La suplementación dietética de ácidos grasos poliinsaturados en<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Resumen

Caenorhabditis elegan es un modelo útil para explorar las funciones de los ácidos grasos poliinsaturados en el desarrollo y la fisiología. Este protocolo describe un método eficiente de complementar la C. elegans la dieta con ácidos grasos poliinsaturados.

Resumen

Los ácidos grasos son esenciales para muchas funciones celulares. Sirven moléculas de almacenamiento de energía en forma eficiente, constituyen el núcleo hidrofóbico de las membranas, y participar en las diversas vías de señalización. Caenorhabditis elegans sintetiza todas las enzimas necesarias para producir una gama de ácidos grasos omega-6 y omega-3 los ácidos grasos. Esto, combinado con la simple anatomía y la gama de herramientas genéticas disponibles, lo convierten en un modelo atractivo para estudiar la función del ácido graso. Con el fin de investigar las vías genéticas que median en los efectos fisiológicos de los ácidos grasos de la dieta, hemos desarrollado un método para complementar la C. elegans dieta con ácidos grasos insaturados. La suplementación es un medio eficaz para alterar la composición de ácidos grasos de gusanos y también se puede utilizar para rescatar los defectos en los mutantes deficientes en ácido grasos. Nuestro método utiliza el crecimiento medio de agar nematodo (NGM) suplementado con sales de acidsodium graso. Los ácidos grasos en las placas suplementadas se convierten en incorporaciónTed en las membranas de la fuente de alimento bacteriana, que luego es absorbido por la C. elegans que se alimentan de las bacterias suplementadas. También se describe un protocolo de cromatografía de gases para monitorear los cambios en la composición de ácidos grasos que se producen en los gusanos suplementados. Esta es una manera eficaz para complementar las dietas de las poblaciones grandes y pequeñas de C. elegans, lo que permite una gama de aplicaciones para este método.

Introducción

Los ácidos grasos son componentes estructurales esenciales de las membranas, así como moléculas de almacenamiento de energía eficiente. Adicionalmente, los ácidos grasos pueden ser escindidos a partir de membranas celulares por las lipasas y pueden modificar enzimáticamente para producir efectores de señalización ^1. De origen natural los ácidos grasos poliinsaturados (PUFAs) contienen dos o más enlaces dobles cis. Los ácidos grasos omega-3 y los ácidos grasos omega-6 se distinguen unos de otros sobre la base de las posiciones de los dobles enlaces con respecto al extremo metilo del ácido graso. Las dietas saludables requieren tanto de omega-6 y ácidos grasos omega-3. Sin embargo, las dietas occidentales son especialmente ricos en ácidos grasos omega-6 y pobres en ácidos grasos omega-3. Un alto contenido de omega-6 proporción de ácidos grasos omega-3 que se asocia con un mayor riesgo de enfermedades cardiovasculares e inflamatorias, sin embargo, las funciones beneficiosas y perjudiciales precisas de ácidos grasos específicos no se conocen bien ^2. Las lombrices intestinales Elega Caenorhabditisns es útil en el estudio de la función de ácido graso, ya que sintetiza todas las enzimas necesarias para producir una gama de ácidos grasos omega-6 y omega-3 grasos, incluyendo una desaturasa omega-3, una actividad que está ausente en la mayoría de los animales ^3,4. Los mutantes que carecen de las enzimas ácido graso desaturasa fallan para producir PUFA específicos, dando lugar a una serie de defectos en el desarrollo y neurológicos ^4-6.

Para estudiar los efectos fisiológicos de los ácidos grasos de la dieta, hemos desarrollado un ensayo bioquímico compatible con el análisis genético utilizando tanto técnicas de derribo de RNAi mutante y en C. elegans. La suplementación con PUFA específicos se logra mediante la adición de una solución de sal de sodio de ácido graso para el medio de agar antes de verter. Esto resulta en la absorción de ácidos grasos poliinsaturados por el E. fuente de alimento coli, donde se acumula en las membranas bacterianas. C. elegans ingieren las bacterias que contienen PUFA, y esto los suplementos dietéticos es suficiente para rescatar el defectuosoct de mutantes deficientes en ácidos grasos poliinsaturados. La suplementación de la mayoría de los ácidos grasos no tiene efectos perjudiciales sobre los animales de tipo salvaje, sin embargo, los ácidos grasos específicos de omega-6, especialmente el ácido dihomo-gamma-linolénico (DGLA, 20:03 n-6) causar una destrucción permanente de C. células germinales elegans ^7,8.

La cromatografía de gases se utiliza para controlar la absorción del ácido graso complementado en la fuente de alimento bacteriana (ya sea OP50 o HT115), así como en los nematodos. La adición de la Tergitol detergente (NP-40) en los medios de comunicación permite una distribución uniforme de los ácidos grasos a través de la placa entera y la absorción más eficiente de los ácidos grasos por la E. coli y los nematodos. Hemos encontrado que los ácidos grasos insaturados son fácilmente absorbidos por las bacterias y C. elegans, pero la absorción de ácidos grasos saturados es mucho menos eficiente. Este artículo describirá paso a paso cómo complementar los medios de agar con ácidos grasos, así como la forma de controlar la absorción de ácidos grasos en the nematodo mediante cromatografía de gases.

Protocolo

Los ácidos grasos poliinsaturados son sensibles al calor, la luz y el oxígeno. Por lo tanto, se debe tener cuidado en la preparación de platos de suplementos de ácidos grasos tales que los ácidos grasos no están expuestos a un exceso de calor y luz. Medios NGM que contienen 0,1% de Tergitol (NP-40) se trata en autoclave y se enfría parcialmente, después de lo cual las sales de sodio de ácidos grasos se añaden con agitación constante. Las placas se dejaron secar en la oscuridad. La absorción de los ácidos grasos por C. elegans cultivadas en estas placas a continuación pueden ser monitoreados mediante cromatografía de gases.

1. Preparación de ácido graso medio suplementado

1. Medir los componentes del medio en un matraz de tamaño adecuado. Por 1 L, añadir 17 g de Bacto-agar, 2,5 g de triptona, 3 g de NaCl, 1 ml de colesterol 5 mg / ml disuelto en etanol, y 10 ml de 10% de Tergitol disuelto en agua.
2. Añadir 80% del volumen final deseado de agua Millipore y se esterilice en autoclave a lo largo de los medios de comunicación con las botellas de vidrio vacía (igual al número de diferentesconcentraciones de ácidos grasos a ensayar), así como apropiado cilindros graduados.
3. Medios de enfriar en un baño de agua a 55 ° C. Mientras que los medios de comunicación se está enfriando preparar la solución madre de trabajo de la sal sódica del ácido graso rompiendo abierto el vial de vidrio, utilizando las medidas de seguridad y la garantía de las partículas de vidrio no se mezclan con los ácidos grasos. Pesar ácido graso suficiente para hacer una reserva de trabajo 100 mM.
4. Se lleva la solución de ácido graso a una concentración final de 100 mM con agua purificada. Disolver completamente la sal sódica del ácido graso suele tardar unos 20-30 min. Se purga la solución de trabajo de ácido graso con argón o nitrógeno, porque el contacto con un gas inerte impide la oxidación. Se tapa el vial y almacenar el inventario de trabajo en la oscuridad hasta que los medios de comunicación se ha enfriado.
5. (Opcional) Si se desea medios RNAi, medir la ampicilina y isopropileos β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) soluciones aquí.
6. Cuando el agar se ha enfriado a 55 ° C por 1 L de añadir: 1ml de 1 M _MgSO4, 1 ml de 1 M de CaCl _2, y 25 ml de tampón de fosfato (108,3 g de KH ₂ PO ₄ y 35,6 g de K ₂ HPO ₄ por 1 L de autoclave). Agregue la ampicilina esterilizada filtro y soluciones IPTG si hacer las placas de RNAi. Para todos los tipos de placas, añadir agua estéril para llevar el volumen final a los medios de comunicación 1 L.
7. Cerca de una llama, transferir multimedia a un autoclave y de tamaño apropiado cilindro graduado y luego añadir agua estéril caliente al volumen deseado. Traslado de regreso a los medios de comunicación frasco inicial y mezclar por agitación.
8. Cerca de una llama, la transferencia de los medios de comunicación en un número de botellas igual al número de concentraciones a ensayar midiendo con un autoclave y de tamaño apropiado cilindro graduado. Mantener las alícuotas de medios como líquido usando un baño de agua hasta que la solución de trabajo de ácidos grasos ha disuelto completamente.
9. Coloque una botella sobre una placa de agitación y revuelo hasta que los medios de comunicación es caliente al tacto, pero no caliente. Asegúrese de dejar lo suficientetiempo para agitar en la solución madre de ácido graso y verter en las placas antes de los medios de comunicación comienza a solidificarse. Si placa de agitación tiene control de temperatura, ajústelo a 55 ° C.
10. Diluir la solución de trabajo de ácido graso 100 mM en los medios de comunicación para la concentración final deseada. Medios Revuelva hasta que el precipitado blanco se encuentra en solución (aproximadamente 1 minuto). Medios todavía pueden ser ligeramente turbia después.
11. (Opcional) Si los medios de comunicación de RNAi se desea añadir ampicilina a 0,1 mg / ml e IPTG a 2 mM de concentración final.
12. Vierta multimedia mediante una ayuda de la pipeta automática y una pipeta estéril ml 25, la adición de 8 ml de medio por placa de 60 mm o 25 ml de medio por placa de 100 mm. Repita adición de ácido graso y la placa de vertido pasos para las botellas restantes.
13. Después de que el agar se haya solidificado, cubrir las placas de ácidos grasos-complementado con una caja o almacenar a temperatura ambiente en un cajón bien ventilado para protegerlo de la oxidación de la luz.
14. Semilla E. OP50 coli sobre placas de dos días después de placas se han secado.Para placas de 60 mm, de pipeta 300 l de un cultivo durante la noche OP50 (crecido a 37 ° C). Si se vertieron placas de RNAi, semilla con 300 l de bacterias RNAi después las placas se han secado durante cuatro días. Puede ser necesario ajustar debido a las diferencias en la humedad en diversos entornos de laboratorio Placa tiempo de secado.
15. Incubar las placas en un ambiente oscuro, a temperatura ambiente, mientras que el césped bacteriano se está secando.

2. Inducir Germ destrucción celular por suplementación de DGLA

1. C. elegans cultivadas en placas que contienen mM DGLA 0,3 (20:03 n-6) se vuelven estériles debido a la destrucción de las células germinales en ambos nematodos adultos y de larvas de etapa.
   1. Preparar una población sincronizada de larvas L1 mediante el tratamiento de los hermafroditas grávidas con solución de hipoclorito alcalina (para una solución de 10 ml: 0,5 ml de NaOH 5 M, 2,5 ml de lejía doméstica, y 7 ml de _H2O). Mueva suavemente los hermafroditas grávidas en esta solución hasta que el gusano adultos se disuelven. Los huevos se conservan y se pueden sedimentaron por centrifugación a baja velocidad.
   2. Lavar la preparación de huevo 3 veces en tampón M9 (3 g de KH ₂ PO _4, 6 g de Na ₂ HPO _4, 5 g de NaCl, 1 ml de 1 M _MgSO4, H ₂ O a 1 L. Añadir _MgSO4 después de la esterilización en autoclave). Para proporcionar el oxígeno suficiente, volver a suspender los huevos en un tubo de plástico de 15 ml a un volumen final de 5 ml de tampón M9 y el rock en un agitador durante la noche.
   3. Larvas L1 debe ser añadido a las placas suplementadas dos días después de la siembra con OP50, o un día después en placas de las bacterias de RNAi. Incubar gusanos a 20 ° C durante tres días o hasta que alcanzan el estado adulto.
2. Los gusanos adultos se pueden calificar de esterilidad usando un microscopio de disección con suficiente alto aumento para visualizar los embriones en desarrollo en el útero. El éxito de la pérdida de células germinales aparecerá como un claro vacío útero de huevos.
3. Los gusanos también pueden ser marcados mediante la fijación y la tinción con la nucleico unacid colorante diamindinophenylindole (DAPI), lo que facilita la visualización de los núcleos en las células germinales y embriones en desarrollo. Una mancha DAPI rápida se consigue recogiendo los gusanos en una gota de tampón M9 en un vidrio de reloj ^9.
   1. Flood vidrio de reloj con 1 ml de una 0,2 ng / m. DAPI en solución de etanol al 95%, deje reposar durante aproximadamente 5 min.
   2. Elige gusanos en una gota de VectaShield en una diapositiva, y luego cubra con un cubreobjetos.
   3. Cubreobjetos Seal y almacenar a 4 ° C en la noche oscura para la tinción óptima, sin embargo diapositivas también se pueden ver inmediatamente. Puntuación para la presencia o ausencia de núcleos de células germinales utilizando un microscopio de fluorescencia equipado con una lámpara UV y filtro.

3. Confirmación de ácidos grasos captación por cromatografía de gases

Composición de ácido graso total de C. elegans se pueden determinar mediante la producción de ésteres metílicos de ácidos grasos (FAMEs), que después se separan y cuantifican usando CHR de gasomatography ^4.

1. Recoger 500-1.000 gusanos adultos lavándolas fuera de las placas con agua y transferir a un 13 mm x 100 mm tubo de tapón de rosca de vidrio silanizado.
2. Deje que los gusanos se depositan por gravedad, y luego eliminar la mayor cantidad de agua posible con una pipeta Pasteur de vidrio.
3. Lavar los gusanos una vez con agua, y luego otra vez eliminar la mayor cantidad de agua posible.
4. FAME se forman mediante la adición de 1 ml de 2,5% de H ₂ SO ₄ en metanol, y después de calentar a 70 ° C durante 1 hora en un baño de agua.
5. Retire los tubos del baño de agua y enfriar durante 1 min.
6. Extraer FAME mediante la adición de 1,5 ml de agua y 0,25 ml de hexano.
7. Crónica tubos y agitar vigorosamente.
8. Tubos centrífuga en una centrífuga clínica de sobremesa durante 1 min a velocidad máxima para separar hexano de disolvente acuoso.
9. Traslado hexano (capa superior) para una inserción GC vial dentro de un vial GC, teniendo cuidado de no transferir ninguno de la fase acuosa. Para GC unnálisis, 1-2 l de FAME en hexano se inyectó en una columna de cromatografía de gas capilar polar adecuado para el análisis FAME. El Agilent 7890 GC inyector se fijó en 250 ° C, con una velocidad de flujo de 1,4 ml / min, y el horno del GC se programa para una temperatura inicial de 130 ° C, que se mantuvo durante 1 min. Posteriormente, se aumenta la temperatura 10 ° C / min hasta 190 ° C, y luego en rampa de nuevo a 5 º C / min hasta 210 ° C y se mantuvo durante 1 min.
10. Para asegurarse de que se ha producido la absorción de DGLA, analizar FAME por ionización de llama de detección (FID) o espectrometría de masas (MS) de detección, usando patrones auténticos para la identificación de la C. elegans ácidos grasos.

Resultados

La suplementación de la C. dieta elegans está limitada por la capacidad de la fuente de alimento de las bacterias a la absorción e incorporar los ácidos grasos en la membrana bacteriana. Para determinar la capacidad de E. OP50 coli para asimilar diversos ácidos grasos en sus membranas, OP50 se cultivó en placas sobre medios con ningún suplemento, 0,1 mM y concentraciones de 0,3 mM de ácido esteárico (18:0), oleato de sodio (18:1 n-9), y el DGLA de sodio (20 : 3n-6). Las placa...

Discusión

Aquí se describe un método para la suplementación de C. elegans con ácidos grasos insaturados. Como se mencionó anteriormente, se debe tener cuidado en la preparación de platos PUFA complementados porque la naturaleza reactiva de los dobles enlaces en PUFAs hace que estos ácidos grasos para ser sensibles a la oxidación a través del calor y de la luz ^11. Para evitar la oxidación, es importante agregar el PUFA al medio de agar líquido después de los medios de comunicación se ha enfriado a ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bacto-Agar	Difco	214010
Tryptone	Difco	211705
NaCl	J.T. Baker	3624-05
Tergitol	Sigma	NP40S-500mL
Cholesterol	Sigma	C8667-25G	(5 mg/mL in ethanol)
MgSO4	J.T. Baker	2504-01
CaCl2	J.T. Baker	1311-01
K2HPO4	J.T. Baker	3254-05
KH2PO4	J.T. Baker	3246-05
Sodium dihomogamma linolenate	NuCHEK	S-1143
Warm sterile Millipore water
Sterile water for collecting worms
Nuclease-free Water for DGLA stock solution	Ambion	AM9932
Ampicillin	Fisher Scientific	BP1760-25	100 mg/ml in water (for RNAi plates)
Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)	Gold Biotechnology	12481C100	1 M in water (for RNAi plates)
HSO4	J.T. Baker	9681-03
Methanol	Fisher Scientific	A452-4
Hexane	Fisher Scientific	H302-4
diamindinophenylindole (DAPI)	Sigma	D9542
VectaShield	Vector Laboratories	H-1000
Glass Flask	Corning	4980-2L
Autoclaveable Glass bottles with stirbars	Fisherbrand	FB-800
Autoclaveable Glass Graduated Cylinder	Fisherbrand	08-557
Stir Plate	VWR	97042-642
Waterbath at 55+ °C	Precision Scientific Inc.	66551
Screwcap Brown Glass Vial	Sun SRI	200 494
Argon gas tank
Automated Pipette aid	Pipette-Aid	P-90297
Sterile Serological Pipettes (25 ml)	Corning	4489
Bunsen Burner	VWR	89038-534
Dissection microscope	Leica	TLB3000
Silanized glass tube	Thermo Scientific	STT-13100-S	for FAMEs derivitization
PTFE Screw caps	Kimble-Chase	1493015D
Clinical tabletop centrifuge	IEC
GC Crimp Vial	SUN SRi	200 000
GC Vial Insert	SUN SRi	200 232
GC Vial cap	SUN SRi	200 100
Gas Chromatograph	Agilent	7890A
Mass Spectrometry Detector	Agilent	5975C
Column for gas chromatography	Suppelco	SP 2380	30 m x 0.25 mm fused silica capillary column