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要約

の線虫のエレガンはは、開発と生理学で多価不飽和脂肪酸の機能を探求するための有用なモデルである。このプロトコルは、の Cを補充する効率的な方法を説明します虫の多価不飽和脂肪酸とダイエット。

要約

脂肪酸は、非常に多くの細胞機能に必須である。それらは、膜の疎水性コアを構成し、効率的なエネルギー貯蔵分子を提供し、種々のシグナル伝達経路に関与する。 線虫（Caenorhabditis elegans）は、オメガ-6及びオメガ-3脂肪酸の範囲を生成するのに必要な酵素の全てを合成する。これは、簡単な解剖学および利用可能な遺伝的手段の範囲と組み合わせると、脂肪酸の機能を研究するための魅力的なモデルにする。食餌性脂肪酸の生理学的効果を媒介する遺伝的経路を調べるために、我々はC.を補足する方法を開発した不飽和脂肪酸とエレガンスダイエット。補充は、ワームの脂肪酸組成を変化させる有効な手段であり、また、脂肪酸欠損変異体における欠損をレスキューするために使用することができる。我々の方法は、脂肪acidsodium塩を補充した線虫の増殖培地寒天（NGM）を使用しています。 incorporaなっ補足プレート中の脂肪酸次いで、C.によって取り込まれる細菌の食物源の膜へテッド補足細菌を餌虫 。また、補充ワームで発生する脂肪酸組成の変化を監視するために、ガスクロマトグラフィープロトコルを記載している。これはCの大小の集団の食生活を補完する効率的な方法です虫 、このメソッドの応用範囲を可能にする。

概要

脂肪酸は膜の必須構造成分、ならびに効率的なエネルギー貯蔵分子である。さらに、脂肪酸は、リパーゼにより細胞膜から切断することができ、酵素的にシグナル伝達エフェクター1を産生するように改変することができる。天然に存在する多価不飽和脂肪酸（PUFA）は、二つまたはそれ以上のシス二重結合を含有する。オメガ-3脂肪酸とオメガ-6脂肪酸は、脂肪酸のメチル末端に対する二重結合の位置に基づいて互いに区別される。健康な食事は、ω-6およびω-3脂肪酸の両方を必要とする。しかし、西洋の食事はオメガ-6脂肪酸とオメガ-3脂肪酸に劣るが特に豊富である。高オメガ6オメガ-3脂肪酸比は、心血管疾患および炎症性疾患のリスクの増加、しかし、特定の脂肪酸の正確な有益と有害な機能はウェル2に理解されていないと関連している。回虫線虫elegaそれはω-3デサチュラーゼ、ほとんどの動物3,4には存在しない活性を含むオメガ-6およびオメガ-3脂肪酸の範囲を生成するために必要な酵素の全てを合成するため、ナノ秒は、脂肪酸の機能を研究するのに有用である。脂肪酸不飽和化酵素を欠いた変異体が発達し、神経学的欠陥4-6の範囲につながる、特定のPUFAを生産することができない。

食事性脂肪酸の生理的効果を研究するために、我々はCの両方の変異体およびRNAiノックダウン技術を使用して、遺伝子解析と互換性の生化学的ア ​​ッセイを開発してきた虫 。特定のPUFA補充の前注ぐ寒天培地への脂肪酸のナトリウム塩溶液を添加することによって達成される。これはEで、PUFA摂取になりそれは細菌膜に蓄積大腸菌食料源、。C.虫は、PUFAを含む細菌を摂取し、この栄養補給は、欠陥品を救出するのに十分であるPUFA欠損変異体のTS。ほとんどの脂肪酸の補給は、野生型動物に有害な影響が、特定のオメガ-6脂肪酸、特に、ジホモ-γ-リノレン酸（DGLA、20:3のn-6）C.の永久的な破壊を引き起こすことがありませんエレガンス生殖細胞7,8。

ガスクロマトグラフィーは、細菌の食料源（OP50又はHT115のいずれか）ならびに線虫に補充脂肪酸の取り込みを監視するために使用される。培地中の界面活性剤タージトール（NP-40）の添加は、全体のプレートとE.による脂肪酸のより効率的な取り込みを介して脂肪酸の均一な分布を可能にする大腸菌や線虫。我々は、不飽和脂肪酸が容易に細菌およびC.によって取り込まれることを見出した虫が、飽和脂肪酸の取り込みはあまり効率的である。この記事では、脂肪酸と寒天培地を補足する方法、ならびに第における脂肪酸の​​取り込みを監視する方法を段階的に説明するガスクロマトグラフィーを使用して電子線虫。

プロトコル

多価不飽和脂肪酸は、熱、光および酸素に敏感である。脂肪酸補充板を製造する場合、したがって、注意を払わなければならない脂肪酸が過剰な熱および光にさらされないようにする。 0.1％タージトール（NP-40）を含有するNGM培地は、脂肪酸ナトリウム塩を一定に攪拌しながら添加した後、オートクレーブし、部分的に冷却される。プレートを暗所で乾燥させる。 C.による脂肪酸の取り込みこれらのプレート上で培養エレガンスは、次いでガスクロマトグラフィーによって監視することができる。

1。脂肪酸補充培地の調製

  1. 適切なサイズのフラスコに培地成分を測定します。 1 Lあたり、17グラムバクト寒天2.5グラムトリプトン3のNaCl、エタノールに溶解し1ミリリットル5 mg / mlのコレステロール、及び水10ミリリットルに溶解した10％タージトールを加える。
  2. ミリポア水の最終所望の​​体積の80％を追加して、別の数と同じ（空のガラスびんと一緒にメディアをオートクレーブ脂肪酸濃度が試験される）、ならびに適切なのメスシリンダー。
  3. 55℃に設定した水浴中でクールなメディア媒体は、ガラスバイアルをこじ開け安全注意事項を使用し、ガラス粒子は、脂肪酸で混合しない保証することにより、脂肪酸ナトリウム塩作業ストック溶液を調製し、冷却される。 100 mMのワーキングストックを作るために十分な脂肪酸を量る。
  4. 精製水で100 mMの最終濃度までの脂肪酸溶液をもたらす。完全に脂肪酸ナトリウム塩を溶解することは、典型的には約20〜30分を要する。不活性ガスとの接触は酸化を防ぐので、アルゴン又は窒素を有する脂肪酸の​​作業ストックをパージする。バイアルに蓋をし、メディアが冷却されるまで暗闇での作業の在庫を保管してください。
  5. （任意）メディアのRNAiが所望される場合、ここにアンピシリンおよびイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）の溶液を測定する。
  6. 寒天は55℃に冷却したときは、1Lあたりの追加C：11 MのMgSO 4 mlの1 M CaCl 2を 1mlのリン酸緩衝液25mlの（1 Lあたり108.3グラムのKH 2 PO 4、35.6グラムのK 2 HPO 4は、オートクレーブ処理）。 RNAiのプレートを作った場合、アンピシリンおよびIPTGソリューション滅菌フィルタを追加します。プレートのすべてのタイプのために、1 Lに、最終的なメディアボリュームを持って来るために滅菌水を追加
  7. 火気の近くで、オートクレーブ処理にメディアを転送し、適切にメスシリンダーをサイズにし、目的のボリュームに暖かい滅菌水を加えます。戻って最初のフラスコにメディアを転送し、攪拌して混合します。
  8. メスシリンダーにオートクレーブ処理し、適切な大きさで測定して、試験される濃度の数に等しい数のボトルへの火炎、転写媒体近。脂肪酸作業ストックが完全に溶解するまで水浴を使用して液体として等分メディアを維持する。
  9. メディアが触ると暖かく、しかし熱くないまで撹拌プレートおよび撹拌に1瓶を置きます。十分な自分を残していることを確認してください脂肪酸原液を加えて混ぜるとメディアが固化し始める前に、プレートを注ぐための時間。撹拌プレートは、温度制御されている場合は、55℃に設定し
  10. 所望の最終濃度のために培地に100mMの脂肪酸作業ストックに希釈する。白色の沈殿が溶液（約1分）になるまで、メディアを攪拌する。メディアはまだ、その後、わずかに白濁することがあります。
  11. RNAiのメディアが必要な場合（オプション）2 mMの最終濃度に添加し、IPTGを0.1mg /アンピシリンを追加します。
  12. 培地を60mmプレート又は媒体100ミリメートル当たりプレート当たり25mlの培地を8mlを添加し、自動化ピペットエイドおよび滅菌を25mlピペットを使用して注ぐ。残りのボトル用のステップを注ぐ脂肪酸に加え、プレートを繰り返します。
  13. 寒天が固化した後、光酸化から守るために、よく通気引き出しの中に、室温でボックスまたはストアと脂肪酸補充プレートをカバーしています。
  14. シードE.プレートが乾燥してきた2日後にプレートに大腸菌 OP50。60ミリメートルプレート、ピペット（37℃で増殖）一晩OP50文化300μlのため。 RNAiのプレートを注入した場合には、プレートを4日間乾燥した後に、RNAi細菌300μlのシード。プレートの乾燥時間は、様々な実験室環境における湿度の差に調整される必要があり得る。
  15. 細菌ローンが乾燥している間、室温で暗い環境での培養する。

2。 DGLAの補充によって生殖細胞破壊を誘発する

  1. C.が0.3mm DGLA（午後8時03分、N-6）を含むプレート上で成長した虫は、両方の幼虫期と成人線虫における生殖細胞の破壊に無菌になる。
    1. アルカリ性次亜塩素酸溶液と妊娠雌雄同体を処理することにより、L1幼虫の同期化された人口を準備（10ミリリットルソリューションの：5MのNaOH、家庭用漂白剤を2.5ミリリットル、および7ミリリットルのH 2 Oを0.5ミリリットル）。優しく成虫まで、この溶液中の妊娠雌雄同体を揺するSが溶解する。卵は保持され、低速遠心分離によってペレット化することができる。
    2. （3グラムのKH 2 PO 4、6グラムHPO 4、5グラムのNaCl、1ミリリットルの1MのMgSO 4、H 2 O Lでオートクレーブ後のMgSO 4を追加する1〜2 Na）のM9バッファーに卵の準備を3回洗浄します。十分な酸素を提供するために、一晩振とう機上でM9バッファーやロックの5ミリリットルの最終容量に15ミリリットルのプラスチックチューブ内に卵を懸濁します。
    3. のL1幼虫は2日OP50、またはRNAi細菌をめっき後1日で播種後補足プレートに添加する必要があります。彼らは大人の段階に到達するまで3日間、20℃でワームをインキュベートか。
  2. 成虫は、子宮内発育する胚を可視化するために十分に高い倍率で解剖顕微鏡を使用して無菌性についてスコア化することができます。成功した生殖細胞の損失は、卵の明確な子宮無効として表示されます。
  3. ワームはまた、核酸aで固定し、染色によりスコア化することができますCID染料diamindinophenylindole（DAPI）、生殖細胞および発生中の胚中の核の可視化を容易にする。迅速なDAPI染色は時計皿9にM9バッファーの低下にワームを選ぶことによって達成される。
    1. 0.2 ngの/ mで1ミリリットルと洪水ウォッチガラス。 DAPI 95％エタノール溶液中で、約5分間放置します。
    2. スライド上のベクタシールドのドロップにワームを選び、その後、カバーガラスでカバーしています。
    3. 最適な染色のため、暗い一晩中4℃で密封カバーガラスとストアは、しかし、スライドは直ちに表示することができます。 UVランプとフィルターを備えた蛍光顕微鏡を用いて生殖細胞核の存在または非存在についてスコア。

3。ガスクロマトグラフィーによる脂肪酸摂取を確認する

C.全体の脂肪酸組成線虫を分離し、ガスのchrを使用して定量化される脂肪酸メチルエステル（FAME）を製造することによって決定することができるomatography 4。

  1. 水でプレートからそれらを洗浄し、シラン化された13ミリメートルX 100ミリメートルガラススクリュートップチューブに移すことによって、500〜1,000成虫を集める。
  2. ワームは、重力によって沈降してみましょう、その後、ガラスパスツールピペットを用いて、できるだけ多くの水を除去する。
  3. 水で一度ワームを洗ってから、再度、できるだけ多くの水を除去する。
  4. FAMEを、水浴中で1時間、70℃で1〜2.5％のH 2 mlのメタノール中のSO 4、次いで加熱を加えることによって形成されている。
  5. 水浴からチューブを外し、1分間冷やす。
  6. 1.5ミリリットルの水とヘキサンの0.25ミリリットルを追加することにより、脂肪酸メチルエステルを抽出します。
  7. 要約チューブ、激しく振る。
  8. 水系溶媒からヘキサンを分離するために最高速度で1分間卓上臨床遠心分離機中で遠心管。
  9. GCバイアルにヘキサン（最上層）を転送する水相のいずれかを転送しないように注意して、GC用バイアル内に挿入します。 GCのAのnalysis、ヘキサン中のFAMEの1-2μlのFAMEの分析に適した極性のキャピラリーガスクロマトグラフィーカラムに注入する。アジレント7890 GCインジェクタ1.4 ml /分の流速で、250℃に設定し、GCオーブン内で1分間保持され、130℃の初期温度にプログラムされている。その後、温度を190℃まで10℃/分の傾斜した後、210℃まで5℃/分で再び上昇させ、さらに1分間保持した。
  10. DGLAの取り込みが発生している保証するために、C.の同定のための真正標準物質を使用し、水素炎イオン化検出器（FID）または質量分析（MS）検出によって脂肪酸メチルエステルの分析脂肪酸のエレガンス 。

結果

Cの補充食虫 、細菌膜への脂肪酸取り込みおよび組み込む細菌の食物源の能力によって制限される。 Eの能力を決定するその膜内に様々な脂肪酸資化大腸菌 OP50は、OP50はノーサプリメント、0.1 mMおよびステアリン酸（午前18時00分）、オレイン酸ナトリウム（18:1のn-9）およびナトリウムDGLA（20 0.3mMの濃度で培地上にプレーティングした：3nは-6）。プレートを暗所で2?...

ディスカッション

ここでは、C.の補充方法を記載食事性の不飽和脂肪酸との虫 。前述したようなPUFAの二重結合の反応性の性質はこれらの脂肪酸は、熱と光11によって酸化に敏感であることが原因となるので、お手入れは、PUFAを補足プレートの準備に注意する必要があります。酸化を避けるために、メディアが暗い環境下で55℃を記憶プレートに冷却した後に液体寒天培地にPUFAを添加する?...

開示事項

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

謝辞

私たちは、原稿上の有益なコメント代表的な結果を図3とジェイソンワットとクリス·ウェブスターのような予備実験を行うためのクリス·ウェブスターに感謝します。この研究のための資金はJLWに国立衛生研究所（米国）（R01DK074114）からの助成金によって提供された。この研究で使用されている一部の線虫株は研究基盤プログラムのNIHのオフィス（P40のOD010440）によって資金を供給される線虫遺伝学センターから提供された。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Bacto-AgarDifco214010
TryptoneDifco211705
NaClJ.T. Baker3624-05
TergitolSigmaNP40S-500mL
CholesterolSigmaC8667-25G(5 mg/mL in ethanol)
MgSO4J.T. Baker2504-01
CaCl2J.T. Baker1311-01
K2HPO4J.T. Baker3254-05
KH2PO4J.T. Baker3246-05
Sodium dihomogamma linolenateNuCHEKS-1143
Warm sterile Millipore water
Sterile water for collecting worms
Nuclease-free Water for DGLA stock solutionAmbionAM9932
AmpicillinFisher ScientificBP1760-25100 mg/ml in water (for RNAi plates)
Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)Gold Biotechnology12481C1001 M in water (for RNAi plates)
HSO4J.T. Baker9681-03
MethanolFisher ScientificA452-4
HexaneFisher ScientificH302-4
diamindinophenylindole (DAPI)SigmaD9542
VectaShieldVector LaboratoriesH-1000
Glass FlaskCorning4980-2L
Autoclaveable Glass bottles with stirbarsFisherbrandFB-800
Autoclaveable Glass Graduated CylinderFisherbrand08-557
Stir PlateVWR97042-642
Waterbath at 55+ °CPrecision Scientific Inc.66551
Screwcap Brown Glass VialSun SRI200 494
Argon gas tank
Automated Pipette aidPipette-AidP-90297
Sterile Serological Pipettes (25 ml)Corning4489
Bunsen BurnerVWR89038-534
Dissection microscopeLeicaTLB3000
Silanized glass tubeThermo ScientificSTT-13100-Sfor FAMEs derivitization
PTFE Screw capsKimble-Chase1493015D
Clinical tabletop centrifugeIEC
GC Crimp VialSUN SRi200 000
GC Vial InsertSUN SRi200 232
GC Vial capSUN SRi200 100
Gas ChromatographAgilent7890A
Mass Spectrometry DetectorAgilent5975C
Column for gas chromatographySuppelcoSP 238030 m x 0.25 mm fused silica capillary column

参考文献

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