Revelando a Organização do citoesqueleto das células invasoras câncer em 3D

Resumo

Este artigo apresenta um método para rotular fluorescência de colagénio que pode ser ainda utilizado para ambos e correcção de imagem ao vivo de culturas de células em 3D. Nós também fornecer um protocolo optimizado para visualizar as proteínas do citoesqueleto endógenos de células cultivadas em ambientes em 3D.

Resumo

A migração celular tem sido tradicionalmente estudado em substratos 2D. No entanto, tornou-se cada vez mais evidente que existe uma necessidade de estudar a migração celular em ambientes 3D mais adequadas, que melhor se assemelham a dimensionalidade dos processos fisiológicos em questão. Células migratórias podem diferir substancialmente em sua morfologia e modo de migração, dependendo se eles estão se movendo em substratos 2D ou 3D. Devido a dificuldades técnicas e incompatibilidades com a maioria dos protocolos padrão, análise estrutural e funcional das células embutidas dentro de matrizes 3D ainda é incomum. Este artigo descreve a preparação e métodos para imagiologia de culturas de células de cancro em 3D, seja como células isoladas ou esferóides. Como substrato de ECM apropriada para a migração de células do cancro, usamos nonpepsinized colagénio de cauda de rato I polimerizada a temperatura ambiente e marcado por fluorescência para facilitar a visualização utilizando microscopia confocal padrão. Este trabalho inclui também um protocolool para a rotulagem 3D imunofluorescência de citoesqueleto endógena. Usando estes protocolos Esperamos contribuir para uma melhor descrição da composição molecular, localização e funções das estruturas celulares em 3D.

Introdução

O campo da migração celular foi enfrentando no novo mundo tridimensional. É intuitivo para estudar a migração de células num ambiente que mais se assemelha a uma fisiológico e, portanto, tridimensional (3D). No entanto, devido às limitações técnicas, estudos de migração celular mais ter sido feito analisando o movimento da pilha em frente de duas dimensões (2D) substratos rígidos, quer não tratadas ou revestidas com proteínas da matriz extracelular (ECM adequados).

Os primeiros estudos dedicados à migração de células em três treliças tridimensionais de colágeno voltar mais de 20 anos ^1-3. No entanto, apenas durante os últimos 5 anos, tornou-se evidente que as células migradoras podem diferir substancialmente no seu modo de morfologia e da migração de acordo com a dimensão do substrato. Em 2D, apenas as células contactar o substrato com a sua superfície ventral utilizando adesões focais, resultando na formação de saliências planas grandes (lamellipodia) comembarcados saliências digitiformes (filopodia) em sua ponta. Estas estruturas, em conjunto com fibras de stress que se conectam frente da célula para o bordo de fuga, acredita-se ser crucial para o movimento das células em 2D. Nas matrizes 3D, as células são geralmente mais alongada, com a superfície de contacto da célula inteira de ECM, provocando alterações consideráveis ​​na formação e relevância funcional de muitas destas estruturas. Por outro lado, outras características celulares ganhar relevância na migração 3D, tais como a deformação nuclear e as estruturas envolvidas na remodelação de ECM ^4.

Apesar destas alterações morfológicas conhecidas, bem como as diferenças nos modos de migração de ^5-7, que pode variar dependendo do ECM e tipos de células, a análise estrutural e funcional das células embutidas dentro de matrizes 3D ainda permanece fora do comum. Trabalhando com matrizes 3D espessa e densa traz dificuldades técnicas, tais como imagens de microscopia de alta resolução, e incompatibilidades com a maioria staprotocolos ndard otimizado para culturas em 2D, como a rotulagem de imunofluorescência de proteínas endógenas. Além disso, porque a utilização de matrizes 3D é uma abordagem relativamente nova, os investigadores continuam a investigar as melhores condições para se assemelham específico de situações in vivo, tais como a arquitectura do estroma normais de diferentes órgãos ou tecidos do organismo ECM em torno de um tumor. Discrepâncias nos resultados por diferentes grupos em relação, por exemplo, os modos de células de câncer de migração ou a existência de adesões focais, têm gerado alguma controvérsia ^8. Um grande esforço tem sido recentemente dedicada a um consenso em termos de ECM natureza química, o tamanho dos poros, espessura da fibra, e a rigidez da matriz. Muitos tipos diferentes de ECMs 3D são actualmente utilizados, variando a partir de matrizes derivadas de células de matrigel comercialmente disponível, o colagénio bovino pepsinized I, ou de colagénio de cauda de rato nonpepsinized I. Cada uma destas matrizes tem propriedades físicas e químicas específicas e é preciso relate a matriz de escolha para o processo fisiológico a ser estudado. Além disso, o tamanho e espessura de fibra de poros pode depender das condições de polimerização, tais como pH e temperatura ^9,10. Ligação e a distância a partir de substratos rígidos, tais como vidro, podem também alterar as propriedades elásticas da matriz ^10,11.

Este artigo descreve a preparação e métodos para imagiologia de culturas de células de cancro em 3D, seja como células isoladas ou esferóides. Os métodos para produzir esferóides de células cancerosas tem sido descrito anteriormente, as mais populares, sendo os pelo método de gota suspensa ^12,13 eo método de placa de agarose revestidos ^14. Como substrato de ECM apropriada para a migração de células do cancro, nonpepsinized colagénio de cauda de rato I polimerizada a temperatura ambiente é utilizada a 2 mg / ml. Nonpepsinized colágeno extraídas com ácido e eu de cauda de rato mantém ambos os C-terminal e N-telopeptídeos, porções nonhelical da molécula de colágeno responsáveis ​​pela colágeno nativo intermolecular de reticulação e de estabilidade fibrilar ^15. Em conjunto, estas condições permitem a formação de redes de colagénio que mais se assemelham às observadas in vivo ^10. Para permitir a visualização das fibras de colagénio, tanto em culturas fixadas e de estar, um protocolo detalhado para etiquetar é fornecido por fluorescência de colagénio in vitro ¹⁰ utilizando 5 - (e-6)-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA), éster de succinimidilo. Este protocolo foi adaptado do Baici et ai. ^16,17, onde o isotiocianato de fluoresceína é usado para identificar moléculas de colagénio solúveis. A fluoresceína, TAMRA é um corante fluorescente amino-reactivo que reage com grupos amino alifáticos nonprotonated de proteínas, tais como o grupo amino livre no terminal N e, mais importante ainda, o grupo amino de lisinas lado. Esta reacção só ocorre a um pH básico, em que o grupo amino da lisina está na forma nonprotonated. Além TAMRA ser mais estável do que ao longo de fluoresceínatempo, o seu espectro de emissão cai no intervalo de laranja / vermelho (EX / EM = 555/518 nm), o que pode ser utilmente combinadas para imagiologia de células vivas proteínas de GFP. Usando as moléculas de colagénio marcadas com corantes solúveis amino-reactivas não afecta o processo de polimerização nem a densidade, o tamanho de poro e do estado de reticulação da matriz de colagénio ^10,16,18,19.

Este protocolo inclui também um método para rotulagem de imunofluorescência 3D de proteínas endógenas, que foi ainda mais optimizado para rotular o citoesqueleto ou proteínas associadas citoesqueleto. O foco final deste protocolo é sobre os métodos de aquisição de imagens de alta resolução das culturas em 3D usando microscopia confocal com reduzida contribuição de lamínulas rígidas sobre a tensão matriz de colágeno.

Protocolo

1. TAMRA-colágeno I Labeling

1. Prepara-se uma 10 mg / ml solução TAMRA por adição de 2,5 ml de DMSO a 25 mg fornecida TAMRA pó. Dissolve-lo em vórtice até à dissolução completa. Armazenar a -20 º C e proteger da luz.
2. Prepare-se 2 L de Labeling Buffer (0,25 M _{de NaHCO3,} 0,4 M NaCl). Ajustar o pH para 9,5 utilizando uma solução de NaOH a 10 M. Conservar a 4 º C. A partir deste ponto, todas as operações são realizadas a 4 º C a menos que o material indicado de outra forma e fluorescentes é protegido da luz usando papel alumínio.
3. Encher uma seringa descartável de 1 ml com 1 ml de rato altamente concentrada colagénio de cauda de I solução. Soluções de colagénio de elevada concentração são tipicamente fornecidos em concentrações de cerca de 10 mg / ml e é muito viscoso. Certifique-se de manipulá-lo lentamente para evitar a formação de bolhas de ar.
4. Usando uma agulha hipodérmica 21 G, injetar o colágeno em um 3 ml cassete diálise presoaked de 10.000 MWCO cortada. Tenha cuidado para evitar damaterar sua membrana com a agulha. Retire todo o ar do cassete de diálise, puxando para cima o pistão da seringa. Diálise durante a noite contra 1 L de tampão de rotulagem.
5. Misturar 100 mL de 10 mg / ml solução TAMRA com 900 ul de Tampão de rotulagem. Nota: Isto deve ser feito tanto com solução TAMRA e amortecedor Labeling à temperatura ambiente desde DMSO congela a 4 º C. Após a mistura, trazer a solução diluída TAMRA volta a 4 º C.
6. Retire cuidadosamente o colágeno da cassete de diálise utilizando a 2 ml com uma seringa descartável G agulha hipodérmica 21. Mistura-se 1 ml da solução de colagénio dialisada com 1 ml de solução diluída por pipetagem TAMRA.
7. Transferir o colagénio / mistura TAMRA para um tubo de microcentrifugação de 2 ml e incubar durante a noite, com rotação.
8. Transferir a 2 ml de colagénio marcado com TAMRA em 3 ml de uma cassete pré-embebidos diálise e diálise durante a noite contra 1 litro de tampão de etiquetagem para remover o excesso de corante livre.
9. Para restaurar o TAMRA-labELED colagénio para a solução inicial de colagénio, colocar a cassete de diálise em 1 L de 0,2% (v / v) de solução de ácido acético, pH 4, e dializar durante a noite.
10. Medir o volume final do colagénio marcado com TAMRA e calcular a sua concentração final, considerando-se o volume inicial, e a concentração da solução de colagénio utilizada. Armazenar a 4 º C.

2. Matrizes TAMRA-colágeno 3D com embutidos células individuais

1. Calcular o volume de 2 mg / ml de mistura de colagénio-TAMRA necessário para o experimento. Sempre preparar 20% a mais para dar conta de pipetagem perdas devido à alta viscosidade do colágeno.
2. Prepare uma solução estoque de 10x PBS e NaOH 1 N. Filtro de esterilizar e manter a 4 º C. A partir deste ponto, todas as operações são realizadas no gelo salvo indicação em contrário e sob condições estéreis.
3. Misturar 10x PBS e NaOH 1 N em volumes apropriados para obter a concentração desejada de colagénio e pH 7,4. Por exemplo, para um volume final de 1 ml-TAMRA de colagénio mistura a pH 7,4, 100 ul de combinar 10x PBS com 5 ul de NaOH 1N. Misturar bem.
4. Adicionar os volumes apropriados de colagénio marcado com TAMRA e colagénio não marcado numa proporção de 1:6 até atingir uma concentração de colagénio total final de 2 mg / ml. Por exemplo, para um volume final de 1 ml de 2 mg / ml de colagénio TAMRA-mistura, adicionar 90,48 ml de 3,68 mg / ml de colagénio marcado com TAMRA e 415,71 uL de 4,01 mg / ml de colagénio não marcado. Misturar bem e, lentamente, por pipetagem, evitando a formação de bolhas de ar.
5. Adicionar células em suspensão em um volume apropriado de meio de células sem FBS refrigerados à mistura TAMRA-colagénio para obter uma densidade de 10 ⁵ células / ml e uma concentração de 2 mg / ml de colagénio celular final definitivo. Por exemplo, para 1 ml de 2 mg / ml de colagénio TAMRA-mistura, adiciona 388,81 ul de meio contendo 10 ⁵ células. Misturar bem e, lentamente, por pipetagem, evitando a formação de bolhas de ar. Confirmar pH testando 10 ul da mistura em um teste de pH sviagem.
6. Pipetar 100 ul de gotas TAMRA-Colágeno Mix para pratos com fundo de vidro e deixe-a polimerização à temperatura ambiente por 30-45 min. 100 ul de colagénio gotas têm um diâmetro típico de 7 mm e são de 2 mm de altura. Quando polimerizada, o colagénio se transforma em um gel esbranquiçado. Nota: Permitir que o colagénio para polimerizar sem fechar o prato irá evitar a formação de uma película de água em torno do colagénio gota, reduzindo destacamento do vidro. Para aumentar a adesão, os pratos de vidro podem ser revestidas com poli-L-lisina a 100 ug / ml.
7. Adicione cuidadosamente meio de cultura suficiente para cobrir as colágeno / célula gotas. Evite altas fluxos de mídia ou movimentos bruscos desde gotas de colágeno pode facilmente separar. Manter a 37 º C em 10% de CO ₂ em ar humidificado tempo suficiente para as células para migrar na matriz (tipicamente 1-3 dias).

3. Matrizes TAMRA-colágeno 3D com Spheroids celulares embarcados

1. Calcular o volume de 2 mg / ml de colagénio TAMRA-Mix necessário para o experimento. Sempre preparar 20% a mais para dar conta de pipetagem perdas devido à alta viscosidade do colágeno.
2. Prepare uma solução estoque de 10x PBS e NaOH 1 N. Filtro de esterilizar e manter a 4 º C. A partir deste ponto, todas as operações são realizadas no gelo salvo indicação em contrário e sob condições estéreis.
3. Mistura de PBS 10x, com NaOH 1 N e meio de células sem FBS em volumes apropriados para obter a concentração desejada de colagénio e pH 7,4. Por exemplo, para um volume final de 1 ml de mistura de colagénio-TAMRA, a pH 7,4, 100 ul de combinar 10x PBS, 5 ul de NaOH 1 N e 388,81 ul de meios de comunicação. Misturar bem.
4. Adicionar os volumes apropriados de colagénio marcado com TAMRA e colagénio não marcado numa proporção de 1:6 até atingir uma concentração de colagénio total final de 2 mg / ml. Por exemplo, para um volume final de 1 ml de 2 mg / ml de colagénio TAMRA-mistura, adicionar 90,48 ml de 3,68 mg / ml de colagénio marcado com TAMRA e 415,71 uL de 4,01 mg / ml de UNLacolágeno Beled. Misturar bem e, lentamente, por pipetagem, evitando a formação de bolhas de ar. Confirmar pH testando 10 ul da mistura sobre uma tira de teste de pH.
5. Pipetar 100 ul de gotas TAMRA-Colágeno Mix em placas de vidro de fundo e permitir que ele para iniciar a polimerização por 2-5 min. Isso ajudará a impedir o afundamento de esferóides, aumentando ligeiramente a viscosidade do gel. 100 ul de colagénio gotas têm um diâmetro típico de 7 mm e são de 2 mm de altura.
6. Colete um esferóide celular e colocá-lo em uma placa de Petri limpa. Remover qualquer excesso de líquido e de re-suspender em 10 ul de mistura de colagénio-TAMRA. Isto é importante para evitar a diluição do colagénio, com meio celular.
7. Com uma pipeta P20, coletar o colágeno suspenso esferóide e colocá-lo na parte superior central da mL queda Mix 100 TAMRA-colágeno. Nota: Não coloque mais de um esferóide por gota de colágeno, uma vez que elas podem afetar uns aos outros a capacidade de invadir e / ou migrar.
8. Permitir que o Mix TAMRA-Colágeno para polyMérize à temperatura ambiente durante 30-45 min. Quando polimerizada, o colagénio se transforma em um gel esbranquiçado. Nota: Permitir que o colagénio para polimerizar sem fechar o prato irá evitar a formação de uma película de água em torno do colagénio gota, reduzindo destacamento do vidro. Para aumentar a adesão, os pratos de vidro podem ser revestidas com poli-L-lisina a 100 ug / ml.
9. Adicione cuidadosamente meio de cultura suficiente para cobrir o colágeno / esferóides gotas. Evite altas fluxos de mídia ou movimentos bruscos desde gotas de colágeno pode facilmente separar.
10. Manter a 37 º C em 10% de CO ₂ em ar humidificado tempo suficiente para as células para invadir / migrar na matriz (tipicamente 1-3 dias).

4. Imunofluorescência 3D

1. Remova cuidadosamente os meios de comunicação celular e lave as matrizes de colágeno contendo células / esferóides com PBS.
2. Ao mesmo tempo fixar e extrair células por incubação com tampão de extracção / fixação (4% PFA, 0,3% de Triton X-100, 5% de sacarose em PBS) durante 5 min. Complemente o buffer com 2 mM Faloidina e 2 mM Taxol para a visualização de citoesqueleto ou proteínas associadas citoesqueleto.
3. Além disso fixar as células com PFA a 4%, 5% de sacarose em PBS durante 30 min. Lavar com 0,05% de Tween-20 em PBS.
4. Preparar as soluções de anticorpos primários em PBS. Incubar as células com anticorpos primários durante pelo menos 1 hora à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 º C. Certifique-se de adicionar solução suficiente para cobrir a queda de colágeno inteiro. Para vidro de 35 mm de fundo do prato, 1.5-2 ml de solução será necessário. Nota: Para reduzir o volume da solução de anticorpo, uma barreira insolúvel na água, tal como uma linha circular de massa de silicone, ou um anel de PDMS, pode ser colocada ao redor da gota de colagénio.
5. Lavar 3x 30 min, com 0,05% de Tween-20 em PBS.
6. Preparar anticorpos secundários conjugados com Alexa, soluções DAPI Alexa-faloidina e conjugado em PBS. Incubar as células com os anticorpos secundários apropriados durante 2 horas à temperatura ambiente.
7. Lave 3x 30 min, com 0,05% de Tween-20 em PBS.
8. Retire o excesso de líquido, acrescente o suficiente montagem de mídia para preencher o fundo de vidro prato inferior (cerca de 500 mL) e coloque um 24 milímetros lamela por cima para selar. Não pressione a lamela para evitar comprimir a queda de colágeno e prejudicando a organização em 3D.

5. Exemplo de imagem

Microscopia confocal de disco clássico ou fiação pode ser usado. Um sistema invertido, preferencialmente, deve ser usada para determinar a distância entre as células com imagens do fundo de vidro. O sistema utilizado para este trabalho é um disco giratório invertido confocal equipado com um 40X/1.3NA e um 60X/1.4NA objetivos de imersão em óleo (trabalhando distâncias de 200 mM e 130 mM, respectivamente), uma câmera CoolSnap HQ2 Photometrics, 1392 x 1040 matriz de imagem, 6,45 x 6,45 ^ m e pixels controlados por software Metamorph imagiologia. 405 nm, 491 nm, 561 nm e 633 nm lasers são normalmente utilizados em poder de 30-50%, o ganho de 1 e de 2 binningx 2 para reduzir os tempos de exposição. O microscópio também é equipado com uma lâmpada de Hg e cubos de filtro para DAPI (exc 400-418 nm; in 450-465), FITC (exc 478-495; los 510-555) e Texas Red (exc 560-580; los 600 -650) para usar com a parte do olho.

1. A utilização da lâmpada fluorescente, colocar um objectiva de 40x no meio da gota de colagénio. Como uma visão geral da amostra, tanto no eixo xy e no eixo z. Certifique-se de que não se desvie mais do que 100 um a partir da borda de gel no eixo xy na aquisição das imagens para evitar os efeitos de borda. Quando esferóides imagem, certifique-se que estão sob a distância de trabalho objetiva. Alterar objetivo se for o caso.
2. Mude para o modo confocal ao vivo de imagens. Ao utilizar o laser de 561 nm para visualizar o colágeno TAMRA marcado, a partir do fundo de vidro determinar o valor de z em que as fibras de colágeno começam a aparecer. Este é o substrato de fundo e de z = 0.
3. Usando o botão de foco, ir até 100 mm de z = 0. Apenas as células em z = 100 pmou acima deve ser trabalhada para evitar efeitos da tensão a partir do fundo de vidro rígida.
4. Selecione as células de imagem. Otimizar os tempos de exposição da câmera e do poder do laser para cada comprimento de onda. Tempos de exposição típicas para DAPI e Alexa-488 Faloidina estão entre 100-200 ms. Os tempos de exposição para coloração de anticorpos podem variar.
5. No modo confocal vivo usando o laser adequado faloidina para visualizar a coloração e com o botão de focagem, definem o intervalo de série z z definindo valores superior e inferior a corrente.
6. Definir o tamanho do passo z. Para os objetivos 40X, use 1 mícron. Para 60X, usar 0,5 micron. Comece aquisição.

Resultados

Rotulagem rato-cauda colágeno I com TAMRA permite uma fácil preparação e visualização de redes de colágeno 3D. Polimerização lenta em temperatura ambiente resulta na formação de redes de colágeno com organização semelhante às encontradas in vivo ^10.

Aqui é apresentado um protocolo para a coloração de imunofluorescência citoesqueleto das células cancerosas CT26, tanto como esferóides e, como células individuais. Para melhor preservar o citoesqueleto, ...

Discussão

O protocolo descrito aqui para rotular fluorescently colágeno I utilizando TAMRA fornece um excelente método para permitir a fácil visualização da organização da rede de colágeno, por meio de um microscópio confocal padrão equipado com um laser de 561 nm. Uma vantagem desta técnica em comparação com microscopia confocal de reflectância é a capacidade de fibras de colagénio da imagem mais profundos na matriz 3D. A intensidade e contraste da reflexão fibras diminui substancialmente com a profundidade devi...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
TAMRA, SE	Invitrogen	C-1171
Rat tail Collagen High Concentration	BD Biosciences	354249
Rat tail Collagen	BD Biosciences	354236
Phalloidin	Sigma	P2141
Taxol (Paxitel)	Sigma	T7402
Mouse anti-alpha Tubulin antibody	Sigma	T9026
Alexa 488 Phalloidin	Invitrogen	A12379
Alexa 633 Goat anti-Mouse antibody	Invitrogen	A21052
DAPI	Invitrogen	D1306
Mounting media	Fisher Scientific	106 226 89
Dialysis Cassette	Pierce	66380
Glass bottom dishes	World Precision Instruments	FD35-100
MetaMorph Microscopy Automation & Image Analysis Software	Molecular Devices
Imaris 7.2.3	Bitplane