评估肌反应及血管活性阻力肠系膜动脉使用压力肌动描记

摘要

压力肌动描记用于评估小动脉的持续发展压力收缩时血管活性。这份手稿提供了一个详细的协议在小肠系膜动脉大鼠，血管活性和腔内压力对血管直径的影响隔离段评估。

摘要

阻力小动脉收缩，并分别以响应增加或减少腔内压力扩张;这种现象被称为肌源性反应是局部血流量的重要调节器。在等压条件下阻力小动脉持续养成收缩称为肌音（MT），这是全身血管阻力（SVR）的主要决定因素。因此，阻力小动脉体外加压制剂的主要工具来研究微血管功能在近生理状态。为了实现这一目标，一个小的阻力动脉（直径〜260微米）的新鲜分离的完好分段被安装到两个小玻璃套管并加压。这些动脉制剂保留大部分体内特性和血管张力的实时许可证评估。在这里，我们为评估在大鼠加压阻力小肠系膜动脉血管活性详细的协议;这些动脉开发持续的血管收缩 - 最大直径的约25％ - 当在70毫米汞柱压力。这些动脉制剂可用于研究研究化合物对动脉内压力和血管活性之间关系的影响，并确定在各种疾病的动物模型的改变微血管功能。

引言

小阻力动脉是SVR的主要决定因素，并在许多疾病^1,2的病理生理学中发挥重要作用。条件如糖尿病^3，妊娠^4，缺血再灌注^5，肥胖和高血压^6,7-经常与改变微血管功能相关联。血管肌动描记不仅可以提供重要的见解在各种疾病中的变化微血管功能也有助于确定治疗目标和评估血管活性化合物的功效。血管的功能已经被使用等距或等压容器的条件下^，8孤立的小动脉的影响。等距肌动描记的详细描述在其他地方提供了^9。不过，也有来自等距获得与等压制剂^10-12数据的差异。因为加压动脉制剂允许微血管功能的研究在近生理条件下，该得到的结果可能会与相关的血管床^8,13 体内的行为更好。

1902年，拜里斯首次描述血管直径¹⁴透压力的影响。他观察到在从兔，猫，狗的各种血管床中压力的降低随后的血管舒张小阻力动脉，并增加了压力，随后由血管收缩。这种现象被称为肌应答。贝利斯和随后的调查发现，在等压条件下阻力小动脉持续发展的收缩称为MT ^15,16。既生肌响应和MT可以通过使用压力肌动描记（PM）的技术进行评估。 PM主要用于确定小动脉，静脉等血管血管活性。除了评估血管直径血管活性化合物的作用，PM - 顾名思义 - 用来评估血管内压力介导的CH安格斯对血管的直径。在过去的几十年中前进在计算机软件，这增强视频显微镜和玻璃吸管拉动，取得了下午更容易执行。然而，小血管存活完好分段解剖仍然繁琐，有时具有挑战性。在这里，我们勾勒出一个详细的协议，以研究在小肠系膜动脉阻力来自大鼠分离生肌响应。

研究方案

这里显示的例子是来自佐治亚大学校务经IACUC实验 - 协议编号:＃2011-0408

1.准备试剂

1. 准备剥离液货:500毫升股票清扫液（5倍），溶解21.18克氯化钠，0.875克氯化钾，0.739克_硫酸镁 ，1.049克MOPS和450毫升的Milli-Q水0.019克EDTA。调节pH至7.3-7.4用1N NaOH洗涤。补足体积至500ml用Milli-Q水。原液可以存储多达7-10天。请参考表1化学品及其供应商的列表。 见表2;以毫米浓度。
2. 准备工作夹层解决方案:准备新的工作夹层解决方案的每一天。 100 ml工作溶液，溶解0.091克葡萄糖，0.016克的NaH ₂ PO ₄和0.022克丙酮酸钠在79.8毫升的Milli-Q水中。中加入0.2ml 1M _氯化钙和20毫升夹层解决方案的股票带来VOLU我到100毫升。
3. 制备生理盐溶液（PSS）:制备千毫升PSS，溶解0.365克氯化钾，6.545克氯化钠，0.296克_硫酸镁 ，0.163克KH ₂ PO _4，2.072克葡萄糖，2.184克_碳酸氢钠和2.383在950毫升ģHEPES的Milli-Q水。调节pH至7.3-7.4用1N NaOH洗涤。补足体积至1000毫升Milli-Q水。除去加入2ml溶液，并将其用2ml的1M的CaCl ₂代替。 （PSS鲜需要每天准备）
4. 准备钙（Ca ^2+）免费PSS:对于100mL来说PSS无^钙 ，溶解0.036克氯化钾，0.654克氯化钠，0.029克_硫酸镁 ，0.016克_{磷酸二氢钾} ，0.207克葡萄糖，0.218克_碳酸氢钠 ，0.238克HEPES，0.015克EGTA和0.0026克硝普钠（SNP）的95毫升Milli-Q水中。调节pH至7.3-7.4用1N NaOH洗涤。补足体积至100毫升用Milli-Q水。

2.制备玻璃插管

1. 拉玻璃吸管生成用吸管拉马按照生产商的指导100-150微米放倒插管。
2. 伞用微电极beveller玻璃套管末端，火擦亮他们用热探针由〜45°弯曲的玻璃套管末端。
3. 加载到插管微量座和附加的微支架上的灌注腔。

3.准备灌注腔

1. 冲洗灌注腔用Milli-Q水，然后用解剖溶液，每次5分钟。加载室用2ml解剖溶液。
2. 用10毫升注射器，并认真填写了整个套管和油管连接没有任何气泡通过插管吸解剖的解决方案。适用于吸轻轻地防止产生气泡。
3. 准备两缝线用半结利用每个钝钳。由于眼用单丝尼龙缝线（10-0，0.2公吨）用于制备只属于节直径1-2毫米，解剖显微镜，可能需要。
4. 解剖显微镜下可视化，用解剖钳来加载两个套管与局部封闭缝线结稍微远离尖。后来这些节将精心滑动到空心动脉末端和完全关闭。

从SD大鼠4.收集肠系膜动脉街机

1. 进行这些实验之前征得当地机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。房子的动物在控制温度和照明，并允许自由饮水和商业啮齿动物食物的动物设施中。
2. 通过腹膜内注射氯胺酮（80毫克/千克）和赛拉嗪（10毫克/千克）麻醉大鼠。经确认脚趾捏，如果需要额外的管理麻醉深度麻醉。
3. 确认手术麻醉后，用断头安乐死的动物。遵循UTI AAALAC指引lizing适当的方法对动物实施安乐死。
4. 用剪刀解剖和镊子从骨盆到胸骨进行中线剖腹手术。这样做是在两个步骤:首先，切开皮肤和第二，切开下面的肌肉层。必须注意不要伤及腹内脏器。
5. 切肠接近幽门和所述远端靠近回肠盲肠结的近端。分别配合两端，防止食糜和粪便从而避免细胞外液沐浴污染的泄漏。切开肠系膜在馈送脉管即 ，肠系膜上动脉接近其底部和整个小肠肠系膜床转移到50ml烧杯含冰冷夹层溶液。
6. 允许收获的组织留在冰冷的夹层中5分钟，用新鲜的解剖溶液冲洗摆脱血液。

5.分离的^第 4 ^次插管订单肠系膜动脉

1. 牵制在右手侧以SYLGARD涂层盘肠的近端。延长剩余肠中逆时针路径，钉扎的段向下传播肠系膜和暴露的血管（ 图1）。注意:我们分离在室温下动脉段。否则，我们把这道菜含冰肠系膜商场。一些实验室，包括在我们的机构，用冷水机组解剖动脉在4℃。
2. 在立体声变焦显微镜解剖了3 ^次和4 ^阶小肠系膜动脉（〜260微米）平行于用小剪刀小肠。首先剖析了所有的覆盖脂肪。然后解剖出的静脉和隔离带V形分支点的动脉。要小心，不要刺破所选段。开始解剖脂肪附近²阶分支，找到办法3 ^次或4 ^次 ORD呃船只。
   1. 注意:动脉和静脉可以基于他们的壁厚来区分 - 动脉壁比静脉的厚。此外，当相邻的结缔组织轻轻拉动垂直于血管，静脉容易崩溃，而动脉没有。由于动脉管腔直径<400微米是全身血管阻力主要场所，对于这个协议，我们采用4 ^阶大鼠肠系膜动脉（管腔直径<300微米）。
3. 隔离动脉平行的4-5毫米部到小肠。想象所有的5 ^阶分支嵌入到小肠，切成稍微远离分支的起源和保存的部分。分支的这些保留的部分作为保持部位（与解剖钳）用于传送的动脉段到灌注室，并随后引导插管。
4. 然后通过切口2远端切断动脉段在动脉上的每一侧的5 ^阶分支并将其转移到灌注腔（ 见图1C和说明）。
5. 使用镊子剥离按住动脉段与解剖钳提示:（100-150微米直径）的玻璃微的一个导管插入血管的一端。以前加载的局部封闭缝合滑入空心端和固定。注意:在动脉的近端可以被插入套管上，其连接到伺服控制压力调节装置的原位环境模仿玻璃套管。
6. 附加一个夹层溶液内有10毫升注射器连接到这个套管，使得在连接所述插管和旋塞油管夹层溶液合并与该注射器中的活塞。轻轻抬起注射器。在溶液中的重力将去除帧内血管血液从容器的开口端。除去动脉血液后，关闭水龙头。
   注意:可替代地，附加的活栓到压力控制器，其打开和压力轻轻增加至5-10毫米汞柱，以达到相同的结果。
7. 通过仔细使其他套管尽可能接近到动脉段的解开端扎血管的远端上的第二玻璃套管。以前加载的局部封闭缝合滑入空心端和固定。必须注意不能拉拽或拉动脉段。确保连接到两个插管旋塞关闭。
8. 转让灌注腔倒置显微镜配备了实时视频录制的阶段。
9. 连接套管连接到动脉段的近端到一个伺服控制压力调节装置的活塞，并确保活塞附连到其它插管保持关闭，以维持稳定的管腔内的压力。
10. 接着，附着在真空管连接到抽吸口的次的灌注管向腔室的灌注端口。
    注:斜口针端口用于抽吸和钝针端口用于灌注。
11. 通过单列直插溶液加热器启动容器的灌注用温的PSS（37℃，平衡的气体混合物:5％的CO _{2，5％O 2}和90％的N以保持中性pH和充分氧合^17）以2毫升/分钟使用蠕动泵。打开真空上也是如此。放置一个热敏电阻在室内连续监测温度。
12. 由于PSS在炉膛内的温度接近〜37℃（通常在5分钟内），慢慢增加腔内的压力为20〜100毫米汞柱，并检查血管是否有泄漏。这是通过使用压力调节器的自动压力设置。丢弃船只泄漏并更换另一段。与泄漏的容器将不能够保持压力。
13. 评估动脉段弯曲，同时保持在100毫米汞柱的压力。使用螺丝杆，将套管挺起动脉段。不要过度拉伸动脉段;我们的目标是在体内动脉段长度来模仿。
14. 降低压力至70毫米汞柱（ 在在肠系膜拱廊¹⁸ 体内压力模仿），并允许在动脉段稳定和发展生肌基调。 （40-70毫米汞柱）根据实验策略和血管床的动脉可以可变加压。以前发布的审查提供可变性的极好审查MT来自不同血管床动脉⁸段。

6.测量动脉直径

1. 在配备有一个单色视频电荷耦合器件照相机的显微镜视图动脉在10X物镜。利用视频图像采集和实时边缘检测系统测量管腔直径。 表3中提供了使用的设备的列表。
2. 监视和记录器Ðiameter不断。
3. 为观察MT的发展。注意:我们观察到，在大鼠肠系膜动脉阻力，在70毫米汞柱，MT的发展的特征在于，约20％的减少的直径。 MT根据血管床和动物物种而异。
4. 确认通过评估血管收缩和血管舒张反应为1μM苯福林（苯丙氨酸）和1μM的乙酰胆碱（ACh）的血管的生存能力。
5. 在每个实验结束时，确定被动直径（PD），通过将动脉在无Ca ²⁺的PSS 20分钟。

7.生肌响应

1. 降低压力至20毫米汞柱，并允许直径稳定。增加在增量步骤（20，40，60，80和100）的管腔内的压力，并在各压力步允许动脉以实现稳定的直径（通常在5分钟内）。
2. 降低腔内压力到20毫米汞柱和孵化^2+的 PSS含0.39毫米的Ca动脉段EGTA和0.1mM的SNP。允许动脉直径稳定（通常为15分钟）。
3. 重复在含0.39毫EGTA和0.1mM的SNP的Ca ²⁺ -free PSS中的压力阶跃响应。

8.解释成果数据，并计算

1. 计算的MT与根据以下计算直径观察的Ca ²⁺的百分差值含与无Ca ²⁺的PSS在每个压力:
   
2. 对动脉进行血管舒缩直径可以通过平均平顶阶段1分钟计算。根据关系表示所收集的数据作为最大松弛（％PD）的百分比:％PD = 100×[ΔD/ PD]; ΔD是前和添加任何试验化合物（ 例如苯丙氨酸）的后直径之间的差异; PD为被动直径（也最大直径）。

结果

一个典型的压力肌动描记设置示意图示于图1。将容器的两端插管用玻璃微并固定在两侧的缝合线。通过管道和开口旋塞，一个插管连接至伺服控制压力调节器;另一个套管连接到一个封闭的活栓。腔灌注有通过倒置显微镜相连的CCD摄像机观察PSS和血管直径的变化。

加压，在70毫米汞柱的动脉区段孵育在新鲜制备的温暖的PSS，流经动脉腔在2-4毫升/分钟，吸出。动脉?...

讨论

关键步骤，故障排除和修改

在典型的等压容器的准备，动脉被加压至灌注用温水（37℃）的PSS两个玻璃插管之间70毫米汞柱。后30-45分钟，动脉开发MT，其特征在于，稳定在20-30分钟的直径自发下降。从各种血管床的阻力动脉开发可变MT。例如大鼠阻力肠系膜动脉开发的MT〜PD的25％，而cremastric动脉可能实现的PD的MT〜40％。动脉没有在60分钟内开发MT应该被丢弃;这个持续时间可以根据...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Chemical
Acetylcholine	Sigma Aldrich	A6625
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma Aldrich	223506
D-(+)-Glucose	Sigma Aldrich	G5767
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetra acetic acid (EGTA)	Sigma Aldrich	E3889
Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA)	Sigma Aldrich	E9884
HEPES	Sigma Aldrich	H3784
Magnesium sulfate (MgSO4)	Sigma Aldrich	M7506
MOPS	Sigma Aldrich	M5162
Phenylephrine	Sigma Aldrich	P6126
Potassium chloride (KCl)	Sigma Aldrich	P3911
Potassium phosphate (KH2PO4)	Sigma Aldrich	P5655
Sodium bicarbonate (NaHCO3 )	Sigma Aldrich	S6014
Sodium chloride (NaCl)	Sigma Aldrich	S7653
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma Aldrich	S5881
Sodium nitroprusside	Sigma Aldrich	13451
Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2PO4)	Sigma Aldrich	S9638
Sodium pyruvate	Sigma Aldrich	P8574
			Table 1.
			Physiological salt solution (1000 ml) mM KCl 4.9 0.365 g NaCl 112 6.545 g MgSO4.7H2O 1.2 0.296 g KH2PO4 1.2 0.163 g Glucose 11.5 2.072 g NaHCO3 26 2.184 g HEPES 10 2.383 g CaCl2 2 2 ml (1M stock) De-ionized water 998 ml Ca2+ free physiological salt solution (100 ml) mM KCl 4.9 0.036 g NaCl 112 0.645 g MgSO4.7H2O 1.2 0.029 g KH2PO4 1.2 0.016 g Glucose 11.5 0.207 g NaHCO3 26 0.218 g HEPES 10 0.238 g EGTA 0.39 0.015 g Sodium nitroprusside 0.1 0.0026 g De-ionized water 100 ml Dissection solution, stock (500 ml) mM NaCl 145 21.18 g KCl 4.7 0.875 g MgSO4 1.2 0.739 g MOPS 2 1.049 g EDTA 0.02 0.019 g De-ionized water 500 ml Working dissection solution (100 ml) mM Dissection solution stock 20 ml Glucose 1.2 0.091 g NaH2PO4 5 0.016 g Sodium pyruvate 2 0.022 g CaCl2 2 0.2 ml (1M stock) De-ionized water 79.8 ml
			Table 2. Composition of Experimetnal solutions
			Equipment
CCD Monochrome Camera	The imaging Source	DMK 21AU04
Single inline solution heater	Warner Instruments	64-0102
Thermistor	Warner Instruments	64-0108
Dual automatic temperature controller	Warner Instruments	TC-344B
Flaming/Brown micropipette puller	Sutter Instruments	P-97
Fluorescence System Interface	IonOptix	model FSI-700
Forceps and scissors	World Precision Instruments
Ion Wizard-Core and Analysis	IonOptix	Ion Wizard 6.0
Laboratory tubing	Silastic	508-005
Male Sprague Dawley rat	Harlan Laboratories
Master flex console drive	Cole-parmer
Milli-Q Plus Ultrapure Water System	Millipore	ZD5211584
Ophthalmic monofilament nylon suture	Ethicon	9007G
Photometry and Dimensioning Microscope	Motic	AE31
Pressure Servo Controller with peristaltic pump and pressure transducer	Living Systems Instrumentation	PS-200
Stereomicroscope	Nikon Instruments Inc	SMZ660
Vessel Chamber	Living Systems Instrumentation	CH-1
Dissection dish	Living Systems Instrumentation	DD-90-S
Thin Wall Glass Capillaries	World Precision Instruments	TW120-6
Microforge	Stoelting	51550
			Table 3.