de 10x PBS con 5 l de NaOH 1N. Mezclar bien.
4. Añadir los volúmenes apropiados de tanto colágeno marcado con TAMRA y ​​colágeno no marcado en una relación de 01:06 para lograr una concentración de colágeno total final de 2 mg / ml. Por ejemplo, para un volumen final de 1 ml de 2 mg / ml de colágeno TAMRA-mezcla, añadir 90,48 l de 3,68 mg / ml de colágeno marcado con TAMRA y 415,71 l de 4,01 mg / ml de colágeno no marcado. Mezclar bien y poco a poco con la pipeta, evitando la formación de burbujas de aire.
5. Añadir las células suspendidas en el volumen apropiado de medio de células refrigeradas sin FBS a la mezcla TAMRA-colágeno para obtener una densidad celular final de 10 ⁵ células / ml y una concentración de colágeno final de 2 mg / ml. Por ejemplo, para 1 ml de 2 mg / ml de colágeno TAMRA-mezcla, añadir 388,81 l de medio que contiene 10 células ^5. Mezclar bien y poco a poco con la pipeta, evitando la formación de burbujas de aire. Confirmar pH probando 10 l de la mezcla en una prueba de pH sviaje.
6. Pipetear 100 L gotas de TAMRA-Colágeno mezcla en placas con fondo de cristal y deje que se polimeriza a temperatura ambiente durante 30 a 45 min. 100 gotas de colágeno l tienen un diámetro típico de 7 mm y 2 mm de altura son. Cuando se polimeriza, el colágeno se convierte en un gel blanquecino. Nota: Permitir que el colágeno para polimerizar sin cerrar el plato va a evitar la formación de una película de agua alrededor de la gota de colágeno, la reducción de la separación del vidrio. Para aumentar la adherencia, platos de vidrio pueden estar recubiertas con poli-L-lisina en 100 g / ml.
7. Añadir con cuidado suficiente medio de cultivo para cubrir las gotas de colágeno / célula. Evite los altos flujos de medios de comunicación o los movimientos bruscos ya que las gotas de colágeno pueden desprenderse con facilidad. Sigue a 37 º C en _CO2 al 10% de aire humidificado durante el tiempo suficiente para que las células migran en la matriz (normalmente 1-3 días).

3. 3D TAMRA-colágeno matrices con esferoides celulares integrados

1. Calcular el volumen de 2 mg / ml de colágeno TAMRA-Mix necesario para el experimento. Siempre prepare 20% más para dar cuenta de pipeteado pérdidas debido a la alta viscosidad de colágeno.
2. Preparar una solución madre de PBS 10x y NaOH 1. Filtrar a esterilizar y mantener a 4 º C. A partir de este punto, todas las operaciones se llevan a cabo en hielo a menos que se indique lo contrario y en condiciones estériles.
3. Mezclar 10x PBS, NaOH 1 N y medios de células sin FBS en volúmenes apropiados para lograr la concentración de colágeno deseado y pH 7,4. Por ejemplo, para un volumen final de 1 ml de TAMRA-colágeno mezcla a pH 7,4, combinar 100 l de PBS 10x, 5 l de NaOH 1 N y 388,81 l de los medios de comunicación. Mezclar bien.
4. Añadir los volúmenes apropiados de tanto colágeno marcado con TAMRA y ​​colágeno no marcado en una relación de 01:06 para lograr una concentración de colágeno total final de 2 mg / ml. Por ejemplo, para un volumen final de 1 ml de 2 mg / ml de colágeno TAMRA-mezcla, añadir 90,48 l de 3,68 mg / ml de colágeno marcado con TAMRA y 415,71 l de 4,01 mg / ml de UNLAcolágeno beled. Mezclar bien y poco a poco con la pipeta, evitando la formación de burbujas de aire. Confirmar pH mediante pruebas de 10 l de la mezcla sobre una tira de prueba de pH.
5. Pipetear 100 L gotas de TAMRA-Colágeno mezcla en placas con fondo de cristal y deje que se inicie la polimerización durante 2-5 min. Esto ayudará a prevenir el hundimiento de los esferoides por un ligero aumento de la viscosidad del gel. 100 gotas de colágeno l tienen un diámetro típico de 7 mm y 2 mm de altura son.
6. Recoge un esferoide de células y colocarlo en una placa de Petri limpia. Retire el exceso de líquido y volver a suspender en 10 l de TAMRA-Colágeno Mix. Esto es importante para evitar la dilución del colágeno con medio celular.
7. Con una pipeta P20, recoger el colágeno suspendido esferoide y colóquelo en la parte superior central de la 100 l TAMRA-Colágeno caída Mix. Nota: No coloque más de un esferoide por gota de colágeno, ya que pueden afectar a los demás la capacidad de invadir y / o migrar.
8. Deje que la mezcla TAMRA-colágeno a poliMérize a temperatura ambiente durante 30-45 min. Cuando se polimeriza, el colágeno se convierte en un gel blanquecino. Nota: Permitir que el colágeno para polimerizar sin cerrar el plato va a evitar la formación de una película de agua alrededor de la gota de colágeno, la reducción de la separación del vidrio. Para aumentar la adherencia, platos de vidrio pueden estar recubiertas con poli-L-lisina en 100 g / ml.
9. Añadir con cuidado suficiente medio de cultivo para cubrir el colágeno / esferoides gotas. Evite los altos flujos de medios de comunicación o los movimientos bruscos ya que las gotas de colágeno pueden desprenderse con facilidad.
10. Sigue a 37 º C en _CO2 al 10% de aire humidificado durante el tiempo suficiente para que las células invaden / migran en la matriz (normalmente 1-3 días).

4. La tinción de inmunofluorescencia 3D

1. Retire con cuidado los medios celulares y aclarar las matrices de colágeno que contienen células / esferoides con PBS.
2. Simultáneamente fijar y extraer las células por incubación con tampón de extracción / fijación (PFA al 4%, 0,3% de Triton X-100, 5% de sacarosa en PBS) durante 5 min. Complementar el buffer con 2 mM faloidina y 2 mM Taxol para la visualización de citoesqueleto o proteínas del citoesqueleto asociados.
3. Además fijar las células con PFA al 4%, 5% de sacarosa en PBS durante 30 min. Enjuague con 0,05% de Tween-20 en PBS.
4. Preparar soluciones de anticuerpos primarios en PBS. Se incuban las células con anticuerpos primarios durante al menos 1 hora a temperatura ambiente o durante la noche a 4 º C. Asegúrese de añadir solución suficiente para cubrir toda la caída de colágeno. Para un plato de 35 mm de fondo de cristal, será necesario 1,5-2 ml de solución. Nota: Para reducir el volumen de la solución de anticuerpo, una barrera insoluble en agua, tal como una línea circular de grasa de silicona o un anillo de PDMS, puede ser colocado alrededor de la gota de colágeno.
5. Lavar 3x 30 min con 0,05% de Tween-20 en PBS.
6. Preparar anticuerpos secundarios conjugados con Alexa, Alexa-conjugado phalloidin y soluciones de DAPI en PBS. Se incuban las células con los anticuerpos secundarios apropiados para 2 horas a temperatura ambiente.
7. Lave 3x 30 min con 0,05% de Tween-20 en PBS.
8. Eliminar el exceso de líquido, añadir una cantidad suficiente de medios de montaje para cubrir la parte inferior inferior plato de vidrio (aprox. 500 l) y colocar un cubreobjetos de 24 mm en la parte superior para sellar. No presione el cubreobjetos para evitar la compresión de la caída de colágeno y daños en la organización 3D.

5. Imágenes de muestra

Microscopios confocal de disco giratorio clásico o pueden ser utilizados. Un sistema invertida preferentemente se debe utilizar para determinar la distancia de las células con imagen de la parte inferior de vidrio. El sistema utilizado para este trabajo es un disco giratorio confocal invertido equipado con una 40X/1.3NA y un 60X/1.4NA objetivos de inmersión en aceite (trabajando distancias 200 micras y 130 micras, respectivamente), una cámara CoolSNAP HQ2 Fotometría, 1392 x 1040 conjunto de imágenes, 6,45 x 6,45 píxeles micras y controlados por el software de imágenes Metamorph. 405 nm, 491 nm, 561 nm y 633 nm láser se utilizan normalmente en poder de 30 a 50%, el aumento de 1 y 2 de hurgar en la basurax 2 para reducir los tiempos de exposición. El microscopio está equipado con una lámpara de Hg y cubos de filtros de DAPI (EXC 400 a 418 nm, em 450 a 465), FITC (exc 478-495; em 510-555) y Texas Red (SIN 560-580, 600 em -650) para usar con el ocular.

1. Uso de la lámpara fluorescente, colocar el objetivo 40X en el medio de la caída de colágeno. Obtener una visión general de la muestra, tanto en el eje xy y en el eje z. Asegúrese de que no se desvíe más de 100 m desde el borde de gel en el eje xy en la adquisición de las imágenes para evitar los efectos de borde. Cuando esferoides de imagen, asegúrese de que estén de acuerdo con la distancia de trabajo objetivo. Cambie objetivo en su caso.
2. Seleccione el modo de imágenes en directo confocal. Al utilizar el láser de 561 nm para visualizar el colágeno marcado con TAMRA, a partir de la parte inferior de vidrio determinar el valor de z en el que las fibras de colágeno comienzan a aparecer. Esta es la parte inferior sustrato y z = 0.
3. Utilizando el botón de enfoque, sube 100 m de z = 0. Sólo las células en z = 100 micraso más, deben ser reflejados para evitar los efectos de tensión de la parte inferior de vidrio rígida.
4. Seleccione las celdas a la imagen. Optimizar los tiempos de exposición de la cámara y la potencia del láser para cada longitud de onda. Tiempos de exposición típicos para DAPI y Alexa 488 faloidina-son entre 100-200 mseg. Los tiempos de exposición para la tinción de anticuerpos pueden variar.
5. En el modo en vivo confocal utilizando el láser adecuado para visualizar el phalloidin tinción y utilizar el botón de enfoque, definir el intervalo de serie z estableciendo superior e inferior de los valores z de corriente.
6. Definir el tamaño z-paso. Para los objetivos de 40X, utilice 1 m. Para 60X, utilice 0,5 micras. Inicio adquisición.

Resultados

Etiquetado de colágeno de cola de rata I con TAMRA permite una fácil preparación y la visualización de las redes de colágeno en 3D. Polimerización lenta en resultados temperatura ambiente en la formación de redes de colágeno con la organización comparables a los encontrados in vivo ^10.

Aquí se presenta un protocolo para la tinción de inmunofluorescencia del citoesqueleto de las células CT26 cáncer, tanto como esferoides y como células individuales. Para pres...

Discusión

El protocolo que se describe aquí para etiquetar fluorescencia colágeno I usando TAMRA proporciona un método excelente para permitir la fácil visualización de la organización de la red de colágeno, mediante el uso de un microscopio confocal estándar equipado con un láser de 561 nm. Una ventaja de esta técnica en comparación con microscopía confocal de reflectancia es la capacidad de las fibras de colágeno imagen más profundas dentro de la matriz 3D. La intensidad y el contraste de la reflexión fibras dism...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
TAMRA, SE	Invitrogen	C-1171
Rat tail Collagen High Concentration	BD Biosciences	354249
Rat tail Collagen	BD Biosciences	354236
Phalloidin	Sigma	P2141
Taxol (Paxitel)	Sigma	T7402
Mouse anti-alpha Tubulin antibody	Sigma	T9026
Alexa 488 Phalloidin	Invitrogen	A12379
Alexa 633 Goat anti-Mouse antibody	Invitrogen	A21052
DAPI	Invitrogen	D1306
Mounting media	Fisher Scientific	106 226 89
Dialysis Cassette	Pierce	66380
Glass bottom dishes	World Precision Instruments	FD35-100
MetaMorph Microscopy Automation & Image Analysis Software	Molecular Devices
Imaris 7.2.3	Bitplane