Çoklu doymamış yağ asitlerinin Diyet takviyesi<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Özet

Caenorhabditis elegan geliştirme ve fizyolojisi çok-doymamış yağlı asitlerin fonksiyonlarını keşfetmek için uygun bir modeldir. Bu protokol C tamamlayan etkili bir yöntem tarif elegans çoklu doymamış yağ asitleri ile diyet.

Özet

Yağ asitleri çok sayıda hücre fonksiyonları için gereklidir. Bu membran hidrofobik özünü oluşturan ve çeşitli sinyal yoluna katılabilir, verimli enerji depolama molekülleri karşılık vermektedir. Caenorhabditis elegans omega-6 ve omega-3 yağ asitleri, bir dizi üretmek için gerekli olan bütün enzimleri sentezler. Bu, basit anatomi ve mevcut genetik araçları yelpazesi ile birlikte, bu yağ asidi işlevini incelemek için çekici bir model olun. Diyet yağ asitlerinin fizyolojik etkilere aracılık genetik yollarının araştırılması amacıyla, C takviyesi için bir yöntem geliştirdik Doymamış yağ asitleri ile elegans beslenme. Takviyesi solucanlar yağ asidi bileşimini değiştirmek için etkili bir araç ve aynı zamanda yağlı asit eksikliği olan mutantlar kusurları kurtarmak için kullanılabilir. Önerilen yöntem, yağ acidsodium tuzları ile takviye edilmiş nematod büyüme ortamı, agar (NGM) kullanır. Takviye edilmiş plakalarda yağ asitleri incorpora olmakted sonra C. tarafından alınır, bakteriyel besin kaynağı, zarların içine takviye bakteriler üzerine yem elegans. Biz de desteklenmiş solucanlar meydana yağ asidi kompozisyonundaki değişiklikleri izlemek için bir gaz kromatografisi protokol açıklar. Bu C. büyük ve küçük popülasyonların diyetlerine ek etkili bir yoldur elegans, bu yöntem için bir dizi uygulama için izin verir.

Giriş

Yağ asitleri temel yapı membran bileşenleri hem de verimli enerji depolama moleküllerdir. Ek olarak, yağ asitleri, lipazlar tarafından hücre zarlarından parçalanabilen ve enzimatik olarak işaret efektör ¹ üretilmesi için değiştirilebilir. Doğal olarak oluşan çok-doymamış yağlı asitleri (PUFAlar) iki veya daha fazla cis çift bağ ihtiva edebilir. Omega-3 yağ asitleri ve omega-6 yağ asitleri, yağ asidi metil sonuna göre çift bağların pozisyonlara göre birbirinden ayırt edilmektedir. Sağlıklı beslenme omega-6 ve omega-3 yağ asitleri hem de gerektirir. Ancak, Western diyetler omega-6 yağ asitleri ve omega-3 yağ asitleri zayıf özellikle zengindir. Yüksek bir omega-6 omega-3 yağ asidi oranı, kardiyovasküler ve enflamatuar hastalıkların riski Bununla birlikte, belirli yağ asitlerinin tam yararlı ve zararlı işlevleri de ² anlaşılmamıştır ile ilişkilidir. Yuvarlak kurt Caenorhabditis elegabir omega-3 desatürazı, çoğu hayvan ^3,4 in mevcut olan bir aktivitesi omega-6 ve omega-3 yağ asitleri, bir dizi üretmek için gerekli olan bütün enzimleri sentezler için ns yağlı asit fonksiyonu çalışmalarında yararlıdır. Yağlı asit desatüraz enzimleri eksik olan mutantlar, gelişim ve nörolojik kusurlar ^4-6 bir dizi yol açan, özel PUFAların üretilmesi için başarısız.

Diyet yağ asitlerinin fizyolojik etkilerini incelemek için, C de mutant ve RNAi yok etme teknikleri kullanarak genetik analizi ile uyumlu bir biyokimyasal analiz geliştirdik elegans. Özel PUFAlar ile takviyesi dökülmesinden önce agar ortamına bir yağlı asit sodyum tuzu çözeltisinin eklenmesi ile elde edilir. Bu, E. tarafından PUFA alımı ile sonuçlanan Bu bakteri membran birikir coli besin kaynağı. C. elegans PUFA içeren bakteri yemek ve bu diyet takviyesi arızalı kurtarmak için yeterlidirPUFA eksikliği mutantlarının ts. En çok yağlı asitlerin takviyesi, ancak, belirli bir omega-6 yağ asitleri, özellikle dihomo-gama linolenik asit (DGLA, 20:03 n-6) C arasında kalıcı bir imha neden yabani tip hayvanlar üzerinde herhangi bir zararlı etkisi yoktur elegans germ hücreleri ^7,8.

Gaz kromatografisi bakteriyel besin kaynağı (OP50 veya HT115 olarak) hem de nematod takviye yağ asidi alımını izlemek için kullanılır. Medyada deterjan Tergitol (NP-40) 'nin ilave edilmesi, tüm plaka ve E ile yağlı asitlerin daha etkin alınması yoluyla yağlı asitlerin dağılımını sağlar: coli ve nematodlar. Biz, doymamış yağ asitleri kolayca bakteri ve C. tarafından alınır bulduk elegans, fakat doymuş yağlı asitlerin alımını çok daha az etkilidir. Bu makalede, yağ asitleri ile agar ortamı tamamlamak için nasıl adım adım tarif, hem de inci yağ asidi alımını izlemek için ne kadar olacakgaz kromatografisi kullanılarak e nematod.

Protokol

Çoklu doymamış yağ asitleri, ısı, ışık ve oksijen duyarlıdır. Yağ asidi takviyesi tabak hazırlarken Bu nedenle, bakım alınmalıdır yağ asitleri aşırı ısı ve ışığa maruz kalmayacakları şekilde. % 0.1 Tergitol (NP-40) ihtiva eden NGM ortamı yağlı asit sodyum tuzları, sabit karıştırma ile ilave edilir ve bundan sonra, otoklav ve kısmen soğutulur. Plakalar karanlıkta kurumaya bırakılır. C. tarafından yağ asitlerinin Uptake daha sonra gaz kromatografisi ile takip edilebilir elegans, bu plakalar üzerinde kültürlendi.

1.. Yağ asit vasıta hazırlanması

1. Uygun büyüklükte bir balona medya bileşenleri ölçün. 1 litre başına, 17 g Bacto-agar, 2.5 g tripton, 3 g NaCl, etanol içinde eritildi, 1 ml 5 mg / ml kolesterol ve su içinde eritildi, 10 ml% 10 Tergitol ekleyin.
2. Millipore su istenen son hacminin% 80 ekleyin ve farklı sayısına eşittir (boş cam şişe ile birlikte ortam otoklavyağlı asit test edilecek konsantrasyonlar), bunun yanısıra, uygun dereceli silindirler.
3. 55 ° C'ye ayarlanmış bir su banyosu içinde Serin medya Ortam, cam şişe açık kırılma güvenlik önlemleri ile ve cam parçacıkları yağ asitleri ile karışmaz sağlanarak, yağlı asit sodyum tuzunun çalışma stok çözeltisi hazırlamak soğurken. 100 mM çalışma stok yapmak için yeterli yağ asidi dışarı tartılır.
4. , Saflaştırılmış su ile 100 mM'lik bir son konsantrasyon elde etmek için yağlı asit çözeltisi getirin. Tam yağlı asit sodyum tuzunu çözerek, tipik olarak yaklaşık 20-30 dakika sürer. Bir atıl gaz ile temas oksidasyonunu engeller, çünkü, argon ya da azot ile birlikte bir yağ asidinin çalışma stok temizleyin. Kapatılır ve ortam soğuyana kadar karanlıkta çalışma stok saklayın.
5. (İsteğe bağlı) RNAi ortam istendiği takdirde, ampisilin ölçmek ve burada izopropil β-D-1-tiogalaktopiranosid (IPTG) çözümleri.
6. Agar 55 ° soğuduğunda 1 L başına eklemek C: 11 M MgSO ₄ ml 1 M _CaCI2 1 ml ve fosfat tamponu 25 ml (1 L başına 108.3 g KH ₂ PO ₄ ve 35.6 g K ₂ HPO ₄ otoklav). Filtre sterilize ampisilin ve IPTG çözümler RNAi yapım plakaları ise ekleyin. Plakalarının her türlü için, 1 L'lik nihai ortam hacmi getirmek için steril su ekle
7. Bir alev yakınında, Otoklavlanmış aktarmak medya ve uygun Mezür boyutta ve daha sonra istenen hacme ılık steril su ekleyin. Geri ilk şişeye aktarmak medya ve karıştırarak karıştırın.
8. Bir alev civarında, bir otoklav ile ölçülerek test edilecek konsantrasyonlarının sayısına eşit bir dizi şişe içine transferi ortam ve uygun bir şekilde dereceli silindir boyuttadır. Yağlı asit çalışma stok tamamen çözülene kadar bir su banyosu kullanılarak bir sıvı olarak aliquoted ortamı koruyun.
9. Medya dokunmak sıcak, sıcak ama değil kadar bir heyecan plaka ve karıştırın üzerine bir şişe yerleştirin. Yeterince kendinizi bırakın emin olunyağlı asit stok çözeltisi içinde ilave edin ve ortam katılaşmaya başlamadan önce plakalar dökmek süresi. Heyecan plaka sıcaklığı denetimi varsa, 55 ° C'ye ayarlayın
10. İstenen nihai konsantrasyon için ortama 100 mM yağlı asit çalışma stokları seyreltin. Stir ortam beyaz çökelti kadar çözelti (yaklaşık 1 dakika) bulunmaktadır. Medya hala sonra biraz bulanık olabilir.
11. (İsteğe bağlı) RNAi ortam 2 mM nihai bir konsantrasyona kadar IPTG ml ve 0.1 mg / eklenti ampisilin isteniyorsa.
12. 8 60 mm tabak başına ortam ml veya 100 mm plaka başına ortam 25 ml ilave otomatik bir pipet yardımı ile steril bir 25 ml bir pipet kullanılarak ortam dökün. Kalan şişeler için adımlar dökme yağlı asit ilaveli ve plaka tekrar edin.
13. Agar katılaşmış sonra, hafif oksidasyondan korumak için, iyi havalandırılan bir çekmece içerisinde oda sıcaklığında bir kutu ya da mağaza ile yağ asidi-takviye plakaları kapsamaktadır.
14. Tohum E. coli OP50 plakaları kurutuldu olan iki gün sonra, plakalar üzerine.60 mm tabak için, (37 ° C'de yetiştirilen), bir gece boyunca OP50 kültür pipet 300 ul. RNAi plakalar boşaltılır olsaydı, plakalar dört gün boyunca kurutulduktan sonra, RNAi bakteri 300 ul tohum. Levha kuruma süresi nedeniyle çeşitli laboratuar ortamında nem farklılıklarından ayarlanması gerekebilir.
15. Bakteriyel çim kururken, oda sıcaklığında karanlık ortamda inkübe edin.

2. DGLA'nın Suplementasyon tarafından Germ Hücre Destruction Inducing

1. C. 0.3 mM DGLA (20:03 n-6) içeren plakalar üzerinde büyüdü elegans nedeniyle hem larva ve ergin nematod germ hücrelerinin imha steril hale gelir.
   1. Alkali hipoklorit çözeltisi ile muamele edilerek gebe çift cinsiyetli L1 larvalarının bir senkronize bir nüfus hazırlayın (10 ml solüsyon için: 5M NaOH, çamaşır suyu 2.5 ml, 7 ml _H2O içinde 0.5 ml) eklenmiştir. Yavaşça yetişkin kurt kadar bu çözelti içinde gebe çift cinsiyetli kayas çözülür. Yumurta korunur ve düşük hızlı santrifüjleme ile tane haline edilebilir.
   2. (3 g KH ₂ PO _4, 6 g HPO _4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO ₄ H, ₂ O L. otoklav sonrası MgSO ₄ 1 ekleyin ₂ Na) M9 tampon maddesi içinde yumurta terkip 3 kez yıkayın. Yeterli oksijen sağlamak için, bir gece boyunca bir çalkalayıcı üzerinde M9 tampon ve kaya 5 ml'lik bir son hacim için 15 ml plastik bir tüp içinde yumurta tekrar süspansiyon.
   3. L1 larva iki gün RNAi bakteri sonra kaplama OP50, ya da bir gün ile tohumlamadan sonra takviye edilmiş plakalara ilave edilmelidir. Onlar yetişkin aşamasına ulaşana kadar üç gün boyunca 20 ° C'de inkübe solucanlar ya.
2. Yetişkin solucanlar rahim içinde gelişmekte olan embriyolar görselleştirmek için yeterince yüksek büyütme ile bir diseksiyon mikroskobu kullanarak sterilite için attı olabilir. Başarılı germ hücre kaybı yumurta açık bir rahim boşluğu olarak görünecektir.
3. Solucanlar da sabitleme ve nükleik a ile boyanarak attı olabilirgerm hücreleri çekirdeklerin görselleştirme ve gelişen embriyolar kolaylaştırmaktadır cid boya diamindinophenylindole (DAPI). Hızlı bir DAPI leke bir gözlem ⁹ M9 tampon bir damla halinde solucan toplama ile elde edilir.
   1. , 0.2 ng / m 1 ml Sel-cam. DAPI% 95 etanol çözeltisi içinde, yaklaşık 5 dakika boyunca bekletin.
   2. Bir slaytta Vectashield bir damla içine solucanlar almak ve daha sonra bir lamel ile kaplayın.
   3. Optimum boyama için karanlık gecede 4 ° C'de mühür lamel ve mağaza, ancak slaytlar de hemen görülebilir. Varlığında veya bir UV lambası ve filtre ile teçhiz edilmiş bir floresans mikroskobu kullanılarak germ hücre çekirdeklerinin olmaması için puan.

3. Gaz Kromatografisi ile Yağ Asit Alımı Onaylayan

C. Genel olarak yağ asidi bileşimi, elegans daha sonra ayrılır ve gaz Chr kullanılarak nicelendirilir yağlı asit metil esterleri (FAME) üretilmesi ile belirlenebiliromatography ^4.

1. Su ile plakalar kapalı yıkamadan ve silanize edilmiş 13 mm x 100 mm cam tüpe Üstü yivli aktarılarak 500-1.000 erişkin solucanlar toplayın.
2. Solucanlar yerçekimi tarafından razı olsun, ve sonra bir cam Pasteur pipeti ile mümkün olduğunca çok su çıkarmak.
3. Su ile bir kez solucanlar yıkayın ve daha sonra tekrar mümkün olduğu kadar çok suyu çıkarmak.
4. Fames bir su banyosu içinde 1 saat boyunca 70 ° C'de% 2.5 1 H ₂ ml metanol içinde SO ₄ ve daha sonra ısıtma eklenerek oluşturulur.
5. Su banyosundan çıkarın ve tüpler, 1 dakika için soğutun.
6. 1.5 ml su ve 0.25 ml heksan eklenerek Fames ekstrakte edin.
7. Recap tüpler ve şiddetle çalkalanır.
8. , Sulu çözücüden ayrılması için heksan maksimum hızda 1 dakika boyunca masa üstü bir klinik santrifüj cihazında santrifüj tüpleri.
9. Sulu fazın bir transferi için dikkatli olmak, bir GC şişe içinde bir GC şişe içeriğine heksan (üst katman) aktarın. GC için analysis, heksan içinde FAME 1-2 ul kareleri analizi için uygun olan bir polar kılcal gaz kromatografi sütunu üzerine enjekte edilir. Agilent 7890 GC enjektör 1.4 ml / dk 'lık bir akış oranı ile, 250 ° C'de ayarlanır ve GC fırın 1 dakika için tutulan 130 ° C'lik bir başlangıç ​​sıcaklığı için programlanır. Bundan sonra, sıcaklık 10 ° C / dk kadar 190 ° C rampalı edilir ve daha sonra 210 ° C'ye kadar 5 ° C / dk 'da yeniden rampalı ve ek 1 dakika tutuldu.
10. , DGLA'nın bu uptake oluştu sağlamak C tanımlanması için otantik standartlar kullanılarak alev iyonlaşma algılaması (FID) ya da kütle spektrofotometresi (MS) tespiti ile Fames analiz etmek yağ asitleri elegans.

Sonuçlar

C. takviyesi elegans beslenme bakteriyel zarı içine yağ asidi alımı ve birleştirmek için bakteriyel gıda kaynağının kabiliyeti ile sınırlıdır. E. yeteneğini belirlemek için bu membran içine çeşitli yağ asitleri asimile coli OP50, OP50 hiçbir takviyesi, 0.1 mM ve stearik asit (18:00), sodyum oleat (18:1 n-9), ve sodyum DGLA (20, 0.3 mM konsantrasyonları ile ortamı üzerine kaplanmıştır : 3n-6). Tabaklar karanlıkta 2 gün boyunca oda sıcaklığında kurutuld...

Tartışmalar

Burada C takviyesi için bir yöntem tarif Diyet doymamış yağ asitleri ile elegans. Yukarıda belirtildiği gibi, PUFAların en çift bağların reaktif doğası, bu yağ asitleri, ısı ve ışık ¹¹ ile oksidasyona karşı duyarlı olması neden olur, çünkü bakım PUFA takviye plakaları hazırlanmasında alınmalıdır. Oksidasyonu önlemek için, ortam karanlık bir ortamda 55 ° C ve depolar plakalara soğuduktan sonra, sıvı agar ortamına PUFA eklemek için önemlidir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bacto-Agar	Difco	214010
Tryptone	Difco	211705
NaCl	J.T. Baker	3624-05
Tergitol	Sigma	NP40S-500mL
Cholesterol	Sigma	C8667-25G	(5 mg/mL in ethanol)
MgSO4	J.T. Baker	2504-01
CaCl2	J.T. Baker	1311-01
K2HPO4	J.T. Baker	3254-05
KH2PO4	J.T. Baker	3246-05
Sodium dihomogamma linolenate	NuCHEK	S-1143
Warm sterile Millipore water
Sterile water for collecting worms
Nuclease-free Water for DGLA stock solution	Ambion	AM9932
Ampicillin	Fisher Scientific	BP1760-25	100 mg/ml in water (for RNAi plates)
Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)	Gold Biotechnology	12481C100	1 M in water (for RNAi plates)
HSO4	J.T. Baker	9681-03
Methanol	Fisher Scientific	A452-4
Hexane	Fisher Scientific	H302-4
diamindinophenylindole (DAPI)	Sigma	D9542
VectaShield	Vector Laboratories	H-1000
Glass Flask	Corning	4980-2L
Autoclaveable Glass bottles with stirbars	Fisherbrand	FB-800
Autoclaveable Glass Graduated Cylinder	Fisherbrand	08-557
Stir Plate	VWR	97042-642
Waterbath at 55+ °C	Precision Scientific Inc.	66551
Screwcap Brown Glass Vial	Sun SRI	200 494
Argon gas tank
Automated Pipette aid	Pipette-Aid	P-90297
Sterile Serological Pipettes (25 ml)	Corning	4489
Bunsen Burner	VWR	89038-534
Dissection microscope	Leica	TLB3000
Silanized glass tube	Thermo Scientific	STT-13100-S	for FAMEs derivitization
PTFE Screw caps	Kimble-Chase	1493015D
Clinical tabletop centrifuge	IEC
GC Crimp Vial	SUN SRi	200 000
GC Vial Insert	SUN SRi	200 232
GC Vial cap	SUN SRi	200 100
Gas Chromatograph	Agilent	7890A
Mass Spectrometry Detector	Agilent	5975C
Column for gas chromatography	Suppelco	SP 2380	30 m x 0.25 mm fused silica capillary column