多不饱和脂肪酸的膳食补充剂<em&gt;秀丽隐杆线虫</em

摘要

的线虫实验的是一个有用的模型，以探讨发展和生理学的多不饱和脂肪酸的功能。这个协议描述补充的 C的一种有效的方法线虫的饮食与多不饱和脂肪酸。

摘要

脂肪酸是必需的许多细胞功能。他们作为高效的储能分子，补膜的疏水核心，并参与各种信号通路。 秀丽隐杆线虫综合了所有必要的酶来生产一系列的ω-6和ω-3脂肪酸。此，结合了简单的解剖学和可遗传工具的范围，使之成为有吸引力的模型来研究脂肪酸功能。为了研究介导的膳食脂肪酸的生理作用的遗传途径，我们已开发出一种方法，以补充C。线虫的饮食与不饱和脂肪酸。补充剂是改变蠕虫的脂肪酸组合物，一种有效的手段，也可用于抢救中脂肪酸的缺失突变体的缺陷。我们的方法用线虫生长培养基琼脂（NGM），补充有脂肪acidsodium盐。在补充板的脂肪酸成为incorpora特德进入细菌的食物来源，然后采取了由C的膜线虫饲料的补充细菌。我们还描述了一种气相色谱协议来监控发生在补充蠕虫中脂肪酸组成的变化。这是为了补充C的大和小群体的饮食的有效方法线虫 ，允许的范围内对本方法的应用。

引言

脂肪酸是膜的必要的结构部件，以及有效的能量储存分子。此外，脂肪酸可以从细胞膜裂解通过脂肪酶和酶促修饰以产生信号的效应^1。天然存在的多不饱和脂肪酸（PUFA），含有两个或多个顺式双键。 ω-3脂肪酸和ω-6脂肪酸是彼此区分的基础上的双键相对于脂肪酸的甲基端的位置。健康饮食需要两个ω-6和ω-3脂肪酸。然而，西方的饮食是特别丰富的omega-6脂肪酸，差ω-3脂肪酸。高ω-6与ω-3脂肪酸的比例是与心血管和炎性疾病的风险增加，但是，具体的脂肪酸的精确有益和有害功能都不能很好地理解²相关联。蛔虫秀丽隐杆线虫elega因为它综合了所有必要的酶来生产一系列的ω-6和ω-3脂肪酸，包括ω-3去饱和酶的活动，是在缺席的大多数动物^3,4纳秒是研究脂肪酸的功能是有用的。突变体缺乏脂肪酸去饱和酶的酶不能产生特定的PUFA，从而导致一系列的发育和神经缺陷^4-6。

探讨膳食脂肪酸的生理效应，我们已经开发出一种生化检测与遗传分析兼容同时使用突变和RNAi敲除技术在C线虫 。补充特定的多不饱和脂肪酸是通过将脂肪酸的钠盐溶液的琼脂培养基之前浇注来实现。这将导致在多不饱和脂肪酸的摄取由大肠杆菌大肠杆菌的食物来源，它积聚在细菌膜。C.线虫摄取的含PUFA的细菌，这饮食补充足够的抢救有缺陷的多不饱和脂肪酸缺乏的突变体TS。大多数脂肪酸补充有对野生型动物没有有害的影响，但是，具体的ω-6脂肪酸，尤其是二高-γ-亚麻酸（DGLA，20点03的n-6）引起℃的永久性破坏线虫生殖细胞^7,8。

气相色谱法是用于监视补充脂肪酸的细菌食物源（OP50或HT115）以及线虫的吸收。在加入洗涤剂的Tergitol（NP-40）中的媒体的允许通过整个板和的脂肪酸由大肠杆菌更高效摄取均匀分布的脂肪酸大肠杆菌和线虫。我们已经发现，不饱和脂肪酸可以容易地采取了由细菌和C。线虫 ，但是饱和脂肪酸的摄取是非常低效率的。本文将描述一步一步如何与脂肪酸补充琼脂培养基，以及如何监测在日脂肪酸的摄取Ë线虫用气相色谱法。

研究方案

多不饱和脂肪酸是对热，光和氧敏感。因此，必须制备脂肪酸补充剂板时，应考虑这样的脂肪酸是不暴露在过量的热和光。含有0.1％的Tergitol（NP-40）NGM介质被高压灭菌和部分冷却，之后，脂肪酸钠盐中加入并不断搅拌。所述板被允许在黑暗中进行干燥。脂肪酸由C摄取线虫培养于这些板然后可以通过气相色谱法来监测。

1。脂肪酸补充培养基的制备

1. 测量出的媒体组成部分成适当大小的烧瓶中。每1升中，添加17克细菌用琼脂2.5克胰蛋白胨，3克氯化钠，加入1ml 5毫克/毫升胆固醇溶解在乙醇和10ml 10％的Tergitol溶解在水中。
2. 加入80％的微孔水最终所需量和高压灭菌媒体以及空玻璃瓶（相当于不同的数脂肪酸浓度进行测试），以及适当的量筒。
3. 在水浴中设定为55℃，阴凉媒体当介质被冷却制备由破开的玻璃小瓶中，使用的安全防范措施，并确保玻璃粒子不混在的脂肪酸，脂肪酸的钠盐的工作原液。称出足够的脂肪酸，使一个100毫米的工作股票。
4. 带来的脂肪酸溶液至100mM的用纯化水的最终浓度。完全溶解的脂肪酸的钠盐通常需要约20-30分钟。吹扫的脂肪酸用氩气或氮气的工作原液，由于用惰性气体接触防止氧化。盖上瓶盖和存储作业储备，在黑暗中，直到媒体已经冷却。
5. （可选）如果RNAi的媒体需要，测量氨苄青霉素和异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）解决方案在这里。
6. 当琼脂冷却到55°C每增加1升:1毫升1M MgSO ₄干燥，将1ml的1M的CaCl ₂和25ml的磷酸盐缓冲液（108.3克KH ₂ PO ₄和35.6克K ₂ HPO _4，每1升高压灭菌）。添加过滤除菌氨苄青霉素和IPTG的解决方案，如果做的RNAi板。对于所有类型的板，加无菌水至使最终的介质体积至1L。
7. 附近的火焰，转移媒体的蒸压和适当大小的量筒，然后加入温水无菌水到所需体积。传输媒体回到初始瓶中，搅拌混合。
8. 靠近火焰，传输介质分成若干瓶等于浓度通过用蒸压测量被测试的数量和适当大小的带刻度的量筒。使用水浴直至脂肪酸工作股价已充分溶解维持等分媒体称为液体。
9. 将一个瓶子上的轰动板和搅拌，直到媒体是温暖的触感，但不热。请务必留下自己足够时间搅拌中的脂肪酸原液和倒片介质开始凝固之前。如果搅拌盘具有温度控制，将其设置为55°C。
10. 稀释100毫米脂肪酸的工作股票进入媒体所需的终浓度。搅拌介质，直至白色沉淀物是在溶液中（约1分钟）。媒体可能还是稍微浑浊之后。
11. （可选）如果RNAi的媒体需要加氨苄青霉素至0.1毫克/毫升和IPTG至最终浓度为2mM。
12. 使用自动吸管援助和无菌25毫升吸管，加入8毫升媒体每60毫米板或每100mm板25毫升媒体倒媒体。重复脂肪酸加成和浇注板的其余瓶子的步骤。
13. 之后，琼脂凝固，覆盖脂肪酸补充板与框或在室温下储存在通风良好的抽屉从光氧化保护。
14. E.种子大肠杆菌 OP50到平板平板干燥后的两天后。60 MM平板上，移液器300μl的OP50过夜培养（在37℃生长）的。如果RNAi的板倾倒，种子用300μlRNA干扰细菌后平板干燥后四天。板的干燥时间可能需要由于各种实验室环境中湿度的差异进行调整。
15. 孵育在黑暗环境中的板在室温下，而菌苔被干燥。

2。由DGLA的补充诱导生精细胞破坏

1. 线虫生长在含0.3 mM的DGLA（20时03 N-6）板块成为不育是由于生殖细胞在这两个幼虫阶段和成年线虫的破坏。
   1. 通过治疗妊娠雌雄同体用碱性次氯酸钠溶液准备L1幼虫的同步人口（对于一个10 ml的溶液:0.5 5M的NaOH，2.5毫升家用漂白剂，和7ml H _{2 O}的毫升）。轻轻摇动在此解决方案的妊娠直到雌雄同体成虫s溶解。鸡蛋将被保留，并且可以通过低速离心沉淀。
   2. 在M9的缓冲液洗蛋准备3次（3克KH ₂ PO _4，6克的Na ₂ HPO _4，5克氯化钠，加入1ml 1米硫酸镁_{4，H 2 O}至1 L。添加_硫酸镁高压灭菌后）。以提供足够的氧气，重悬在鸡蛋15毫升的塑料管以5毫升M9缓冲液和岩石的终体积在摇床上过夜。
   3. L1幼虫应电镀的RNAi菌后用OP50，或一天播种后两天加入到补充板。蠕虫孵育在20℃，3天或直到他们达到成年阶段。
2. 成虫可以拿下的使用解剖显微镜用足够高的倍率进行可视化的胚胎在子宫内发展不育。成功的生精细胞丢失会出现鸡蛋清子宫无效。
3. 蠕虫还可以砍下通过固定并与核酸染色CID染料diamindinophenylindole吲哚（DAPI），这有利于晶核在生殖细胞中的可视化和发育中的胚胎。一种快速DAPI染色是由采摘蠕虫成M9的缓冲区上表面玻璃⁹的下降来实现。
   1. 洪水手表玻璃用1毫升0.2纳克/立方米。 DAPI在95％的乙醇溶液，让坐在约5分钟。
   2. 挑虫进入VECTASHIELD的幻灯片上的下降，然后盖上盖玻片。
   3. 密封盖玻片，并储存于4℃在黑暗中过夜，以获得最佳的染色，但是滑动也可立即观看。得分为存在或不存在使用装有紫外线灯和过滤器的荧光显微镜生殖细胞的细胞核。

3。确认脂肪酸的摄取气相色谱法

总体脂肪酸C的组成线虫可以通过生成脂肪酸甲酯（脂肪酸甲酯），它们然后被分离并用气相字符定量测定omatography ^4。

1. 洗它们了与水板，并转移到硅烷化13毫米×100毫米的玻璃螺丝顶管收集500-1000成虫。
2. 让蠕虫清偿重力，然后删除尽可能多的水可能用玻璃巴斯德吸管。
3. 用清水洗一次虫，然后再删除尽可能多的水可能。
4. 脂肪酸甲酯是通过加入1ml 2.5％的H ₂ SO ₄的甲醇溶液，然后加热，在70℃进行1小时的水浴中形成的。
5. 从水浴中取出试管并冷却1分钟。
6. 通过加入1.5毫升的水和0.25毫升己烷提取脂肪酸甲酯。
7. 回顾管和剧烈震荡。
8. 离心管中，在台式临床离心1分钟以最大速度己烷从含水溶剂中分离出来。
9. 转让正己烷（顶层）的GC样品瓶插件内的GC样品瓶，小心不要将任何水相。对于GC一nalysis，1-2μl，以正己烷脂肪酸甲酯被注入到适合脂肪酸甲酯分析极性毛细管气相色谱柱。在Agilent 7890 GC进样口被设定在250℃，用1.4毫升/分钟的流速，并在GC烘箱编程为在130℃的初始温度，这是保持1分钟。随后，将温度斜坡10℃/分钟直到190℃，然后再次升温速率5℃/分钟直到210℃并保持另外1分钟。
10. 以确保已发生的DGLA的那摄取，用火焰离子化检测器（FID）或质谱（MS）检测，用真实标准为C的鉴定分析脂肪酸甲酯线虫脂肪酸。

结果

在C的补充线虫饮食是由细菌食物源的摄取和结合脂肪酸到细菌膜的能力的限制。要确定大肠杆菌的能力大肠杆菌 OP50吸收各种脂肪酸进入其的膜，OP50被镀到无补充剂，0.1毫米和硬脂酸（18:0），油酸钠（18:1 N-9），和钠DGLA（20 0.3mM的浓度媒体:3N-6）。平板在室温下干燥在黑暗中3天，并保温在20℃下进行3天。细菌草坪被轻轻地刮草坪成水与火焰消毒压舌板收集。细菌通过离...

讨论

这里我们描述的补充C的方法线虫与食物中的不饱和脂肪酸。如上所述，必须注意在多不饱和脂肪酸补充板的准备，因为在多不饱和脂肪酸的双键的反应自然会导致这些不饱和脂肪酸，通过热和光¹¹是氧化敏感。为了避免氧化，该多不饱和脂肪酸加入到液体琼脂培养基后，媒体已经冷却至55℃，并存储板在黑暗环境中是很重要的。

他人已经介绍的游离脂肪?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bacto-Agar	Difco	214010
Tryptone	Difco	211705
NaCl	J.T. Baker	3624-05
Tergitol	Sigma	NP40S-500mL
Cholesterol	Sigma	C8667-25G	(5 mg/mL in ethanol)
MgSO4	J.T. Baker	2504-01
CaCl2	J.T. Baker	1311-01
K2HPO4	J.T. Baker	3254-05
KH2PO4	J.T. Baker	3246-05
Sodium dihomogamma linolenate	NuCHEK	S-1143
Warm sterile Millipore water
Sterile water for collecting worms
Nuclease-free Water for DGLA stock solution	Ambion	AM9932
Ampicillin	Fisher Scientific	BP1760-25	100 mg/ml in water (for RNAi plates)
Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)	Gold Biotechnology	12481C100	1 M in water (for RNAi plates)
HSO4	J.T. Baker	9681-03
Methanol	Fisher Scientific	A452-4
Hexane	Fisher Scientific	H302-4
diamindinophenylindole (DAPI)	Sigma	D9542
VectaShield	Vector Laboratories	H-1000
Glass Flask	Corning	4980-2L
Autoclaveable Glass bottles with stirbars	Fisherbrand	FB-800
Autoclaveable Glass Graduated Cylinder	Fisherbrand	08-557
Stir Plate	VWR	97042-642
Waterbath at 55+ °C	Precision Scientific Inc.	66551
Screwcap Brown Glass Vial	Sun SRI	200 494
Argon gas tank
Automated Pipette aid	Pipette-Aid	P-90297
Sterile Serological Pipettes (25 ml)	Corning	4489
Bunsen Burner	VWR	89038-534
Dissection microscope	Leica	TLB3000
Silanized glass tube	Thermo Scientific	STT-13100-S	for FAMEs derivitization
PTFE Screw caps	Kimble-Chase	1493015D
Clinical tabletop centrifuge	IEC
GC Crimp Vial	SUN SRi	200 000
GC Vial Insert	SUN SRi	200 232
GC Vial cap	SUN SRi	200 100
Gas Chromatograph	Agilent	7890A
Mass Spectrometry Detector	Agilent	5975C
Column for gas chromatography	Suppelco	SP 2380	30 m x 0.25 mm fused silica capillary column