La supplémentation alimentaire en acides gras polyinsaturés dans<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Résumé

Caenorhabditis elegan est un modèle utile pour explorer les fonctions d'acides gras polyinsaturés dans le développement et la physiologie. Ce protocole décrit une méthode efficace de compléter la C. elegans alimentation avec des acides gras polyinsaturés.

Résumé

Les acides gras sont essentiels pour de nombreuses fonctions cellulaires. Ils servent molécules de stockage d'énergie efficaces, forment le noyau hydrophobe des membranes, et de participer à diverses voies de signalisation. Caenorhabditis elegans synthétise toutes les enzymes nécessaires pour produire une gamme d'acides gras oméga-6 et oméga-3 acides gras. Ceci, combiné avec la simple anatomie et la gamme d'outils génétiques disponibles, en font un modèle intéressant pour étudier la fonction des acides gras. Afin d'étudier les voies génétiques qui assurent la médiation des effets physiologiques des acides gras alimentaires, nous avons mis au point un procédé pour compléter l'C. alimentation elegans avec des acides gras insaturés. La supplémentation est un moyen efficace pour modifier la composition en acides gras de vers et peut également être utilisé pour sauver les défauts de mutants déficients en acides gras. Notre méthode utilise la croissance à moyen agar nématode (NGM) additionné de sels gras de acidsodium. Les acides gras présents dans les plaques deviennent incorporation complétéested dans les membranes de la source d'alimentation bactérienne, qui est ensuite reprise par le C. elegans qui se nourrissent de bactéries complétées. Nous décrivons également un protocole de Chromatographie en phase gazeuse pour contrôler les changements dans la composition d'acide gras qui se produisent dans les vers complétés. C'est un moyen efficace de compléter les régimes de grandes et de petites populations de C. elegans, permettant une gamme d'applications de cette méthode.

Introduction

Les acides gras sont des composants structurels essentiels des membranes ainsi que des molécules de stockage d'énergie efficace. En outre, les acides gras peuvent être clivés à partir de membranes cellulaires par des lipases et peuvent être modifiées par voie enzymatique pour produire des effecteurs de signalisation ^1. D'origine naturelle des acides gras polyinsaturés (AGPI) contiennent deux ou plusieurs doubles liaisons cis. Les acides gras oméga-3 acides gras et les acides gras oméga-6 se distinguent l'une de l'autre sur la base des positions des doubles liaisons par rapport à l'extrémité méthyle de l'acide gras. Une alimentation saine exigent à la fois acides gras oméga-6 et oméga-3 acides gras. Cependant, les régimes occidentaux sont particulièrement riches en acides gras oméga-6 acides gras et pauvres en oméga-3 acides gras. Une haute teneur en oméga-6 et oméga-3 ratio d'acide gras est associée à un risque accru de maladies cardiovasculaires et inflammatoires, cependant, les fonctions bénéfiques et nuisibles précis d'acides gras spécifiques ne sont pas bien comprises ^2. Les ascaris elega Caenorhabditisns est utile pour étudier la fonction des acides gras, car il synthétise toutes les enzymes nécessaires pour produire une gamme d'acides gras oméga-6 et oméga-3 acides gras, y compris une oméga 3 désaturase, une activité qui est absente dans la plupart des animaux ^3,4. Mutants dépourvus enzymes désaturase d'acide gras ne parviennent pas à produire des PUFA spécifiques, conduisant à une série de défauts de développement et neurologiques ^4-6.

Pour étudier les effets physiologiques des acides gras alimentaires, nous avons développé un dosage biochimique compatible avec l'analyse génétique en utilisant les deux techniques knock-down ARNi mutant et C. elegans. La supplémentation avec des PUFA spécifiques est obtenue en ajoutant une solution de sel de sodium d'acide gras dans le milieu d'agar avant la coulée. Cela se traduit par l'absorption par le PUFA E. source de nourriture coli, où il s'accumule dans les membranes bactériennes. C. elegans ingèrent les bactéries contenant des AGPI, et ce complément alimentaire est suffisante pour sauver le défectueuxts de mutants déficients en AGPI. La supplémentation de la plupart des acides gras n'a pas d'effets néfastes sur les animaux de type sauvage, cependant, oméga-6 acides gras spécifiques, en particulier l'acide dihomo-gamma-linolénique (DGLA, 20:03 n-6) causer une destruction permanente de C. elegans cellules germinales ^7,8.

Chromatographie en phase gazeuse est utilisé pour surveiller l'absorption de l'acide gras complétée dans la source de nourriture bactérienne (soit OP50 ou HT115), ainsi que dans les nématodes. L'addition du Tergitol de détergent (NP-40) dans le support permet d'obtenir une distribution uniforme des acides gras à travers toute la plaque et l'utilisation plus efficace des acides gras par le E. coli et les nématodes. Nous avons découvert que les acides gras insaturés sont facilement absorbés par les bactéries et C. elegans, mais l'absorption d'acides gras saturés est beaucoup moins efficace. Cet article décrit étape par étape comment compléter les médias agar avec des acides gras, ainsi que la façon de contrôler l'absorption des acides gras dans le ee nématode par chromatographie en phase gazeuse.

Protocole

Les acides gras polyinsaturés sont sensibles à la chaleur, la lumière et l'oxygène. Par conséquent, des précautions doivent être prises lors de la préparation de plaques de supplémentation d'acides gras tels que les acides gras ne sont pas exposés à une chaleur excessive et de la lumière. NGM support contenant 0,1% de Tergitol (NP-40) sont passés à l'autoclave et partiellement refroidies, après quoi les sels de sodium d'acides gras sont ajoutés sous agitation constante. Les plaques sont laissées à sécher à l'obscurité. L'absorption des acides gras par C. elegans cultivé sur ces plaques peut alors être surveillé par Chromatographie en phase gazeuse.

Une. Préparation des acides gras Supplement médias

1. Mesurer composants multimédia dans un ballon de taille appropriée. Par 1 L, ajouter 17 g de Bacto-agar, 2,5 g de tryptone, 3 g de NaCl, 1 ml 5 mg / ml de cholestérol dissous dans de l'éthanol, et 10 ml de 10% Tergitol dissous dans l'eau.
2. Ajouter 80% du volume final souhaité de l'eau Millipore et l'autoclave les médias ainsi que des bouteilles de verre vide (égal au nombre de différentsLes concentrations d'acides gras à tester), ainsi que des éprouvettes graduées appropriées.
3. Médias refroidir dans un bain-marie réglé à 55 ° C. Bien que le milieu est refroidit à préparer la solution de travail de réserve de sel de sodium d'acide gras en brisant ouvert le flacon de verre, en utilisant des mesures de sécurité et d'assurer des particules de verre ne se mélangent pas avec les acides gras. Peser suffisamment d'acide gras pour faire un stock de travail 100 mM.
4. Porter la solution d'acide gras à une concentration finale de 100 mM avec de l'eau purifiée. Dissoudre entièrement le sel de sodium d'acide gras prend généralement environ 20 à 30 min. Purger le stock de travail d'acide gras avec de l'argon ou de l'azote, parce que le contact avec un gaz inerte empêche l'oxydation. Boucher le flacon et stocker le stock de travail dans l'obscurité jusqu'à ce que les médias aient refroidi.
5. (Facultatif) Si ARNi médias est souhaitée, de mesurer l'ampicilline et isopropilene β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) solutions ici.
6. Lorsque la gélose est refroidie à 55 ° C, ajouter par 1 L: 1ml de 1 M MgSO _4, 1 ml de 1 M de _CaCl2, et de 25 ml de tampon phosphate (108,3 g KH ₂ PO ₄ et de 35,6 g de K ₂ HPO ₄ pour 1 L à l'autoclave). Ajouter le filtre stérilisé ampicilline et solutions IPTG si la fabrication de plaques de RNAi. Pour tous les types de plaques, ajouter de l'eau stérile pour porter le volume de médias final à 1 L.
7. Près d'une flamme, transférer des médias à une autoclave et taille appropriée éprouvette graduée puis ajouter de l'eau chaude stérile au volume désiré. Transfert médias retour au flacon initial et mélanger en remuant.
8. Près d'une flamme, transférer médias dans un certain nombre de bouteilles égal au nombre de concentrations à tester en mesurant avec un autoclave et de taille appropriée éprouvette graduée. Maintenir les médias aliquotés comme liquide en utilisant un bain d'eau jusqu'à ce que le stock de travail d'acide gras a entièrement dissous.
9. Placez une bouteille sur une plaque d'agitation et remuer jusqu'à ce que le support est chaud au toucher, mais pas chaud. Assurez-vous de vous laisser assez detemps à remuer dans la solution mère d'acide gras et versez plaques devant les médias commence à se solidifier. Si la plaque d'agitation a le contrôle de la température, réglez-le à 55 ° C.
10. Diluer le stock de travail d'acide gras de 100 mM dans le milieu de la concentration finale souhaitée. médias Remuer jusqu'à ce que le précipité blanc est en solution (environ 1 min). Les médias peuvent encore être légèrement nuageux par la suite.
11. (Facultatif) Si l'on souhaite ARNi médias retenir l'ampicilline à 0,1 mg / ml et 2 mM d'IPTG à une concentration finale.
12. Verser médias utilisant une aide de la pipette automatique et une aiguille stérile de 25 ml pipette, en ajoutant 8 ml de milieu par 60 mm plaque ou 25 ml de milieu par plaque de 100 mm. Répéter addition d'acide gras et de la plaque de coulée étapes pour les bouteilles restantes.
13. Après solidification de la gélose, couvrir les plaques d'acides gras supplémenté avec une boîte ou un magasin à la température ambiante dans un tiroir bien ventilé à l'abri de l'oxydation de la lumière.
14. Graine E. coli OP50 sur des plaques, deux jours après les plaques ont séchées.Pour les plaques de 60 mm, une pipette 300 ul d'une culture d'une nuit OP50 (cultivée à 37 ° C). Si les plaques d'ARNi ont été versés, semences avec 300 pi de bactéries ARNi après les plaques ont séché pendant quatre jours. Plate temps de séchage peut être nécessaire de modifier en raison des différences d'humidité dans divers environnements de laboratoire.
15. Incuber les plaques dans un environnement sombre à la température ambiante pendant la pelouse bactérienne est le séchage.

2. Induire la destruction des cellules germinales par la supplémentation de DGLA

1. C. elegans cultivées sur des plaques contenant mM DGLA 0,3 (20h03 n-6) deviennent stériles à cause de la destruction des cellules germinales dans les deux nématodes de la scène et adultes larvaires.
   1. Préparer une population synchronisée des larves L1 en traitant hermaphrodites gravides avec une solution d'hypochlorite alcalin (pour une solution à 10 ml: 0,5 ml de NaOH 5M, 2,5 ml d'eau de Javel, et 7 ml H ₂ O). Secouez délicatement les hermaphrodites gravides dans cette solution jusqu'à ce que le ver adultes dissoudre. Les œufs sont conservés, et peuvent être rassemblées en un culot par centrifugation à faible vitesse.
   2. Laver la préparation d'oeuf 3 fois dans du tampon M9 (3 g KH ₂ PO _4, 6 g de Na ₂ HPO _4, 5 g de NaCl, 1 ml 1 M MgSO _4, H ₂ O de 1 L. Ajouter MgSO _4, après passage à l'autoclave). Afin de fournir suffisamment d'oxygène, de remettre en suspension les oeufs dans un tube en plastique de 15 ml à un volume final de 5 ml de tampon M9 et de la roche sur un agitateur pendant une nuit.
   3. Larves L1 doit être ajouté aux plaques supplémenté deux jours après l'ensemencement avec OP50, ou un jour après l'étalement des bactéries d'ARNi. Incuber les vers à 20 ° C pendant trois jours, ou jusqu'à ce qu'ils atteignent le stade adulte.
2. Les vers adultes peuvent être marqués de la stérilité en utilisant un microscope à dissection avec un grossissement assez haut pour visualiser le développement des embryons dans l'utérus. Succès la perte de cellules germinales apparaît comme un vide de l'utérus clair des œufs.
3. Les vers peuvent également être marqués par la fixation et coloration avec l'acide nucléique d'uncid colorant diamindinophenylindole (DAPI), ce qui facilite la visualisation des noyaux dans les cellules germinales et les embryons en développement. Une tache de DAPI rapide est réalisé par la cueillette vers dans une goutte de tampon M9 sur un verre de montre ^9.
   1. Flood verre de montre avec 1 ml de 0,2 ng / m. DAPI dans une solution d'éthanol à 95%, laisser reposer pendant environ 5 min.
   2. Choisissez vers dans une goutte de Vectashield sur une lame, puis couvrir avec une lamelle.
   3. lamelle de Seal et conserver à 4 ° C dans l'obscurité pendant une nuit pour la coloration optimale, mais les diapositives peuvent également être consulté immédiatement. Note pour la présence ou l'absence de noyaux de cellules germinales à l'aide d'un microscope à fluorescence équipé d'une lampe UV et filtre.

3. Confirmant acides gras absorption par chromatographie en phase gazeuse

Composition de C d'acides gras globale elegans peuvent être déterminées par la production d'esters méthyliques d'acides gras (FAME) qui sont ensuite séparés et quantifiés à l'aide de gaz chromatography ^4.

1. Recueillir 500-1000 vers adultes en les lavant hors des plaques avec de l'eau et de transférer à un 13 mm x 100 mm tube supérieur de vis de verre silanisée.
2. Laissez vers déposent par gravité, puis retirez autant d'eau que possible avec une pipette Pasteur en verre.
3. Laver avec de l'eau une fois vers, puis retirez à nouveau autant d'eau que possible.
4. FAMEs sont formées en ajoutant 1 ml de 2,5% de H ₂ SO ₄ dans le méthanol, puis chauffage à 70 ° C pendant 1 heure dans un bain d'eau.
5. Enlever les tubes du bain d'eau et de refroidir pendant 1 min.
6. Extrait FAMEs en ajoutant 1,5 ml d'eau et 0,25 ml d'hexane.
7. tubes de reboucher et agiter vigoureusement.
8. Tubes à centrifuger dans une centrifugeuse clinique de table pendant 1 min à vitesse maximale pour séparer l'hexane de solvant aqueux.
9. Transfert hexane (couche supérieure) pour un insert GC flacon dans un flacon de GC, en faisant attention à ne pas transférer de la phase aqueuse. Pour un GCnalyse, 1-2 pi de FAME à l'hexane est injecté sur une colonne de chromatographie en phase gazeuse capillaire polaire adapté pour l'analyse des FAME. Injecteur de GC Agilent 7890 est fixée à 250 ° C, avec un débit de 1,4 ml / min, et le four de GC est programmé pour une température initiale de 130 ° C qui est maintenue pendant 1 min. Par la suite, la température est en rampe de 10 ° C / min jusqu'à 190 ° C, puis de nouveau en rampe à 5 ° C / min jusqu'à 210 ° C et maintenue pendant 1 min.
10. Pour faire en sorte que l'absorption de DGLA a eu lieu, l'analyse FAME de détection de ionisation de flamme (FID) ou la spectrométrie de masse (MS) la détection, en utilisant des étalons authentiques pour l'identification de l'C. elegans acides gras.

Résultats

La supplémentation de la C. elegans alimentation est limitée par la capacité de la source d'alimentation à l'absorption de bactéries et d'incorporer des acides gras dans la membrane bactérienne. Pour déterminer la capacité de E. coli OP50 à assimiler différents acides gras dans ses membranes, OP50 a été plaqué sur des supports sans supplément, 0,1 mM et les concentrations mM 0,3 d'acide stéarique (18h00), l'oléate de sodium (18:1 n-9), et le sodium DGLA (20 : 3n-6). ...

Discussion

Ici, nous décrivons une méthode de supplémentation de C. elegans avec des acides gras insaturés alimentaires. Comme mentionné ci-dessus, il faut prendre soin dans la préparation de plaques PUFA supplémenté en raison de la nature réactive des doubles liaisons dans les acides gras polyinsaturés des causes de ces acides gras pour être sensible à l'oxydation par la chaleur et de la lumière ^11. Pour éviter l'oxydation, il est important d'ajouter le PUFA dans le milieu de gélose ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bacto-Agar	Difco	214010
Tryptone	Difco	211705
NaCl	J.T. Baker	3624-05
Tergitol	Sigma	NP40S-500mL
Cholesterol	Sigma	C8667-25G	(5 mg/mL in ethanol)
MgSO4	J.T. Baker	2504-01
CaCl2	J.T. Baker	1311-01
K2HPO4	J.T. Baker	3254-05
KH2PO4	J.T. Baker	3246-05
Sodium dihomogamma linolenate	NuCHEK	S-1143
Warm sterile Millipore water
Sterile water for collecting worms
Nuclease-free Water for DGLA stock solution	Ambion	AM9932
Ampicillin	Fisher Scientific	BP1760-25	100 mg/ml in water (for RNAi plates)
Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)	Gold Biotechnology	12481C100	1 M in water (for RNAi plates)
HSO4	J.T. Baker	9681-03
Methanol	Fisher Scientific	A452-4
Hexane	Fisher Scientific	H302-4
diamindinophenylindole (DAPI)	Sigma	D9542
VectaShield	Vector Laboratories	H-1000
Glass Flask	Corning	4980-2L
Autoclaveable Glass bottles with stirbars	Fisherbrand	FB-800
Autoclaveable Glass Graduated Cylinder	Fisherbrand	08-557
Stir Plate	VWR	97042-642
Waterbath at 55+ °C	Precision Scientific Inc.	66551
Screwcap Brown Glass Vial	Sun SRI	200 494
Argon gas tank
Automated Pipette aid	Pipette-Aid	P-90297
Sterile Serological Pipettes (25 ml)	Corning	4489
Bunsen Burner	VWR	89038-534
Dissection microscope	Leica	TLB3000
Silanized glass tube	Thermo Scientific	STT-13100-S	for FAMEs derivitization
PTFE Screw caps	Kimble-Chase	1493015D
Clinical tabletop centrifuge	IEC
GC Crimp Vial	SUN SRi	200 000
GC Vial Insert	SUN SRi	200 232
GC Vial cap	SUN SRi	200 100
Gas Chromatograph	Agilent	7890A
Mass Spectrometry Detector	Agilent	5975C
Column for gas chromatography	Suppelco	SP 2380	30 m x 0.25 mm fused silica capillary column