תוספת תזונתית של חומצות שומן רב בלתי רוויות ב<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

Summary

Elegan Caenorhabditis הוא מודל שימושי כדי לחקור את הפונקציות של חומצות שומן רב בלתי רוויות בפיתוח ופיזיולוגיה. פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה להשלמת ג elegans דיאטה עם חומצות שומן רב בלתי רוויות.

Abstract

חומצות שומן חיוניות לתפקודים תאיים רבים. הם משמשים מולקולות אחסון אנרגיה יעילה כמו, מרכיבים את הליבה ההידרופובי של ממברנות, ולהשתתף במסלולי איתות שונים. Caenorhabditis elegans מסנתז את כל האנזימים הדרושים לייצור מגוון של חומצות אומגה -6 ואומגה -3. זה, בשילוב עם האנטומיה ומגוון של כלים גנטיים זמינים הפשוטים, להפוך אותו למודל אטרקטיבי ללמוד לתפקד של חומצות שומן. על מנת לחקור את המסלולים הגנטיים המתווכים את ההשפעות הפיזיולוגיות של חומצות שומן בתזונה, פיתחנו שיטה כדי להשלים את ג דיאטת elegans עם חומצות שומן בלתי רוויות. תוספת היא אמצעי יעיל כדי לשנות את הרכב חומצות שומן של תולעים ויכולה לשמש גם כדי להציל את הפגמים במוטנטים חומצת שומן לקוי. השיטה שלנו משתמשת באגר נמטודות צמיחה הבינוני (NGM) בתוספת מלחי acidsodium השומן. חומצות השומן בתוספת הצלחות הפכו incorporaטד לממברנות של מקור החיידקים שבמזון, אשר לאחר מכן הוא נלקח על ידי ג elegans שניזונים מהחיידקים בתוספת. גם אנו מתארים פרוטוקול גז כרומטוגרפיה לעקוב אחר השינויים בהרכב חומצות שומן המתרחשים בתולעים בתוספת. זוהי דרך יעילה כדי להשלים את התזונה של אוכלוסיות קטנות וגדולות של ג elegans, המאפשר מגוון רחב של יישומים לשיטה זו.

Introduction

חומצות שומן הם מרכיבים חיוניים מבניים של ממברנות, כמו גם מולקולות אחסון אנרגיה יעילה. בנוסף, יכולות להיות ביקע חומצות שומן מקרומים תאיים על ידי lipases ולהיות שונה אנזימים כדי לייצר effectors איתות ^1. חומצות שומן רב בלתי רוויות באופן טבעי (PUFAs) מכילות שניים או יותר קשרים כפולים cis. אומגה 3, חומצות השומן וחומצות שומן אומגה 6 נבדלות זה מזה המבוססים על עמדותיהם של קשרים כפולים ביחס לסוף מתיל של חומצת השומן. תזונה בריאה דורשת שתי אומגה 3, חומצות שומן אומגה 6 ו. עם זאת, תזונה מערבית עשירה במיוחד באומגה 6 וחומצות שומן ודלות באומגה 3, חומצות שומן. גבוהה של אומגה 6 לאומגה 3 יחס חומצת שומן קשורה לסיכון מוגבר למחלות לב וכלי דם ודלקת, עם זאת, הפונקציות מועילות ומזיקות המדויקים של חומצות שומן מסוימות אינן מובנות ² כן. Elega Caenorhabditis התולעת העגולהNS הוא שימושי בחקר התפקוד של חומצות שומן כי זה מסנתז את כל האנזימים הדרושים לייצור מגוון של חומצות אומגה -6 ואומגה -3, כולל desaturase אומגה 3, פעילות שאינה קיים ברוב בעלי החיים ^3,4. מוטנטים חסרי אנזימי desaturase חומצת שומן מצליחים לייצר PUFAs הספציפית, מה שמוביל למגוון של ליקויים התפתחותיים ונוירולוגי ^4-6.

כדי לחקור את ההשפעות הפיזיולוגיות של חומצות שומן בתזונה, פיתחנו assay ביוכימיים בקנה אחד עם ניתוח גנטי הן באמצעות מוטציה וטכניקות לדפוק למטה RNAi בג elegans. תוספת של PUFAs הספציפית מושגת על ידי הוספת תמיסת מלח נתרן חומצת שומן למדיום אגר לפני המזיגה. התוצאה היא ספיגת PUFA על ידי א ' מקור מזון coli, שבו הוא מצטבר בקרומים חיידקיים. ג elegans לבלוע חיידקי PUFA המכיל, ותוספי תזונה די בכך כדי להציל את defects של מוטציות PUFA לקויות. תוספת של רוב חומצות שומן אין השפעות מזיקות על בעלי חיים מסוג בר, לעומת זאת, חומצות ספציפיות אומגה 6 וחומצות שומן, במיוחד חומצת dihomo גמא לינולנית (DGLA, 20:03 n-6) גורם להרס קבוע של ג תאי נבט elegans ^7,8.

גז כרומטוגרפיה משמשת כדי לפקח על הספיגה של חומצות שומן בתוספת במקור חיידקי מזון (או OP50 או HT115), כמו גם בנמטודות. התוספת של Tergitol חומר הניקוי (NP-40) בתקשורת מאפשרת חלוקה שווה של חומצות שומן דרך כל הצלחת והספיגה יעילה יותר של חומצות שומן על ידי א ' coli ונמטודות. מצאנו כי חומצות שומן בלתי רוויות נלקחות בקלות על ידי חיידקים וג elegans, אבל הספיגה של חומצות שומן רוויות היא הרבה פחות יעיל. מאמר זה יתאר צעד אחר צעד כיצד להשלים את התקשורת אגר עם חומצות שומן, כמו גם כיצד לפקח על ספיגת חומצת שומן בהנמטודות דואר באמצעות גז כרומטוגרפיה.

Protocol

חומצות שומן רב בלתי רוויות הן רגישות לחום, אור וחמצן. לכן, יש להקפיד בעת הכנת צלחות תוספי חומצת שומן כך שחומצות שומן אינן חשופות לחום והאור עודפים. תקשורת NGM מכילה 0.1% Tergitol (NP-40) היא autoclaved ומקורר באופן חלקי, לאחר שמלחי נתרן חומצת שומן נוספים עם ערבוב מתמיד. הצלחות להתייבש בחושך. ספיגה של חומצות שומן על ידי ג elegans תרבית על צלחות אלה אז יכולים להיות במעקב על ידי גז כרומטוגרפיה.

1. הכנה של חומצות שומן בתוספת תקשורת

1. למדוד את רכיבי תקשורת לבקבוק בגודל מתאים. לכל 1 ליטר, להוסיף 17 גרם Bacto-אגר, 2.5 tryptone גרם, 3 גרם NaCl, 1 מיליליטר כולסטרול 5 מ"ג / מיליליטר מומס באתנול, ו10 מיליליטר 10% Tergitol מומסים במים.
2. הוסף 80% מנפח רצוי הסופי של המים Millipore וחיטוי התקשורת יחד עם בקבוקי זכוכית ריקה (שווה למספר שונהריכוז חומצות שומן להיבדק), כמו גם מתאים סיים צילינדרים.
3. מדיה מגניב באמבט מים מוגדר 55 ° C. בעוד התקשורת היא הקירור להכין פתרון המניות החוזרת בסך של מלח נתרן של חומצות שומן על ידי שבירה הפתוחה בקבוקון הזכוכית, תוך שימוש באמצעי בטיחות ולהבטיח חלקיקי זכוכית לא מתערבבים עם חומצות השומן. לשקול את חומצת שומן מספיק כדי להפוך את המניה עובדת 100 מ"מ.
4. תביא את פתרון חומצת שומן לריכוז סופי של במים מטוהרים 100 מ"מ. מלא המסת מלח נתרן חומצת שומן בדרך כלל לוקחת בערך 20-30 דקות. טהר את המניות החוזרות של חומצת שומן עם ארגון או חנקן, בגלל מגע עם גז אינרטי מונע חמצון. מכסה את הבקבוקון ולאחסן את המניה עובדת בחושך עד התקשורת התקררה.
5. (אופציונאלי) אם תקשורת RNAi היא רצויה, למדוד אמפיצילין ופתרונות איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) כאן.
6. כאשר אגר מתקרר ל55 ° C להוסיף לL 1: 1מיליליטר של 1 M MgSO _4, 1 מיליליטר של 1 M CaCl _2, ו25 מיליליטר של חיץ פוספט (ז KH 108.3 ₂ PO ₄ ו35.6 g K ₂ HPO ₄ לL 1 autoclaved). הוסף את אמפיצילין מעוקר המסנן ופתרונות IPTG אם עושה צלחות RNAi. לכל סוגי צלחות, להוסיף מים סטריליים כדי להביא את הנפח הסופי תקשורת ל1 ל '
7. ליד להבה, להעביר את התקשורת לautoclaved והגודל מתאים גליל סיים ולאחר מכן להוסיף את המים סטריליים חמים לעצמה רצויה. להעביר את התקשורת בחזרה לבקבוק ראשוני ומערבבים על ידי ערבוב.
8. ליד להבה, להעביר את התקשורת למספר הבקבוקים שווים למספר של ריכוזים להיבדק על ידי מדידה עם autoclaved וגודל מתאים גליל סיים. לשמור על תקשורת aliquoted כנוזלי באמצעות אמבט מים עד שהמנייה פועלת חומצת השומן נמסה באופן מלא.
9. הנח בקבוק אחד בצלחת ומערבבים ומערבבים עד שהתקשורת היא חמה למגע, אך לא חמה. הקפד להשאיר את עצמך מספיקזמן לבחוש בפתרון מניות חומצת שומן ויוצקים צלחות לפני התקשורת מתחילה לחזק. אם צלחת ומערבבים יש בקרת טמפרטורה, להגדיר אותו 55 ° C.
10. לדלל את המניות פועלות חומצת שומן 100 מ"מ לתוך התקשורת לריכוז הסופי הרצוי. תקשורת ומערבבים עד שהמשקע הלבן היא בפתרון (כ 1 דק '). תקשורת עדיין עשויה להיות מעט מעונן לאחר מכן.
11. (אופציונאלי) אם תקשורת RNAi היא רצויה אמפיצילין תוספת ל0.1 מ"ג / מיליליטר ו IPTG ל2 מ"מ ריכוז סופי.
12. יוצקים תקשורת באמצעות סיוע פיפטה אוטומטית וטפטף מיליליטר סטרילי 25, והוסיף 8 מיליליטר של תקשורת ל60 צלחת מ"מ או 25 מיליליטר של תקשורת לכל 100 צלחת מ"מ. חזור בנוסף חומצת שומן וצלחת לשפוך צעדים לבקבוקים שנותרו.
13. לאחר אגר יש הקרושה, לכסות את הצלחות בתוספת חומצת שומן עם תיבה או לאחסן בטמפרטורת חדר במגירה פרקה היטב כדי להגן מפני התחמצנות אור.
14. זרע E. coli OP50 לצלחות יומיים לאחר הצלחות התייבשו.לצלחות 60 מ"מ, פיפטה 300 μl של תרבות לילה OP50 (גדלה על 37 מעלות צלזיוס). אם צלחות RNAi נוצקו, זרע עם 300 μl של חיידקי RNAi לאחר הצלחות התייבשו במשך ארבעה ימים. זמן ייבוש פלייט ייתכן שיצטרך להיות מותאם, בשל הבדלים בלחות בסביבות מעבדה שונות.
15. דגירה הצלחות בסביבה חשוכה בטמפרטורת חדר ואילו דשא החיידקים מתייבש.

2. גרימת הרס תאים נבט על ידי תוספת של DGLA

1. C. elegans גדל על צלחות המכילות 0.3 מ"מ DGLA (20:03 n-6) הפך עקר בשל ההרס של תאי נבט בשני נמטודות הבמה והמבוגר הזחל.
   1. הכן את אוכלוסייה מסונכרנת של זחלי L1 ידי טיפול הרמפרודיטים הרה להולדת עם פתרון היפוכלוריט אלקליין (לפתרון 10 מיליליטר: 0.5 מיליליטר של 5M NaOH, 2.5 מיליליטר של אקונומיקה, ו7 מיליליטר H ₂ O). נער בעדינות את הרמפרודיטים הרה להולדת בפתרון זה עד שהתולעת הבוגרתים לפזר. ביצים יישמרו, וניתן pelleted על ידי צנטריפוגה במהירות הנמוכה.
   2. שטוף הכנת ביצה 3 פעמים בחיץ M9 (ז KH 3 ₂ PO _4, 6 גרם Na ₂ HPO _4, 5 גרם NaCl, 1 מיליליטר 1 M MgSO _4, H ₂ O ל 1 ל הוסף ₄ MgSO לאחר מעוקר). כדי לספק מספיק חמצן, resuspend את הביצים בצינור פלסטיק 15 מיליליטר לנפח סופי של 5 מיליליטר של חיץ M9 ורוק על שייקר לילה.
   3. זחלי L1 יש להוסיף לצלחות בתוספת שני ימים לאחר זריעה עם OP50, או יום אחד לאחר ציפוי חיידקי RNAi. דגירה תולעים ב20 מעלות צלזיוס למשך שלושה ימים או עד שהם מגיעים לשלב הבוגר.
2. תולעים בוגרות יכולות להיות הבקיע על סטריליות באמצעות מיקרוסקופ לנתח עם הגדלה גבוהה מספיק כדי לדמיין את העוברים המתפתחים ברחם. אובדן תאי נבט מוצלח יופיע כחלל רחם ברור של ביצים.
3. יכולים גם להיות הבקיע תולעים על ידי תיקון וצביעה עם הגרעיןdiamindinophenylindole CID צבע (DAPI), המאפשר ההדמיה של גרעינים בתאי נבט ועוברים מתפתחים. כתם DAPI מהיר מושגת על ידי בחירת תולעים לירידה של חיץ M9 על watchglass ^9.
   1. מבול שעון זכוכית עם 1 מיליליטר של 0.2 ng / m. DAPI ב95% אתנול פתרון, תנו לשבת במשך כ 5 דקות.
   2. פיק תולעים לירידה של Vectashield בשקופית, ולאחר מכן לכסות עם coverslip.
   3. coverslip החותם ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס בלילה החשוך עבור מכתים אופטימלי, עם זאת, ניתן גם לראות שקופיות באופן מיידי. ציון לקיומו או העדרו של גרעין תא חיידק באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד במנורת UV ומסנן.

3. המאשר את חומצת שומן ספיגה על ידי גז כרומטוגרפיה

הרכב חומצות שומן כולל של ג elegans יכול להיקבע על ידי ייצור אסטרים מתילים של חומצות שומן (fames) אשר לאחר מכן הם נפרדו ולכמת באמצעות Chr גזomatography ^4.

1. לאסוף 500-1,000 תולעים בוגרות על ידי שטיפתם מעל הצלחות עם מים והעברה לצינור silanized 13 מ"מ x 100 מ"מ בורג זכוכית עליון.
2. בואו תולעים ליישב על ידי כוח הכבידה, ולאחר מכן להסיר כמה שיותר מים ככל האפשר עם זכוכית פיפטה פסטר.
3. לשטוף תולעי פעם אחת עם מים, ולאחר מכן שוב להסיר כמה שיותר מים ככל האפשר.
4. Fames נוצרים על ידי הוספת 1 ​​מיליליטר של .2.5% H ₂ SO ₄ במתנול, ולאחר מכן חימום ב70 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 באמבט מים.
5. הסר את הצינורות מן אמבט המים ולקרר דקות 1.
6. לחלץ fames ידי הוספת 1.5 מיליליטר מים ו0.25 מיליליטר של הקסאן.
7. צינורות וRecap לנער במרץ.
8. צנטריפוגה צינורות בצנטריפוגה קלינית שולחן 1 דקות במהירות המרבית כדי להפריד הקסאן מממס מימיים.
9. העבר הקסאן (שכבה עליונה) כדי להוסיף בקבוקון GC בתוך בקבוקון GC, נזהר שלא להעביר כל השלב מימי. לGCnalysis, 1-2 μl של fames בהקסאן מוזרק על עמודת גז כרומטוגרפיה קוטב נימים מתאימה לניתוח fames. מזרק GC Agilent 7890 מוגדר ב250 מעלות צלזיוס, עם קצב זרימה של 1.4 מיליליטר / דקה, ותנור GC מתוכנת לטמפרטורה ההתחלתית של 130 ° C, המוחזקת על דקות 1. בהמשך לכך, הטמפרטורה היא ramped 10 ° C / min עד 190 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן שוב בramped 5 ° C / min עד 210 מעלות צלזיוס והוחזקה במשך 1 דקות נוספות.
10. כדי להבטיח ספיגה של DGLA אירעה, לנתח fames ידי זיהוי להבת יינון (FID) או ספקטרומטריית מסת זיהוי (MS), תוך שימוש בסטנדרטים אותנטיים לזיהוי ג elegans חומצות שומן.

תוצאות

תוספת של ג דיאטת elegans היא מוגבלת על ידי יכולתו של מקור חיידקים שבמזון לספיג ולשלב חומצת שומן לתוך קרום החיידק. כדי לקבוע את היכולת של א ' coli OP50 להטמיע חומצות שומן שונות לקרומיו, OP50 היה מצופה על תקשורת ללא תוספת, 0.1 מ"מ ו0.3 ריכוזי מ"מ של חומצה סטארית (18...

Discussion

כאן אנו מתארים שיטה של תוספת של ג elegans עם חומצות שומן בלתי רוויות בתזונה. כפי שהוזכר לעיל, יש להקפיד בהכנת צלחות PUFA תוספת בגלל אופי התגובה של הקשרים כפולים בPUFAs גורם לחומצות שומן אלו להיות רגישות לחמצון באמצעות חום ^ו11 אור. כדי למנוע חמצון, חשוב להוסיף PUFA למדי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bacto-Agar	Difco	214010
Tryptone	Difco	211705
NaCl	J.T. Baker	3624-05
Tergitol	Sigma	NP40S-500mL
Cholesterol	Sigma	C8667-25G	(5 mg/mL in ethanol)
MgSO4	J.T. Baker	2504-01
CaCl2	J.T. Baker	1311-01
K2HPO4	J.T. Baker	3254-05
KH2PO4	J.T. Baker	3246-05
Sodium dihomogamma linolenate	NuCHEK	S-1143
Warm sterile Millipore water
Sterile water for collecting worms
Nuclease-free Water for DGLA stock solution	Ambion	AM9932
Ampicillin	Fisher Scientific	BP1760-25	100 mg/ml in water (for RNAi plates)
Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)	Gold Biotechnology	12481C100	1 M in water (for RNAi plates)
HSO4	J.T. Baker	9681-03
Methanol	Fisher Scientific	A452-4
Hexane	Fisher Scientific	H302-4
diamindinophenylindole (DAPI)	Sigma	D9542
VectaShield	Vector Laboratories	H-1000
Glass Flask	Corning	4980-2L
Autoclaveable Glass bottles with stirbars	Fisherbrand	FB-800
Autoclaveable Glass Graduated Cylinder	Fisherbrand	08-557
Stir Plate	VWR	97042-642
Waterbath at 55+ °C	Precision Scientific Inc.	66551
Screwcap Brown Glass Vial	Sun SRI	200 494
Argon gas tank
Automated Pipette aid	Pipette-Aid	P-90297
Sterile Serological Pipettes (25 ml)	Corning	4489
Bunsen Burner	VWR	89038-534
Dissection microscope	Leica	TLB3000
Silanized glass tube	Thermo Scientific	STT-13100-S	for FAMEs derivitization
PTFE Screw caps	Kimble-Chase	1493015D
Clinical tabletop centrifuge	IEC
GC Crimp Vial	SUN SRi	200 000
GC Vial Insert	SUN SRi	200 232
GC Vial cap	SUN SRi	200 100
Gas Chromatograph	Agilent	7890A
Mass Spectrometry Detector	Agilent	5975C
Column for gas chromatography	Suppelco	SP 2380	30 m x 0.25 mm fused silica capillary column