La supplementazione alimentare di acidi grassi polinsaturi a<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Riepilogo

Caenorhabditis elegant è un modello utile per esplorare le funzioni di acidi grassi polinsaturi nello sviluppo e nella fisiologia. Questo protocollo descrive un metodo efficiente di integrare C. elegans dieta con acidi grassi polinsaturi.

Abstract

Gli acidi grassi sono essenziali per numerose funzioni cellulari. Servono molecole di accumulo di energia come efficienza, costituiscono il nucleo idrofobico delle membrane, e partecipare a varie vie di segnalazione. Caenorhabditis elegans sintetizza tutti gli enzimi necessari a produrre una gamma di acidi omega-6 e omega-3 acidi grassi. Questo, combinato con la semplice anatomia e varietà di strumenti genetici disponibili, lo rendono un modello attraente per studiare la funzione di acidi grassi. Per studiare i percorsi genetici che mediano gli effetti fisiologici degli acidi grassi alimentari, abbiamo sviluppato un metodo per integrare il C. elegans dieta con acidi grassi insaturi. L'integrazione è un mezzo efficace per alterare la composizione in acidi grassi di vermi e può essere utilizzato anche per salvare difetti di mutanti di acidi carenti di grassi. Il nostro metodo utilizza nematode crescita agar (NGM) integrato con sali acidsodium grassi. Gli acidi grassi nelle piastre integrate diventano incorporazioneTED nelle membrane della fonte di cibo batterica, che viene poi ripreso dalla C. elegans che si nutrono di batteri integrati. Noi descriviamo anche un protocollo gas cromatografia per monitorare i cambiamenti nella composizione degli acidi grassi che si verificano in vermi completata. Questo è un modo efficace per integrare le diete di piccole e grandi popolazioni di C. elegans, consentendo una vasta gamma di applicazioni di questo metodo.

Introduzione

Acidi grassi sono componenti strutturali essenziali delle membrane nonché molecole di immagazzinamento dell'energia efficiente. Inoltre, gli acidi grassi possono essere scissi dalla membrane cellulari da lipasi e essere enzimaticamente modificati per produrre effettori di segnalazione ^1. Naturalmente presenti acidi grassi polinsaturi (PUFA) contengono due o più doppi legami cis. Gli acidi grassi omega-3 e gli acidi grassi omega-6 si distinguono tra loro in base alle posizioni di legami doppi rispetto alla fine metilico dell'acido grasso. Le diete sane richiedono sia gli acidi grassi omega-3, omega-6 e. Tuttavia, le diete occidentali sono particolarmente ricchi di omega-6 acidi grassi e povera di acidi grassi omega-3. Un alto omega-6 rapporto omega-3 acidi grassi è associata ad aumentato rischio di malattie cardiovascolari ed infiammatorie, tuttavia, le precise funzioni benefici e dannosi degli acidi grassi specifici non sono ben compresi ^2. Gli ascaridi Caenorhabditis Elegans è utile nello studio funzione acido grasso perché sintetizza tutti gli enzimi necessari per produrre una gamma di acidi omega-6 e omega-3 grassi, compreso un omega-3 desaturasi, un'attività che è assente nella maggior parte degli animali ^3,4. Mutanti privi di grassi acido enzimi desaturasi non riescono a produrre PUFA specifici, portando ad una serie di difetti di sviluppo e neurologici ^4-6.

Per studiare gli effetti fisiologici degli acidi grassi alimentari, abbiamo sviluppato un saggio biochimico compatibile con l'analisi genetica utilizzando sia tecniche di RNAi di knock-down mutante e in C. elegans. Supplementazione con PUFA specifici è ottenuto aggiungendo una soluzione di sale di sodio di acido grasso per mezzo di agar prima di versare. Ciò si traduce in PUFA assorbimento della E. fonte di cibo coli, dove si accumula nelle membrane batteriche. C. elegans ingerire i batteri PUFA contenenti, e questa integrazione alimentare è sufficiente per salvare il difettosots di mutanti PUFA-deficienti. La supplementazione della maggior parte degli acidi grassi ha effetti negativi sul tipo di animali selvatici, tuttavia, specifici acidi grassi omega-6, in particolare dihomo-acido gamma linolenico (DGLA, 20:03 n-6), causare una distruzione permanente di C. elegans cellule germinali ^7,8.

Cromatografia gas è utilizzato per monitorare l'assorbimento dell'acido grasso integrato nella fonte alimentare batterica (sia OP50 o HT115) nonché nei nematodi. L'aggiunta del tergitol detersivo (NP-40) nei mezzi permette una distribuzione uniforme degli acidi grassi attraverso l'intera piastra e l'assorbimento più efficiente degli acidi grassi della E. coli e nematodi. Abbiamo trovato che gli acidi grassi insaturi sono prontamente assorbiti da batteri e C. elegans, ma l'assorbimento di acidi grassi saturi è molto meno efficiente. Questo articolo descrive passo-passo come integrare il supporto agar con acidi grassi, e come monitorare l'assorbimento degli acidi grassi in the nematodi mediante gascromatografia.

Protocollo

Gli acidi grassi polinsaturi sono sensibili al calore, luce e ossigeno. Pertanto, occorre prestare attenzione quando si prepara piatti di integratori di acidi grassi tale che gli acidi grassi non siano esposti a eccesso di calore e di luce. Supporti NGM contenenti 0,1% Tergitol (NP-40) è autoclavato e parzialmente raffreddati, dopo che i sali sodici degli acidi grassi sono aggiunti con agitazione costante. Le piastre vengono lasciati asciugare al buio. Assorbimento di acidi grassi da C. elegans coltivati ​​su queste piastre possono poi essere monitorata mediante gascromatografia.

1. Preparazione di acidi grassi integrato multimediale

1. Misurare componenti multimediali in un pallone di dimensioni adeguate. Per 1 L, aggiungere 17 g Bacto-agar, 2,5 g di triptone, 3 g di NaCl, 1 colesterolo ml 5 mg / ml disciolto in etanolo e 10 ml 10% tergitol disciolto in acqua.
2. Aggiungere 80% del volume finale di acqua desiderata Millipore e autoclave media con bottiglie di vetro vuoto (uguale al numero di differenticoncentrazioni di acidi grassi da testare), e anche opportuno cilindri graduati.
3. Media freddi in un bagnomaria regolato a 55 ° C. Mentre i media si raffredda preparare la soluzione madre di lavoro del sale di acido grasso di sodio rompendo aperta la fiala di vetro, utilizzando misure di sicurezza e garantire particelle di vetro non si mescolano con gli acidi grassi. Pesare acido grasso abbastanza per fare una scorta di lavoro 100 mm.
4. Portare la soluzione di acido grasso ad una concentrazione finale di 100 mM con acqua purificata. Sciogliere completamente il sale di sodio dell'acido grasso richiede in genere circa 20-30 min. Spurgare il lavoro stock di acido grasso con argon o azoto, perché il contatto con un gas inerte impedisce l'ossidazione. Tappare il flacone e conservare lo stock lavorare al buio fino a quando i media si è raffreddato.
5. (Facoltativo) Se si desidera RNAi supporto, misurare ampicillina e soluzioni isopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) qui.
6. Quando l'agar è raffreddato a 55 ° C per aggiungere 1 L: 1ml di 1 M _MgSO4, 1 ml di 1 M CaCl _2, e 25 ml di tampone fosfato (108,3 g KH ₂ PO ₄ e 35,6 g K ₂ HPO ₄ per 1 L autoclavato). Aggiungere la soluzione IPTG se la fabbricazione di piastre di RNAi filtro ampicillina sterilizzato e. Per tutti i tipi di piastre, aggiungere acqua sterile per portare il volume finale a supporti 1 L.
7. Vicino a una fiamma, trasferimento multimediale in un autoclave e di dimensioni adeguate cilindro graduato e aggiungere acqua sterile calda per volume desiderato. Media Transfer torna a pallone iniziale e mescolare agitando.
8. Vicino a una fiamma, trasferire file multimediali in un certo numero di bottiglie pari al numero di concentrazioni da testare misurando con una autoclavato e di dimensioni adeguate cilindro graduato. Mantenere i media aliquotate come liquido con un bagno di acqua fino a quando il lavoro stock acido grasso si è completamente dissolto.
9. Mettere una bottiglia su un piatto mescolare e mescolare fino a quando la media è calda al tatto, ma non calda. Assicurarsi di lasciare se stessi abbastanzatempo di suscitare nella soluzione stock di acidi grassi e versare le piastre prima della media comincia a solidificare. Se piastra di agitazione ha il controllo della temperatura, impostarlo a 55 ° C.
10. Diluire il lavoro stock acido grasso 100 mm nella media per la concentrazione finale desiderata. Supporti Mescolare finché il precipitato bianco è in soluzione (circa 1 minuto). Il materiale può essere ancora leggermente torbida dopo.
11. (Facoltativo) Se RNAi supporto si desidera aggiungere l'ampicillina a 0,1 mg / ml e IPTG a 2 mm di concentrazione finale.
12. Versare memoria utilizzando un aiuto pipetta automatizzata e una sterile 25 ml pipetta, aggiungere 8 ml di media per 60 millimetri piastra o 25 ml di mezzi per mm piastra 100. Ripetere aggiunta di acido grasso e piastra versando passaggi per i restanti bottiglie.
13. Dopo l'agar è solidificato, coprire le piastre acidi grassi completata con una scatola o conservare a temperatura ambiente in un cassetto ben ventilati per proteggere dall'ossidazione luce.
14. Seed E. coli OP50 sulle piastre, due giorni dopo piastre sono secchi.Per piastre 60 mm, pipetta 300 microlitri di una cultura OP50 overnight (coltivato a 37 ° C). Se sono stati versati piatti RNAi, seminare con 300 ml di batteri RNAi dopo che le piastre si sono asciugati per quattro giorni. Piatto tempo di asciugatura può essere necessario regolare a causa di differenze di umidità in vari ambienti di laboratorio.
15. Incubare le piastre in un ambiente buio a temperatura ambiente, mentre il prato batterica sta asciugando.

2. Indurre cellule germinali distruzione da supplementazione di DGLA

1. C. elegans coltivate su piastre contenenti 0,3 DGLA mm (20:03 n-6) diventano sterili a causa della distruzione delle cellule germinali in entrambi palco e adulti nematodi larvali.
   1. Preparare una popolazione sincronizzato di L1 larve trattando ermafroditi gravide con soluzione di ipoclorito alcalino (per una soluzione di 10 ml: 0,5 ml di NaOH 5 M, 2,5 ml di candeggina, e 7 ml H ₂ O). Agitare delicatamente gli ermafroditi gravide in questa soluzione fino a quando il verme adultos dissolvenza. Le uova saranno conservati e possono essere pellet per centrifugazione a bassa velocità.
   2. Lavare preparazione uovo 3 volte in tampone M9 (3 g di KH ₂ PO _4, 6 g di Na ₂ HPO _4, 5 g NaCl, 1 ml di 1 M MgSO _4, H ₂ O a 1 L. Aggiungi MgSO ₄ dopo la sterilizzazione in autoclave). Per fornire abbastanza ossigeno, risospendere le uova in un tubo di plastica da 15 ml per un volume finale di 5 ml di tampone M9 e roccia su un agitatore notte.
   3. L1 larve deve essere aggiunto alle piastre, completata due giorni dopo la semina con OP50, o un giorno dopo placcatura batteri RNAi. Incubare vermi a 20 ° C per tre giorni fino a raggiungere lo stadio adulto.
2. Vermi adulti possono essere lanciati per la sterilità utilizzando un microscopio da dissezione con abbastanza alto ingrandimento per visualizzare gli embrioni in via di sviluppo in utero. Perdita di cellule germinali successo apparirà come un utero chiaro vuoto di uova.
3. I worm possono anche essere ottenuto mediante la fissazione e colorazione con la nucleico uncid colorante diamindinophenylindole (DAPI), che facilita la visualizzazione dei nuclei nelle cellule germinali e embrioni di sviluppo. Una macchia DAPI rapida si ottiene prelevando vermi in una goccia di tampone M9 su un vetro d'orologio ^9.
   1. Flood vetro di orologio con 1 ml di 0,2 ng / m. DAPI in soluzione di etanolo al 95%, lasciar riposare per circa 5 min.
   2. Scegli vermi in una goccia di Vectashield su un vetrino, e poi coprire con un vetrino.
   3. Seal vetrino e conservare a 4 ° C al buio durante la notte per la colorazione ottimale, tuttavia diapositive possono anche essere visualizzati immediatamente. Punteggio di presenza o assenza di nuclei di cellule germinali usando un microscopio a fluorescenza equipaggiato con una lampada UV e filtro.

3. Confermando Fatty Acid assorbimento da gascromatografia

Nel complesso composizione di acidi grassi C. elegans possono essere determinate con la produzione di esteri metilici degli acidi grassi (FAME), che vengono poi separati e quantificate usando chr gasomatography ^4.

1. Raccogliere 500-1000 vermi adulti da loro lavando via delle piastre con acqua e trasferimento in un silanizzata 13 millimetri x 100 millimetri tubo tappo a vite in vetro.
2. Lasciate che i vermi si depositano per gravità, e quindi rimuovere quanta più acqua possibile con una pipetta Pasteur di vetro.
3. Lavare worm una volta con acqua, e poi di nuovo eliminare quanta più acqua possibile.
4. FAMEs sono formati aggiungendo 1 ml di 2,5% H ₂ SO ₄ in metanolo, quindi riscaldamento a 70 ° C per 1 ora in un bagno d'acqua.
5. Rimuovere i tubi dal bagnomaria e lasciare raffreddare per 1 min.
6. Estrarre FAMEs aggiungendo 1,5 ml di acqua e 0,25 ml di esano.
7. Tubi Recap e agitare vigorosamente.
8. Provette da centrifuga in una centrifuga da tavolo clinico per 1 min alla massima velocità per separare esano dal solvente acquoso.
9. Trasferire esano (strato superiore) per un inserto GC fiala in una fiala GC, facendo attenzione a non trasferire qualsiasi della fase acquosa. Per GC unanalisi, 1-2 ml di FAMEs in esano viene iniettato in un capillare gascromatografia in colonna polare adatto per l'analisi FAMEs. Il Agilent 7890 GC iniettore è fissata a 250 ° C, con una portata di 1,4 ml / min, e il forno GC è programmato per una temperatura iniziale di 130 ° C, che è tenuto per 1 min. Successivamente, la temperatura viene rampa 10 ° C / min fino a 190 ° C, e poi rampa di nuovo a 5 ° C / min fino a 210 ° C e mantenuta ancora per 1 min.
10. Per garantire è verificato che l'assorbimento di DGLA, analizzare FAMEs dalla ionizzazione di fiamma rilevamento (FID) o spettrometria di massa (MS) rilevazione, utilizzando standard autentici per l'identificazione del C. elegans acidi grassi.

Risultati

Integrazione del C. elegans dieta è limitato dalla capacità della fonte alimentare batterica all'assorbimento e incorporare acidi grassi nella membrana batterica. Per determinare la capacità di E. coli OP50 assimilare diversi acidi grassi nelle sue membrane, OP50 è stato placcato su supporto senza supplemento, 0,1 mM e 0,3 mM concentrazioni di acido stearico (18:00), oleato di sodio (18:01 n-9), e sodio DGLA (20 : 3n-6). Le piastre sono state essiccate a temperatura ambiente per 2 giorni al bui...

Discussione

Qui si descrive un metodo di supplementazione di C. elegans con acidi grassi insaturi nella dieta. Come accennato in precedenza, è necessario prestare attenzione nella preparazione di piatti PUFA, completata perché la natura reattiva dei doppi legami in PUFA causa questi acidi grassi siano sensibili all'ossidazione mediante calore e luce ^11. Per evitare l'ossidazione, è importante aggiungere il PUFA al mezzo liquido agar dopo che il supporto è raffreddato a 55 ° C e memorizza le piastre ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bacto-Agar	Difco	214010
Tryptone	Difco	211705
NaCl	J.T. Baker	3624-05
Tergitol	Sigma	NP40S-500mL
Cholesterol	Sigma	C8667-25G	(5 mg/mL in ethanol)
MgSO4	J.T. Baker	2504-01
CaCl2	J.T. Baker	1311-01
K2HPO4	J.T. Baker	3254-05
KH2PO4	J.T. Baker	3246-05
Sodium dihomogamma linolenate	NuCHEK	S-1143
Warm sterile Millipore water
Sterile water for collecting worms
Nuclease-free Water for DGLA stock solution	Ambion	AM9932
Ampicillin	Fisher Scientific	BP1760-25	100 mg/ml in water (for RNAi plates)
Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)	Gold Biotechnology	12481C100	1 M in water (for RNAi plates)
HSO4	J.T. Baker	9681-03
Methanol	Fisher Scientific	A452-4
Hexane	Fisher Scientific	H302-4
diamindinophenylindole (DAPI)	Sigma	D9542
VectaShield	Vector Laboratories	H-1000
Glass Flask	Corning	4980-2L
Autoclaveable Glass bottles with stirbars	Fisherbrand	FB-800
Autoclaveable Glass Graduated Cylinder	Fisherbrand	08-557
Stir Plate	VWR	97042-642
Waterbath at 55+ °C	Precision Scientific Inc.	66551
Screwcap Brown Glass Vial	Sun SRI	200 494
Argon gas tank
Automated Pipette aid	Pipette-Aid	P-90297
Sterile Serological Pipettes (25 ml)	Corning	4489
Bunsen Burner	VWR	89038-534
Dissection microscope	Leica	TLB3000
Silanized glass tube	Thermo Scientific	STT-13100-S	for FAMEs derivitization
PTFE Screw caps	Kimble-Chase	1493015D
Clinical tabletop centrifuge	IEC
GC Crimp Vial	SUN SRi	200 000
GC Vial Insert	SUN SRi	200 232
GC Vial cap	SUN SRi	200 100
Gas Chromatograph	Agilent	7890A
Mass Spectrometry Detector	Agilent	5975C
Column for gas chromatography	Suppelco	SP 2380	30 m x 0.25 mm fused silica capillary column