Rivelare l'organizzazione del citoscheletro delle cellule tumorali invasive in 3D

Riepilogo

Questo articolo presenta un metodo per etichettare fluorescently collagene che può essere ulteriormente utilizzato sia per correzione e di imaging vivo di colture cellulari 3D. Forniamo anche un protocollo ottimizzato per visualizzare endogene proteine ​​del citoscheletro delle cellule coltivate in ambienti 3D.

Abstract

La migrazione cellulare è stato tradizionalmente studiato in substrati 2D. Tuttavia, è diventato sempre più evidente che vi è la necessità di studiare la migrazione delle cellule in più appropriati ambienti 3D, che meglio ricordano la dimensionalità dei processi fisiologici in questione. Cellule migratorie possono sostanzialmente differire nella loro morfologia e modalità di migrazione a seconda che si stanno muovendo su substrati in 2D o 3D. A causa di difficoltà tecniche e le incompatibilità con i protocolli più standard, analisi strutturale e funzionale delle cellule incorporati all'interno di matrici 3D rimane ancora raro. Questo articolo descrive i metodi per la preparazione e l'imaging di colture di cellule tumorali in 3D, sia come singole cellule o sferoidi. Come un substrato ECM appropriata per la migrazione delle cellule del cancro, usiamo nonpepsinized coda di ratto collagene I polimerizzato a temperatura ambiente e fluorescente per facilitare la visualizzazione usando microscopi confocale standard. Questo lavoro include anche un protocolo per l'etichettatura immunofluorescenza 3D del citoscheletro delle cellule endogene. L'utilizzo di questi protocolli speriamo di contribuire ad una migliore descrizione della composizione molecolare, localizzazione e funzioni delle strutture cellulari in 3D.

Introduzione

Il campo della migrazione delle cellule è stato sfidando nel nuovo mondo tridimensionale del marchio. È intuitivo studiare la migrazione delle cellule in un ambiente che più assomiglia quelle fisiologiche e, pertanto, tridimensionale (3D). Tuttavia, a causa di limitazioni tecniche, studi di migrazione più cellule sono state fatte analizzando movimento cellulare attraverso substrati bidimensionali (2D) rigidi, sia non trattati o rivestiti con adeguate proteine ​​della matrice extracellulare (ECM).

I primi studi dedicati alla migrazione delle cellule in tre reticoli di collagene tridimensionali risalgono ad oltre 20 anni ^1-3. Tuttavia, solo negli ultimi 5 anni è diventato chiaro che cellule migranti potrebbero sostanzialmente differire nella loro morfologia e modalità di migrazione seconda della dimensionalità del substrato. In 2D, cellule solo contatto il substrato con la loro superficie ventrale utilizzando adesioni focali, causando la formazione di sporgenze piatte larghe (lamellipodi) conincorporati sporgenze simili a dita (filopodia) al loro bordo. Queste strutture, insieme a fibre di stress che collegano la parte anteriore cella al bordo di uscita, sono da ritenersi cruciale per il movimento delle cellule in 2D. In matrici 3D, le cellule sono generalmente più allungata, con l'intera superficie cellulare contattare la ECM, causando notevoli cambiamenti nella formazione e la rilevanza funzionale di molte di queste strutture. Al contrario, le altre caratteristiche cellulari guadagnare rilevanza nella migrazione 3D, come ad esempio la deformazione nucleare e strutture coinvolte nel rimodellamento ^4.

Nonostante queste note alterazioni morfologiche, così come le differenze di modalità di migrazione ^5-7, che possono variare a seconda della ECM e tipi di cellule, analisi strutturale e funzionale delle cellule incorporati all'interno di matrici 3D rimane ancora inusuale. Lavorare con spesse e dense matrici 3D trasporta difficoltà tecniche, come ad esempio ad alta risoluzione di immagini di microscopia, e le incompatibilità con la maggior parte staprotocolli ndard ottimizzati per le culture in 2D, come l'etichettatura immunofluorescenza di proteine ​​endogene. Inoltre, poiché l'uso di matrici 3D è un approccio relativamente nuovo, i ricercatori stanno ancora studiando le migliori condizioni per assomigliare specifico in situazioni in vivo, come la normale architettura stromale di organi diversi tessuti o l'organizzazione ECM attorno a un tumore. Discrepanze nei risultati per i diversi gruppi riguardanti, ad esempio, le modalità di cellule di cancro della migrazione o l'esistenza di adesioni focali, hanno generato qualche polemica ^8. Un grande sforzo è stato recentemente dedicato a raggiungere un consenso in termini di ECM chimica natura, dimensione dei pori, lo spessore delle fibre, e matrice di rigidezza. Molti diversi tipi di ECM 3D sono attualmente utilizzati, che variano da cellule matrici derivate per disponibile in commercio matrigel, pepsinized collagene bovino io, o nonpepsinized ratto coda di collagene I. Ciascuna di queste matrici ha specifiche proprietà fisiche e chimiche e uno ha bisogno di relate la matrice di scelta per il processo fisiologico in fase di studio. Inoltre, le dimensioni e la fibra spessore pori può dipendere da condizioni di polimerizzazione, quali pH e temperatura ^9,10. Legandosi e distanza da supporti rigidi quali vetro, può anche modificare le proprietà elastiche della matrice ^10,11.

Questo articolo descrive i metodi per la preparazione e l'imaging di colture di cellule tumorali in 3D, sia come singole cellule o sferoidi. Metodi per rendere sferoidi di cellule di cancro sono stati precedentemente descritti, i più diffusi sono il metodo della goccia pendente ^12,13 e il metodo della piastra di agarosio rivestita ^14. Come substrato ECM appropriata per la migrazione delle cellule del cancro, nonpepsinized coda di ratto collagene I polimerizzate a temperatura ambiente viene utilizzato a 2 mg / ml. Nonpepsinized collagene estratte con acido, io dalla coda di ratto mantiene entrambe le C-terminale N-e telopeptide, porzioni nonhelical della molecola di collagene responsabili di collagene nativo intermolecreticolazione lare e stabilità fibrilar ^15. Insieme, queste condizioni consentono la formazione di reti di collagene che la maggior parte sono molto simili a quelli osservati in vivo ^10. Per permettere la visualizzazione delle fibre collagene, sia in culture fisse e vivente, un protocollo dettagliato è fornito per etichettare fluorescently collagene in vitro ¹⁰ usando 5 - (e-6)-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA), succinimmidil estere. Questo protocollo è stato adattato da Baici et al. ^16,17, dove fluoresceina isotiocianato viene utilizzato per etichettare molecole di collagene solubili. Come fluoresceina, TAMRA è un colorante fluorescente amino-reattivo che reagisce con nonprotonated alifatici gruppi amminici delle proteine, come gruppo ammino libero al terminale N e, soprattutto, il lato gruppo amminico di lisine. Questa reazione si verifica solo a pH basico, quando il gruppo amminico della lisina è in forma nonprotonated. Oltre a TAMRA essere più stabile di fluoresceina sopratempo, il suo spettro di emissione cade sul campo di colore arancione / rosso (ex / em = 555/518 nm), che possono essere utilmente combinati per l'imaging cellulare dal vivo di proteine ​​GFP-tagged. Utilizzando collagene molecole marcate con coloranti solubili ammino-reattivi non influenza il processo di polimerizzazione, né la densità, dimensione dei pori e lo stato reticolazione della matrice di collagene ^10,16,18,19.

Questo protocollo include anche un metodo per l'etichettatura immunofluorescenza 3D di proteine ​​endogene, che è stato ulteriormente ottimizzato per etichettare il citoscheletro o proteine ​​associate citoscheletro. L'obiettivo finale di questo protocollo è sui metodi per acquisire immagini ad alta risoluzione delle culture 3D utilizzando la microscopia confocale a ridotto apporto di vetrini rigidi sulla tensione matrice di collagene.

Protocollo

1. TAMRA-collagene I Etichettatura

1. Preparare a 10 mg / ml soluzione TAMRA con l'aggiunta di 2,5 ml di DMSO a quello in dotazione 25 mg TAMRA polvere. Sciogliere nel vortex fino a completa dissoluzione. Conservare a -20 ° C e al riparo dalla luce.
2. Preparare 2 L di Labeling Buffer (0,25 M _NaHCO3, 0,4 M di NaCl). Regolare il pH a 9,5 con soluzione 10 M di NaOH. Conservare a 4 ° C. Da questo punto, tutte le operazioni sono effettuate a 4 º C se non diversamente indicato e materiale fluorescente è protetta dalla luce con un foglio di alluminio.
3. Riempire una siringa monouso 1 ml con 1 ml di altamente concentrato coda di ratto collagene I soluzione. Soluzioni ad alta concentrazione di collagene sono tipicamente forniti a concentrazioni circa 10 mg / ml e sono molto viscoso. Assicurati di manipolarla lentamente per evitare la formazione di bolle d'aria.
4. Utilizzando un ago G 21 ipodermico, iniettare il collagene in un ammollo 3 ml cassetta dialisi di 10.000 MWCO tagliata. Usare cautela per evitare damastituito la membrana con l'ago. Rimuovere tutta l'aria dalla cassetta dialisi sollevando il pistone della siringa. Dializzare durante la notte contro 1 L di Labeling Buffer.
5. Mescolare 100 ml di 10 mg / ml soluzione TAMRA con 900 ml di Labeling Buffer. Nota: Questo dovrebbe essere fatto sia con soluzione TAMRA e Labeling tampone a temperatura ambiente da DMSO congela a 4 ° C. Dopo la miscelazione, portare la soluzione diluita TAMRA torna a 4 ° C.
6. Rimuovere con attenzione il collagene dalla cassetta dialisi utilizzando una siringa monouso da 2 ml con un ago G 21 ipodermico. Miscelare 1 ml della soluzione di collagene dializzata con 1 ml di soluzione diluita TAMRA pipettando.
7. Trasferire il collagene / TAMRA miscela in una provetta da 2 ml ed incubare una notte con la rotazione.
8. Trasferire il 2 ml di collagene TAMRA marcato in un 3 ml cassetta dialisi ammollo e Dializzare overnight contro 1 L di tampone Labeling per rimuovere l'eccesso di colorante libero.
9. Per ripristinare il TAMRA-labcollagene eLED alla soluzione originale collagene, posizionare la cassetta dialisi in 1 L di 0,2% (v / v) di acido acetico, pH 4, e dializza overnight.
10. Misurare il volume finale del collagene TAMRA marcato e calcolare la sua concentrazione finale, considerando il volume iniziale e la concentrazione della soluzione utilizzata collagene. Conservare a 4 ° C.

2. 3D Matrici TAMRA-collagene con impliciti singole cellule

1. Calcolare il volume di 2 mg / ml TAMRA-Collagene Mix necessaria per l'esperimento. Sempre preparare 20% in più per tenere conto di pipettaggio perdite dovute alla elevata viscosità collagene.
2. Preparare una soluzione stock di 10x PBS e 1 N NaOH. Filtro-sterilizzare e conservare a 4 ° C. Da questo punto, tutte le operazioni sono effettuate su ghiaccio salvo diversa indicazione e in condizioni sterili.
3. Mescolare 10x PBS e 1 N NaOH in volumi adeguati per raggiungere la concentrazione di collagene desiderato e pH 7.4. Ad esempio, per un volume finale di 1 mldi Tamra-Collagene Mix a pH 7,4, unire 100 ml di PBS 10X con 5 ml di NaOH 1N. Mescolare bene.
4. Aggiungere i volumi appropriati di collagene TAMRA-marcato e non marcato collagene in un rapporto di 01:06 per ottenere una concentrazione finale di collagene totale di 2 mg / ml. Ad esempio, per un volume finale di 1 ml di 2 mg / ml TAMRA-Collagene Mix, aggiungere 90,48 ml di 3,68 mg / ml di collagene TAMRA-marcato e 415,71 ml di 4,01 mg / ml di collagene non marcato. Mescolare bene e lentamente da pipettaggio, evitando la formazione di bolle d'aria.
5. Aggiungere cellule sospese nel volume appropriato di medie cella refrigerata senza FBS al TAMRA-Collagene Mix per ottenere una densità cellulare finale di 10 ⁵ cellule / ml e una concentrazione finale di collagene di 2 mg / ml. Per esempio, per 1 ml di 2 mg / ml TAMRA-Collagene Mix, aggiungere 388,81 ml di supporto contenente 10 ⁵ cellule. Mescolare bene e lentamente da pipettaggio, evitando la formazione di bolle d'aria. Confermare pH testando 10 microlitri della miscela su un test del pH sviaggio.
6. Aggiungere 100 microlitri gocce di Tamra-Collagene impasto sul fondo di vetro piatti e lasciare polimerizzare a temperatura ambiente per 30-45 minuti. 100 gocce microlitri collagene hanno un diametro tipico di 7 mm e sono 2 mm. Quando polimerizzato, il collagene si trasforma in un gel biancastro. Nota: Permettendo al collagene per polimerizzare senza chiudere il piatto eviterà la formazione di una pellicola d'acqua attorno alla goccia collagene, riducendo il distacco dal vetro. Per aumentare l'aderenza, vetro piatti possono essere rivestiti con poli-L-lisina a 100 pg / ml.
7. Aggiungere con cautela sufficiente terreno di coltura per coprire i collagene / cella gocce. Evitare di elevati flussi di media o movimenti bruschi in quanto gocce di collagene possono facilmente staccare. Mantenere a 37 ° C in 10% di CO ₂ dell'aria umidificata per un tempo sufficiente per le cellule di migrare nella matrice (in genere 1-3 giorni).

3. 3D Matrici TAMRA-collagene con sferoidi cellulari embedded

1. Calcolare il volume di 2 mg / ml TAMRA-Collagen Mix necessario per l'esperimento. Sempre preparare 20% in più per tenere conto di pipettaggio perdite dovute alla elevata viscosità collagene.
2. Preparare una soluzione stock di 10x PBS e 1 N NaOH. Filtro-sterilizzare e conservare a 4 ° C. Da questo punto, tutte le operazioni sono effettuate su ghiaccio salvo diversa indicazione e in condizioni sterili.
3. Mescolare 10x PBS, 1 N NaOH e supporti cellulari senza FBS in volumi adeguati per raggiungere la concentrazione di collagene desiderato e pH 7.4. Ad esempio, per un volume finale di 1 ml di collagene-TAMRA Mix a pH 7,4, 100 pl di combinare 10x PBS, 5 ml di NaOH 1 N e 388,81 ml di media. Mescolare bene.
4. Aggiungere i volumi appropriati di collagene TAMRA-marcato e non marcato collagene in un rapporto di 01:06 per ottenere una concentrazione finale di collagene totale di 2 mg / ml. Ad esempio, per un volume finale di 1 ml di 2 mg / ml TAMRA-Collagene Mix, aggiungere 90,48 ml di 3,68 mg / ml di collagene TAMRA-marcato e 415,71 ml di 4,01 mg / ml di unlacollagene Beled. Mescolare bene e lentamente da pipettaggio, evitando la formazione di bolle d'aria. Confermare pH testando 10 microlitri della miscela su una striscia di test del pH.
5. Aggiungere 100 microlitri gocce di Tamra-Collagene impasto sul fondo di vetro piatti e lasciarlo per iniziare la polimerizzazione per 2-5 min. Questo aiuterà a prevenire affondamento degli sferoidi, aumentando leggermente la viscosità del gel. 100 gocce microlitri collagene hanno un diametro tipico di 7 mm e sono 2 mm.
6. Raccogliere uno sferoide cella e metterlo su un piatto pulito Petri. Rimuovere ogni eccesso di liquido e risospendere in 10 ml di Tamra-Collagene Mix. Questo è importante per evitare la diluizione del collagene con supporti cellulari.
7. Usando una pipetta P20, raccogliere il collagene sospeso sferoide e collocarlo sulla parte superiore centrale di 100 l TAMRA-Collagene goccia del Mix. Nota: Non inserire più di una sferoide per goccia di collagene, dal momento che possono influenzare l'un l'altro la capacità di invadere e / o migrare.
8. Lasciare che il TAMRA-Collagene Mix di poliMerize a temperatura ambiente per 30-45 min. Quando polimerizzato, il collagene si trasforma in un gel biancastro. Nota: Permettendo al collagene per polimerizzare senza chiudere il piatto eviterà la formazione di una pellicola d'acqua attorno alla goccia collagene, riducendo il distacco dal vetro. Per aumentare l'aderenza, vetro piatti possono essere rivestiti con poli-L-lisina a 100 pg / ml.
9. Aggiungere con cautela sufficiente terreno di coltura per coprire il collagene / sferoidi gocce. Evitare di elevati flussi di media o movimenti bruschi in quanto gocce di collagene possono facilmente staccare.
10. Conservare a 37 ° C in 10% di CO ₂ aria umidificata per un tempo sufficiente per le cellule di invadere / migrare nella matrice (in genere 1-3 giorni).

4. 3D immunofluorescenza

1. Rimuovere delicatamente il supporto di cellule e lavare le matrici di collagene contenenti cellule / sferoidi con PBS.
2. Simultaneamente fissare e estrarre cellule mediante incubazione con estrazione / fissaggio tampone (PFA 4%, 0,3% Triton X-100, 5% di saccarosio in PBS) per 5 min. Supplemento il buffer con 2 mM falloidina e 2 mM Taxol per la visualizzazione di citoscheletro o proteine ​​del citoscheletro associati.
3. Fissare ulteriormente le celle con 4% PFA, 5% di saccarosio in PBS per 30 min. Risciacquare con 0,05% di Tween-20 in PBS.
4. Preparare le soluzioni di anticorpi primari in PBS. Incubare le cellule con anticorpi primari per almeno 1 ora a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C. Assicurarsi di aggiungere una soluzione sufficiente a coprire l'intera perdita di collagene. Per un piatto fondo di vetro 35 mm, 1,5-2 ml di soluzione sarà necessario. Nota: Per ridurre il volume della soluzione di anticorpo, una barriera insolubile in acqua, come ad esempio una linea circolare di grasso al silicone o un anello PDMS, può essere disposto intorno alla goccia collagene.
5. Lavare 3x 30 min con 0,05% Tween-20 in PBS.
6. Preparare anticorpi secondari coniugati con Alexa, soluzioni DAPI Alexa coniugato falloidina e in PBS. Incubare le cellule con gli appropriati anticorpi secondari per 2 ore a temperatura ambiente.
7. Lavare 3x 30 min con 0,05% Tween-20 in PBS.
8. Rimuovere l'eccesso di liquido, aggiungere abbastanza supporti di montaggio per riempire il fondo di vetro piatto fondo (circa 500 ml) e inserire un 24 millimetri coprioggetto sopra per sigillare. Non premere il vetrino per evitare di comprimere la caduta di collagene e di danneggiare l'organizzazione 3D.

5. Imaging campione

Disco microscopi confocale Classic o spinning può essere utilizzato. Un sistema capovolta può preferenzialmente essere usato per determinare la distanza delle cellule imaged dal fondo di vetro. Il sistema utilizzato per questo lavoro è un invertito confocale disco rotante dotato di una 40X/1.3NA e un 60X/1.4NA obiettivi ad immersione in olio (di lavoro distanze di 200 micron e 130 micron, rispettivamente), una fotocamera CoolSNAP fotometrici HQ2, 1392 x 1040 gamma di imaging, 6,45 x 6,45 micron pixel e controllate dal software Metamorph imaging. 405 nm, 491 nm, 561 nm e 633 nm laser sono in genere utilizzati a potenza 30-50%, guadagnare 1 e binning di 2x 2 per ridurre i tempi di esposizione. Il microscopio è inoltre dotato di una lampada a mercurio e cubetti di filtro per DAPI (EXC 400-418 nm; em 450-465), coniugati (exc 478-495; em 510-555) e Texas Red (exc 560-580; em 600 -650), da utilizzare con l'oculare.

1. Utilizzando la lampada fluorescente, posizionare l'obiettivo 40X al centro della goccia collagene. Ottenere una panoramica del campione, sia nell'asse xy e l'asse z. Assicuratevi di non discostarsi più di 100 micron dal bordo gel sull'asse xy quando l'acquisizione delle immagini per evitare effetti di bordo. Quando sferoidi di imaging, assicurarsi che siano sotto la distanza di lavoro obiettivo. Cambiare obiettivo, se del caso.
2. Passare alla modalità di imaging dal vivo confocale. Utilizzando il laser 561 nm per visualizzare il collagene TAMRA-etichettato, partendo dal fondo di vetro determinare il valore Z da cui le fibre di collagene cominciano ad apparire. Questo è il fondo substrato e z = 0.
3. Usando la manopola di messa a fuoco, salire 100 micron da z = 0. Solo le celle a Z = 100 microno sopra dovrebbe essere ripreso per evitare gli effetti di tensione dal fondo di vetro rigida.
4. Selezionare le celle di immagine. Ottimizzare i tempi di esposizione della fotocamera e la potenza del laser per ogni lunghezza d'onda. Tempi di esposizione tipici per DAPI e Alexa-488 falloidina sono tra i 100-200 msec. I tempi di esposizione per la colorazione degli anticorpi possono variare.
5. Sulla modalità live confocale utilizzando il laser appropriato per visualizzare il falloidina colorazione e usando la manopola di messa a fuoco, definire l'intervallo di serie z, impostando valori z superiore e inferiore di corrente.
6. Definire la dimensione z-passo. Per obiettivi 40X, utilizzare 1 micron. Per 60X, utilizzare 0,5 micron. Avvia acquisizione.

Risultati

Etichettatura coda di topo collagene I con TAMRA consente una preparazione facile e la visualizzazione delle reti di collagene 3D. Polimerizzazione lenta a pranzo risultati di temperatura nella formazione di reti di collagene con organizzazione paragonabili a quelle presenti in vivo ^10.

Qui vi presentiamo un protocollo per immunofluorescenza del citoscheletro delle cellule tumorali CT26, sia come sferoidi e come cellule singole. Per conservare meglio il citoscheletro, i b...

Discussione

Il protocollo qui descritto per etichettare fluorescently collagene I usando TAMRA fornisce un metodo eccellente per consentire una facile visualizzazione della organizzazione rete di collagene, utilizzando un microscopio confocale campione fornito di un laser a 561 nm. Un vantaggio di questa tecnica rispetto al riflettanza microscopia confocale è la capacità di immagine più profonde fibre collagene nella matrice 3D. L'intensità e contrasto della riflessione fibre diminuisce notevolmente con profondità dovuto a...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
TAMRA, SE	Invitrogen	C-1171
Rat tail Collagen High Concentration	BD Biosciences	354249
Rat tail Collagen	BD Biosciences	354236
Phalloidin	Sigma	P2141
Taxol (Paxitel)	Sigma	T7402
Mouse anti-alpha Tubulin antibody	Sigma	T9026
Alexa 488 Phalloidin	Invitrogen	A12379
Alexa 633 Goat anti-Mouse antibody	Invitrogen	A21052
DAPI	Invitrogen	D1306
Mounting media	Fisher Scientific	106 226 89
Dialysis Cassette	Pierce	66380
Glass bottom dishes	World Precision Instruments	FD35-100
MetaMorph Microscopy Automation & Image Analysis Software	Molecular Devices
Imaris 7.2.3	Bitplane