АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Caenorhabditis Elegan является полезной моделью для изучения функции полиненасыщенных жирных кислот в развитии и физиологии. Этот протокол описывает эффективный метод дополняющий C. Элеганс диета с полиненасыщенными жирными кислотами.

Аннотация

Жирные кислоты необходимы для многочисленных клеточных функций. Они выступают в качестве эффективных молекул хранения энергии, составляют гидрофобного ядра мембран, а также участвовать в различных сигнальных путей. Caenorhabditis Элеганс синтезирует все ферменты, необходимые для производства целого ряда омега-6 и омега-3 жирных кислот. Это, в сочетании с простой анатомии и диапазон доступных генетических инструментов, делают его привлекательным моделью для изучения функции жирных кислот. Для того чтобы исследовать генетические пути, которые опосредуют физиологические эффекты биологически активных жирных кислот, мы разработали метод в целях пополнения C. Элеганс диета с ненасыщенных жирных кислот. Дополнение является эффективным средством для изменения состава жирных кислот червей, а также может быть использован, чтобы спасти дефекты в кислых дефицитом мутантов жирных. Наш метод использует нематод роста среднего агар (NGM) с добавлением жирных acidsodium солей. Жирные кислоты в дополненных пластин стать IncorporaТед в мембраны бактериальной источника пищи, который затем, с которой соприкасается С. Элеганс, которые питаются на дополненных бактерий. Мы также описываем протокол газовой хроматографии для мониторинга изменений в составе жирных кислот, которые происходят в дополненных червей. Это эффективный способ пополнить рацион больших и малых популяций C. Элеганс, что позволяет для ряда приложений для этого метода.

Введение

Жирные кислоты необходимы структурные компоненты мембран, а также молекулы эффективного хранения энергии. Кроме того, жирные кислоты можно отщепить от клеточных мембран по липаз и быть ферментативно модифицированы с получением сигнализации эффекторы 1. Природные полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) содержат два или более цис двойные связи. Омега-3 жирные кислоты и омега-6 жирные кислоты отличаются друг от друга на основе позиции двойных связей по отношению к концевой метильной группы жирной кислоты. Здоровые диеты требуют как омега-6 и омега-3 жирных кислот. Тем не менее, западные диеты особенно богаты омега-6 жирных кислот и бедными в омега-3 жирных кислот. Высокий омега-6 омега-3 соотношение жирных кислот в связано с повышенным риском сердечно-сосудистых и воспалительных заболеваний, однако, точные полезные и вредные функции конкретных жирных кислот не до конца понятны 2. Аскариды Caenorhabditis Elegaнс является полезной при изучении функции жирных кислот, потому что она синтезирует все ферменты, необходимые для производства целого ряда омега-6 и омега-3 жирных кислот, в том числе омега-3 десатуразой, деятельность, отсутствует у большинства животных 3,4. Мутанты, лишенные жирные десатурации кислоты ферменты не дают конкретных ПНЖК, что приводит к целому ряду развития и неврологических дефектов 4-6.

Для изучения физиологических эффектов диетических жирных кислот, мы разработали биохимический анализ, совместимый с генетического анализа с использованием как мутант и RNAi нокдауна методы в С. Элеганс. Дополнение с конкретным ПНЖК достигается путем добавления жирных кислот раствора натриевой соли в агаровой среде до заливки. Это приводит к поглощению ПНЖК в Е. палочка источником пищи, где он накапливается в бактериальных мембранах. С. Элеганс глотать ПНЖК-содержащих бактерии, и это диетических добавок достаточно, чтобы спасти неисправенц из ПНЖК-дефицитных мутантов. Дополнение большинства жирных кислот не имеет пагубные последствия для дикого типа животных, однако, конкретные омега-6 жирных кислот, особенно дигомо-гамма-линоленовой кислоты (DGLA, 20:03 н-6) вызывают постоянное разрушение С. Элеганс половые клетки 7,8.

Газовая хроматография используется для контроля поглощения в дополненной жирной кислоты в бактериальной источника питания (или OP50 или HT115), а также в нематод. Добавление моющего средства Tergitol (NP-40) в средствах массовой информации позволяет равномерное распределение жирных кислот через всю пластину и более эффективное поглощение жирных кислот со стороны Е. палочка и нематоды. Мы обнаружили, что ненасыщенные жирные кислоты могут быть легко поглощается бактериями и С. Элеганс, но поглощение насыщенных жирных кислот гораздо менее эффективным. Эта статья описывает шаг за шагом, как дополнение к среде агара с жирными кислотами, а также, как контролировать поглощение жирных кислот в гое нематода с помощью газовой хроматографии.

протокол

Полиненасыщенные жирные кислоты являются чувствительными к тепла, света и кислорода. Таким образом, необходимо соблюдать осторожность при подготовке добавок пластины жирных кислот, такие жирные кислоты, которые не подвергались воздействию избыточного тепла и света. NGM среды, содержащие 0,1% Tergitol (NP-40) в автоклаве и частично охлаждают, после чего натриевые соли жирных кислот добавляют при постоянном перемешивании. Планшеты дают высохнуть в темноте. Поглощение жирных кислот С. Элеганс культивировали на этих пластин может быть контролируют с помощью газовой хроматографии.

1. Подготовка жирных кислот дополняется СМИ

  1. Отмерьте медиа компоненты в соответствующего размера колбы. На 1 л, добавляют 17 г бактоагар 2,5 г триптона, 3 г NaCl, 1 холестерина мл 5 мг / мл, растворенный в этаноле и 10 мл 10% Tergitol, растворенный в воде.
  2. Добавить 80% конечной требуемой объема Millipore воды и автоклав СМИ наряду с пустыми стеклянными бутылками (равно числу различныхКонцентрации жирных кислот быть проверено), а также соответствующий градуированные цилиндры.
  3. Прохладный СМИ в водяной бане до 55 ° С В то время как носитель охлаждения подготовки рабочей исходного раствора натриевой соли жирных кислот разламывают на стеклянную ампулу, с использованием техники безопасности и обеспечение частицы стекла не смешиваются в с жирными кислотами. Взвесить достаточно жирную кислоту, чтобы сделать рабочую запас 100 мм.
  4. Доведите раствор жирной кислоты до конечной концентрации 100 мМ очищенной водой. Полностью растворения соли натрия жирных кислот, как правило, занимает около 20-30 минут. Продуть рабочий запас жирных кислот с аргон или азот, так как контакт с инертным газом предотвращает окисление. Закройте флакон крышкой и храните рабочий запас в темноте, пока СМИ не остынет.
  5. (Необязательно) Если РНК-интерференции СМИ желательно, измерить ампициллин и изопропилового β-D-1-тиогалактопиранозид (ИПТГ) решения здесь.
  6. Когда агар остынет до 55 ° C добавить на 1 л: 1мл 1 М MgSO 4, 1 мл 1 М CaCl 2 и 25 мл фосфатного буфера (108,3 г KH 2 PO 4 и 35,6 г K 2 HPO 4 на 1 л в автоклаве). Добавить фильтр стерилизовать ампициллин и решения ИПТГ Если сделать RNAi пластины. Для всех типов плит, добавляют стерильную воду, чтобы довести конечный объем медиа до 1 л
  7. Рядом пламени, передачу мультимедийных файлов в автоклаве и соответствующего размера мерный цилиндр, а затем добавить теплую стерильную воду до требуемого объема. Трансфер СМИ возвращается в исходное колбу и смешать перемешиванием.
  8. Рядом пламени, передачу мультимедийных файлов на несколько бутылок, равным числу концентраций, которые будут испытаны путем измерения с автоклаве и соответствующего размера градуированный цилиндр. Поддерживать Определенную часть средств массовой информации, как жидкости с помощью водяной бани, пока работает фондовый жирные кислоты полностью не растворится.
  9. Положите одну бутылку на магнитной мешалки и перемешать, пока СМИ не теплая на ощупь, но не жарко. Не забудьте оставить себе достаточновремя движение в маточного раствора жирных кислот и разлить в чашки, прежде чем средства массовой информации начинает затвердевать. Если мешалка имеет контроль температуры, установите его до 55 ° С
  10. Разбавьте рабочий запас 100 мМ жирных кислот в СМИ в процессе окончательной концентрации желаемого. Перемешать медиа до белого осадка не находится в растворе (приблизительно 1 мин). Медиа-прежнему может быть немного облачно впоследствии.
  11. (Необязательно) Если РНК-интерференции СМИ желательно добавить ампициллин до 0,1 мг / мл и IPTG до 2 мм конечная концентрация.
  12. Налейте СМИ с использованием автоматизированной помощи пипетки и стерильный 25 мл пипетки, добавив, 8 мл СМИ на 60 мм пластины или 25 мл СМИ на 100 мм пластины. Повторите жирную добавление кислоты и тарелку розлива шаги для оставшихся бутылок.
  13. После того, как агар укрепил, покрыть кислоты с добавкой тарелки жирные с коробкой или Хранить при комнатной температуре в хорошо вентилируемом ящике для защиты от света окисления.
  14. Семя Е. палочка OP50 на тарелки через два дня после пластины высохли.Для 60-мм чашках, пипетки 300 мкл ночной культуры, выращенной OP50 (при 37 ° С). Если RNAi планшеты налил, семян 300 мкл РНК-интерференции бактерий после пластины высохли в течение четырех дней. Тарелка время высыхания может потребоваться корректировка в связи с различиями в влажности в различных лабораторных условиях.
  15. Инкубируйте пластин в темноте при комнатной температуре в то время как бактериальный газон сушки.

2. Склонение зародышевых клеток уничтожения добавок DGLA

  1. C. Элеганс выращенные на чашках, содержащих 0,3 мм DGLA (20:03 н-6) становятся бесплодными из-за разрушения половых клеток в обеих личиночной стадии и взрослых нематод.
    1. Подготовка синхронизированный население L1 личинок обработкой беременных гермафродитов с щелочным раствором гипохлорита (для раствора 10 мл: 0,5 мл 5М NaOH, 2,5 мл хлорной и 7 мл H 2 O). Аккуратно рок беременной гермафродитов в этом растворе до взрослого червяс раствориться. Яйца будут сохранены, и может быть осаждали центрифугированием с низкой скоростью.
    2. Вымойте Подготовительного яйцо 3 раза в M9 буфера (3 г KH 2 PO 4, 6 г Na 2 HPO 4, 5 г NaCl, 1 мл 1 М MgSO 4, H 2 O в 1 L. Добавить MgSO 4 после автоклавирования). Для обеспечения достаточного количества кислорода, ресуспендируют яйца в 15 мл пластиковую пробирку до конечного объема 5 мл буфера M9 и рок на шейкере в течение ночи.
    3. L1 личинки должны быть добавлены к дополненных пластин через два дня после посева с OP50, или один день после посева бактерий RNAi. Выдержите червей при 20 ° С в течение трех дней или пока они не достигнут взрослой стадии.
  2. Взрослые черви могут быть забил на стерильность с помощью рассекает микроскоп с достаточно большим увеличением визуализировать эмбрионов развивающиеся в матке. Успешная потеря половых клеток появится в виде прозрачного матки пустоту яиц.
  3. Черви также может быть засчитан в установлении и окрашивания нуклеиновой акраситель diamindinophenylindole чид (DAPI), что облегчает визуализацию ядер в половых клетках и развивающихся эмбрионов. Быстрое DAPI пятна достигается путем выбора червей в каплю M9 буфера на часовое стекло 9.
    1. Наводнение часы-стекло с 1 мл 0,2 нг / м. DAPI в 95% растворе этанола, дайте постоять примерно 5 мин.
    2. Возьмите червей в каплю Vectashield на слайде, а затем накройте покровным.
    3. Уплотнение покровное и хранят при температуре 4 ° С в темноте в течение ночи для оптимального окрашивания, однако слайды также можно рассматривать немедленно. Оценка на наличие или отсутствие зародышевых клеток ядер с использованием флуоресцентного микроскопа, снабженного УФ-лампы и фильтра.

3. Подтверждение жирных кислот поглощение газовой хроматографии

Общая состав жирных кислот в С. Элеганс может быть определена путем получения метиловых эфиров жирных кислот (Fames), которые затем выделена и измерена количественно с использованием газовой Chromatography 4.

  1. Сбор 500-1000 взрослых червей путем промывания их из пластин с водой и передачи в силанизированного 13 мм х 100 мм стекло винта верхней трубы.
  2. Пусть черви поселиться под действием силы тяжести, а затем удалить столько воды, сколько возможно со стеклянной пипетки Пастера.
  3. Вымойте червей один раз водой, а затем снова удалить столько воды, сколько возможно.
  4. FAMEs формируются путем добавления 1 мл 2,5% H 2 SO 4 в метаноле, а затем нагревание при 70 ° С в течение 1 часа на водяной бане.
  5. Удалить труб из водяной бани и охлаждают в течение 1 мин.
  6. Экстракт Fames добавлением 1,5 мл воды и 0,25 мл гексана.
  7. Отчет трубы и энергично встряхивают.
  8. Пробирки центрифужные в настольной клинической центрифуге в течение 1 мин при максимальной скорости, чтобы отделить от водного растворителя гексана.
  9. Трансфер гексан (верхний слой) к GC флакона вставки в GC флакона, стараясь не передавать какие-либо водной фазы. Для GC анализ, 1-2 мкл МЭЖК в гексане впрыскивается на полярной капиллярной колонки газовой хроматографии, подходящей для анализа Fames. Agilent 7890 GC инжектор установлен при 250 ° С, со скоростью потока 1,4 мл / мин, и GC печь запрограммирован на начальной температуре 130 ° С, которая проходит в течение 1 мин. Впоследствии температуру увеличили 10 ° С / мин до 190 ° С, а затем увеличили еще раз на 5 ° C / мин до 210 ° С и выдерживают в течение 1 мин.
  10. Чтобы гарантировать, что поглощение DGLA произошло, анализировать Fames методом пламенной ионизации обнаружения (FID) или масс-спектрометрии обнаружения (MS), с использованием аутентичных стандартов для идентификации C. Элеганс жирных кислот.

Результаты

Дополнение от С. Элеганс диета ограничена способностью бактериального источника питания для поглощения и включать жирные кислоты в бактериальной мембраны. Для определения способности Е. палочка OP50 ассимилировать различных жирных кислот в мембранах его, OP50 высевали на носит...

Обсуждение

Здесь мы опишем метод добавок C. Элеганс с диетическими ненасыщенных жирных кислот. Как упоминалось выше, необходимо соблюдать осторожность при подготовке ПНЖК, дополненной пластин, так как реактивный характер двойных связей в ПНЖК вызывает эти жирные кислоты чувствительны к оки?...

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.

Благодарности

Мы благодарим Крис Вебстер для выполнения предварительных экспериментов показано на рисунке 3 представительных результатов и Джейсон Уоттс и Крис Вебстер за полезные замечания по рукописи. Финансирование данного исследования была предоставлена ​​за счет гранта от Национального института здоровья (США) (R01DK074114) в JLW. Некоторые штаммы нематод, используемые в этой работе были предоставлены Caenorhabditis генетический центр, который финансируется по NIH Управления научно-исследовательских программ в области инфраструктуры (P40 OD010440).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Bacto-AgarDifco214010
TryptoneDifco211705
NaClJ.T. Baker3624-05
TergitolSigmaNP40S-500mL
CholesterolSigmaC8667-25G(5 mg/mL in ethanol)
MgSO4J.T. Baker2504-01
CaCl2J.T. Baker1311-01
K2HPO4J.T. Baker3254-05
KH2PO4J.T. Baker3246-05
Sodium dihomogamma linolenateNuCHEKS-1143
Warm sterile Millipore water
Sterile water for collecting worms
Nuclease-free Water for DGLA stock solutionAmbionAM9932
AmpicillinFisher ScientificBP1760-25100 mg/ml in water (for RNAi plates)
Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)Gold Biotechnology12481C1001 M in water (for RNAi plates)
HSO4J.T. Baker9681-03
MethanolFisher ScientificA452-4
HexaneFisher ScientificH302-4
diamindinophenylindole (DAPI)SigmaD9542
VectaShieldVector LaboratoriesH-1000
Glass FlaskCorning4980-2L
Autoclaveable Glass bottles with stirbarsFisherbrandFB-800
Autoclaveable Glass Graduated CylinderFisherbrand08-557
Stir PlateVWR97042-642
Waterbath at 55+ °CPrecision Scientific Inc.66551
Screwcap Brown Glass VialSun SRI200 494
Argon gas tank
Automated Pipette aidPipette-AidP-90297
Sterile Serological Pipettes (25 ml)Corning4489
Bunsen BurnerVWR89038-534
Dissection microscopeLeicaTLB3000
Silanized glass tubeThermo ScientificSTT-13100-Sfor FAMEs derivitization
PTFE Screw capsKimble-Chase1493015D
Clinical tabletop centrifugeIEC
GC Crimp VialSUN SRi200 000
GC Vial InsertSUN SRi200 232
GC Vial capSUN SRi200 100
Gas ChromatographAgilent7890A
Mass Spectrometry DetectorAgilent5975C
Column for gas chromatographySuppelcoSP 238030 m x 0.25 mm fused silica capillary column

Ссылки

  1. Haeggstrom, J. Z., Funk, C. D. Lipoxygenase and leukotriene pathways: biochemistry, biology, and roles in disease. Chem. Rev. 111, 5866-5898 (2011).
  2. de Lorgeril, M., Salen, P. New insights into the health effects of dietary saturated and omega-6 and omega-3 polyunsaturated fatty acids. BMC Med. 10, 50 (2012).
  3. Spychalla, J. P., Kinney, A. J., Browse, J. Identification of an animal omega-3 fatty acid desaturase by heterologous expression in Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 1142-1147 (1997).
  4. Watts, J. L., Browse, J. Genetic dissection of polyunsaturated fatty acid synthesis in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5854-5859 (2002).
  5. Watts, J. L., Phillips, E., Griffing, K. R., Browse, J. Deficiencies in C20 Polyunsaturated Fatty Acids Cause Behavioral and Developmental Defects in Caenorhabditis elegans fat-3 Mutants. Genetics. 163, 581-589 (2003).
  6. Kahn-Kirby, A. H., et al. Specific Polyunsaturated Fatty Acids Drive TRPV-Dependent Sensory Signaling In Vivo. Cell. 119, 889-900 (2004).
  7. Brock, T. J., Browse, J., Watts, J. L. Genetic regulation of unsaturated fatty acid composition in C. elegans. PLoS Genet. 2, e108 (2006).
  8. Webster, C. M., Deline, M. L., Watts, J. L. Stress response pathways protect germ cells from omega-6 polyunsaturated fatty acid-mediated toxicity in Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 373, 14-25 (2013).
  9. Kadyk, L. C., Lambie, E. J., Kimble, J. glp-3 is required for mitosis and meiosis in the Caenorhabditis elegans germ line. Genetics. 145, 111-121 (1997).
  10. Watts, J. L., Browse, J. Dietary manipulation implicates lipid signaling in the regulation of germ cell maintenance in C. elegans. Dev. Biol. 292, 381-392 (2006).
  11. Pryor, W. A., Stanley, J. P., Blair, E. Autoxidation of polyunsaturated fatty acids: II. A suggested mechanism for the formation of TBA-reactive materials from prostaglandin-like endoperoxides. Lipids. 11, 370-379 (1976).
  12. Kniazeva, M., Shen, H., Euler, T., Wang, C., Han, M. Regulation of maternal phospholipid composition and IP(3)-dependent embryonic membrane dynamics by a specific fatty acid metabolic event in C. elegans. Genes Dev. 26, 554-566 (2012).
  13. Edmonds, J. W., et al. Insulin/FOXO signaling regulates ovarian prostaglandins critical for reproduction. Dev. Cell. 19, 858-871 (2010).
  14. O'Rourke, E. J., Kuballa, P., Xavier, R., Ruvkun, G. omega-6 Polyunsaturated fatty acids extend life span through the activation of autophagy. Genes Dev. 27, 429-440 (2013).
  15. Taubert, S., Van Gilst, M. R., Hansen, M., Yamamoto, K. R. A Mediator subunit, MDT-15, integrates regulation of fatty acid metabolism by NHR-49-dependent and -independent pathways in C. elegans. Genes Dev. 20, 1137-1149 (2006).
  16. Lesa, G. M., et al. Long chain polyunsaturated fatty acids are required for efficient neurotransmission in C. elegans. J. Cell Sci. 116, 4965-4975 (2003).
  17. Brock, T. J., Browse, J., Watts, J. L. Fatty acid desaturation and the regulation of adiposity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 176, 865-875 (2007).
  18. Goudeau, J., et al. Fatty acid desaturation links germ cell loss to longevity through NHR-80/HNF4 in C. elegans. PLoS Biol. 9, e1000599 (2011).
  19. Yang, F., et al. An ARC/Mediator subunit required for SREBP control of cholesterol and lipid homeostasis. Nature. 442, 700-704 (2006).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

81CaenorhabditisC63

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены