Оценка Миогенный ответ и вазоактивности В Сопротивление брыжеечных артерий, используя миография давления

Резюме

Миография давления используется для оценки вазоактивности из мелких артерий, которые развиваются длительное сужение, когда под давлением. Эта рукопись содержит подробный протокол оценки в отдельных сегментах малого брыжеечных артерий от крыс, вазоактивности и влияния внутриполостной давление на сосудистой диаметре.

Аннотация

Мелких артерий сопротивления сужают и расширяют, соответственно, в ответ на повышенной или пониженной внутрипросветный давление; Это явление известно как миогенного ответ является ключевым регулятором локального кровотока. В изобарических условиях мелкие артерии сопротивления развиваются устойчивый сужение известный как миогенной тон (МТ), который является основным фактором, определяющим системного сосудистого сопротивления (СВР). Следовательно, экс естественных условиях под давлением препараты мелких артерий сопротивления являются основными инструментами для изучения функции микрососудов в почти физиологических состояниях. Чтобы достичь этого, свежевыделенные нетронутыми сегмент малое сопротивление артерии (диаметр ~ 260 мкм) установлен на двух небольших стеклянных канюли и давлением. Эти препараты артериальных сохранить большинство в естественных характеристик и оценки разрешения сосудистого тонуса в режиме реального времени. Здесь мы предлагаем подробный протокол для оценки вазоактивности в небольших давлением сопротивление брыжеечных артерий от крыс; эти артерии развиваютсяустойчивый вазоконстрикции - примерно 25% от максимального диаметра - при обработке давлением при 70 мм рт. Эти препараты артериальных могут быть использованы для изучения влияния исследуемых соединений на отношения между внутри-артериального давления и вазоактивности и определить изменения в функции микрососудов в животных моделях различных заболеваний.

Введение

Мелких артерий сопротивления являются основными факторами, определяющими СВР и играют важную роль в патофизиологии многих заболеваний ^1,2. Условия такие, как диабет, беременность ^{3 4} ишемии ^5, ожирение и гипертония ^6,7 часто ассоциируется с измененной функции микрососудов. Сосудистая миография может не только обеспечить важную информацию в изменения функции микрососудов в различных заболеваний, но также поможет определить терапевтические цели и оценивать эффективность вазоактивных соединений. Сосудистая функция была изучена с использованием выделенных мелкие артерии в изометрических или изобарических условиях сосудов ^8. Подробное описание изометрической миографии приводятся в других ^9. Однако есть различия в данных, полученных от изометрической против изобарических препаратов ^10-12. С давлением артериальные препараты позволяют исследование функции микрососудов в ближнем физиологических условиях,Полученные данные могут коррелировать с поведением в естественных условиях сосудистого русла ^8,13 лучше.

В 1902 году Бейлиса впервые описал эффект трансмурального давления на сосудистую диаметром ^14. Он отметил, в небольших артерий сопротивления от различных сосудистых руслах кроликов, кошек и собак, которые были затем снижение давления вазодилатация и повышение давления последовало вазоконстрикции. Это явление известно как миогенной ответ. Бейлиса и последующие исследователи отметили, что в условиях изобарических малое сопротивление артерий развивать устойчивый сужение известный как МТ ^15,16. Оба миогенной ответ и МТ может быть оценены с помощью миография давление (ПМ) метод. PM используется в основном для определения вазоактивности малых артерий, вен и других судов. В дополнение к оценке влияния вазоактивных соединений на сосудистой диаметре, ЛС - как следует из названия - используется для оценки внутрисосудистого давления опосредованной чАнж на сосудистой диаметре. За последние несколько десятилетий прогресс в программном обеспечении компьютера, который улучшенной видео микроскопии и стеклянной пипетки вытягивать, сделали ПМ легче выполнять. Тем не менее, рассечение жизнеспособных неповрежденных сегментах мелких кровеносных сосудов остается утомительным, а иногда и сложной задачей. Здесь мы приводим подробный протокол для изучения миогенную ответ в небольших брыжеечных артерий сопротивления, выделенных из крыс.

протокол

Примеры, показанные здесь, из экспериментов, утвержденными IACUC в Грузии Риджентс университет - Протокола №: # 2011-0408

1. Подготовка реагентов

1. Подготовка рассечение решение запас: Для 500 мл фондового рассечение раствора (5x), растворить 21,18 г NaCl, 0,875 г KCl, 0,739 г MgSO _4, 1,049 г швабры и 0,019 г ЭДТА в 450 мл Milli-Q воды. Регулировка рН до 7,3-7,4 с помощью 1 N NaOH. Макияж объем до 500 мл с Milli-Q воды. Исходный раствор может храниться до 7-10 дней. В таблице 1 приведен список химических веществ и их производителей. В таблице 2 концентрации в мм.
2. Подготовить рабочий раствор рассечение Подготовка свежий раствор рабочий рассечение каждый день. Для 100 мл рабочего раствора, растворить 0,091 г глюкозы, 0,016 г NaH ₂ PO ₄ и 0,022 г пирувата натрия в 79,8 мл Milli-Q воды. Добавить 0,2 мл 1М CaCl ₂ и 20 мл рассечение решение запас, чтобы принести võluмне 100 мл.
3. Подготовка физиологический солевой раствор (PSS): Для того, чтобы подготовить 1000 мл PSS, растворяются 0,365 г KCl, NaCl 6,545 г, 0,296 г MgSO _4, 0,163 г KH ₂ PO _4, 2.072 г глюкозы, 2.184 г NaHCO ₃ и 2,383 г HEPES в 950 мл Милли-Q водой. Регулировка рН до 7,3-7,4 с помощью 1 N NaOH. Макияж объем до 1000 мл с Milli-Q воды. Удалите 2 мл раствора и заменить его с 2 мл 1 М CaCl _2. (Свежий PSS должен быть готов ежедневно)
4. Подготовка кальция (Ca ²⁺⁾ бесплатно PSS: Для 100 мл PSS без Ca ^2+, растворить 0,036 г KCl, NaCl 0,654 г, 0,029 г MgSO _4, 0,016 г KH ₂ PO _4, 0,207 г глюкозы, 0,218 г NaHCO ₃ 0,238 г HEPES, 0,015 г ЭГТА и 0,0026 г натрия нитропруссид (SNP) в 95 мл Milli-Q воды. Регулировка рН до 7,3-7,4 с помощью 1 N NaOH. Макияж объем до 100 мл с Milli-Q воды.

2. Подготовка стекла канюли

1. Потяните стеклянных пипетокдля генерации 100-150 мкм наконечником канюли с помощью пипетки съемник как за производителя с руководящими принципами.
2. Конические кончики стекло канюли, используя микроэлектродного Кромкорез, огонь полировать их и согнуть советы стекло канюли от ~ 45 ° при помощи нагревателя зонда.
3. Загрузите канюли в держатель микропипетки и прикрепить держатель микропипетки на перфузии камеры.

3. Подготовка перфузии палаты

1. Промыть перфузии камера с Milli-Q водой с последующим рассечение раствора в течение 5 мин каждый. Загрузите камеру с 2 мл рассечение решения.
2. Всасывания рассечение решение через канюли, используя 10 мл шприц и заполнить внимательно весь канюли и прилагаемый трубки без каких-либо пузырьков. Применение всасывание осторожно, чтобы предотвратить образование пузырьков.
3. Приготовьте два швов с пол-узла друг тупыми щипцами. Так глазных швов мононити нейлона (10-0, 0,2 метрической) используются для подготовки узлов, которые только1-2 мм в диаметре, рассечение микроскоп могут быть необходимы.
4. Визуализация при вскрытии микроскопом, использовать рассечение пинцет, чтобы загрузить оба канюли с частично закрытыми шовных узлов немного далеко от кончика. Позже эти узлы будут скользнул тщательно на канюлированного артериальных концов и полностью закрыты.

4. Сбор брыжеечной артерии аркада от Спрэг Dawley крыс

1. Ищите одобрение местных институциональных уходу и использованию комитета животных (IACUC) до проведения этих экспериментов. Дом животные вивария с контролируемой температурой и освещением и обеспечить свободный доступ к воде и коммерческой корм для грызунов.
2. Обезболить крыс путем внутрибрюшинной инъекции кетамина (80 мг / кг) и ксилазина (10 мг / кг). Подтвердите глубокого наркоза по схождения крайнем случае и, если необходимо администрировать дополнительные анестетиков.
3. После подтверждения хирургической анестезии, эвтаназии животного путем обезглавливания. Следуйте AAALAC руководящие принципы для ИМПзующих соответствующие методы для эвтаназии животных.
4. Используйте рассечение ножницами и щипцами для выполнения середине строки лапаротомии от таза к грудине. Это делается в два этапа: сначала, надрезать кожу и во-вторых, надрезать основной слой мышц. Уход должны быть приняты, чтобы не травмировать внутри брюшной полости.
5. Вырезать проксимальный конец кишки близко к привратника и дистального конца вблизи подвздошно-слепой кишки перехода. Свяжите оба конца отдельно, чтобы предотвратить утечку химуса и фекалий, таким образом, избежать загрязнения внеклеточного раствора для купания. Надрезать брыжейки у ее основания около подачи сосудистой т.е. верхней брыжеечной артерии и передавать весь тонкого кишечника брыжеечной кровать в 50 мл химический стакан, содержащий охлажденному льдом раствору рассечение.
6. Разрешить ПРОМЫСЛОВЫЕ ткани, чтобы остаться в ледяной решения рассечение в течение 5 мин и смойте свежим раствором рассечение, чтобы избавиться от крови.

5. Выделение и катетеризация ^4-го Заказать брыжеечной артерии

1. Придавить проксимальный конец кишки на правой стороне в Sylgard покрытием блюдо. Продлить оставшуюся кишку в пути против часовой стрелки, прижимая сегмент вниз, чтобы распространить брыжейки и подвергая кровеносные сосуды (рисунок 1). Примечание: Мы изолировать артериальных сегментов при комнатной температуре. В противном случае мы размещаем брыжеечной аркады, содержащий блюдо на льду. Некоторые лаборатории, в том числе в нашем учреждении, использовать чиллеры рассекать артерии при 4 ° С.
2. Под микроскопом стерео зум рассекать из ^3-й и ^4-го порядка мелких артерий брыжейки (~ 260 мкм) параллельно тонкой кишки с помощью небольших ножниц. Во-первых отсечь все сопроводительное жира. Затем рассекают из вены и артерии изоляции с V-образным точки ветвления. Будьте осторожны, чтобы не проколоть выбранный сегмент. Начните рассекает жир возле ^2-го отделения заказа и найти путь к ^3-й или ^4-й Ordэр судов.
   1. Примечание: Артерии и вены можно отличить на основе их толщины стенки - артериальной стенки толще, чем вены годов. Более того, когда прилегающей соединительной ткани тянут мягко перпендикулярно к краху суда, в то время как вен легко артерии делать нет. Так артерий с диаметром просвета <400 мкм крупные сайты системного сосудистого сопротивления, для этого протокола мы использовали ^4-й брыжеечных артерий порядок крыс (диаметра просвета <300 мкм).
3. Изолировать 4-5 мм разрез параллельно артерии в в тонкую кишку. Представьте все 5 филиалов ^го порядка вложения в тонком кишечнике и сократить их немного в стороне от происхождения филиалов и сохранить часть. Эти сохранившиеся части ветвей служить проведение сайты (с рассечение пинцет) для передачи артериальных сегментов перфузии камеры, а впоследствии направлять их катетеризации.
4. Затем вырежьте артериальных сегментов путем 2 разрезы дистальнее^5-й ветки порядка на каждой стороне артерии и перенести его на камеру перфузии (рис 1С и легенды).
5. Иглу один конец судна, на одном из стекла микропипетки (диаметром 100-150 мкм:) с использованием рассечение пинцет, держа кончики артериального сегмента с рассечение пинцет. Слайд предварительно загруженный частично закрытую шов на канюлированного конца и закрепите его. Примечание: проксимальный конец артерии может быть канюлю на стеклянную канюлю, который подключен к регулирования давления устройства с сервоуправлением, чтобы имитировать на месте среды.
6. Приложить раствор рассечение загружен 10 мл шприц с краном, подключенного к этой канюли таким образом, что вскрытие раствор в трубке, соединяющей канюли и кран сливается с, что в шприце. Осторожно поднимите шприц. Сила тяжести на решение будет удалить интра сосудов кровь из открытого конца сосуда. После удаления внутриартериальный кровьЗакройте кран.
   Примечание: В качестве альтернативы, прикрепить кран с регулятором давления, включить его и плавно увеличивают давление до 5-10 мм рт.ст., чтобы достичь того же результата.
7. Tie дистальный конец сосудов на второй стеклянной канюли тщательно чего другой канюли как можно ближе к несвязанной конце сегмента артерии. Слайд предварительно загруженный частично закрытую шов на канюлированного конца и закрепите его. Уход должны быть приняты не тащить или тянуть на артериальных сегментов. Убедитесь, что краны, прикрепленные к обеим канюли закрыты.
8. Перевести перфузии камеру на стадии инвертированного микроскопа, оснащенного живой записи видео.
9. Подключение кран канюли, привязанной к проксимальному концу сегмента артерии к регулирования давления устройства с сервоуправлением и убедитесь, что кран прикреплен к другой канюли остается закрытым, чтобы поддерживать стабильное давление в просвете.
10. Далее, присоедините вакуумный шланг к всасывающему отверстию ай перфузии трубки к порту перфузии камеры.
    Примечание: Скошенные иглы порт используется для всасывания и тупой иглы для порта перфузии.
11. Начало перфузии судна теплой PSS через один нагреватель встроенный раствора (37 ° С, уравновешивали газовой смеси: 5% СО _2, 5% O ₂ и 90% N для поддержания нейтрального рН и адекватной оксигенации ¹⁷⁾ в 2 мл / мин с использованием перистальтический насос. Поверните вакуум на, а также. Поставьте термистор в камере для мониторинга температуры непрерывно.
12. Как температура PSS в камере приближается ~ 37 ° C (обычно в течение 5 мин), медленно увеличивать давление в просвете от 20 до 100 мм рт.ст. и проверить сосуды на герметичность. Это делается с помощью параметра автоматической давления регулятора давления. Откажитесь сосуды с утечкой и заменить другой сегмент. Сосуды с утечками не сможет провести давление.
13. Оценка артериальной сегмент для колен, поддерживая давление на 100 мм рт.ст..Использование винтовой рычаг, переместите канюли выпрямить артериальное сегмент. Не более растянуть артериальных сегментов; цель, чтобы имитировать в естественных условиях длина артериального сегмента.
14. Уменьшите давление до 70 мм рт.ст. (чтобы имитировать в естественных условиях давления в брыжеечной аркады ¹⁸⁾ и позволяют артериального сегмента, чтобы стабилизировать и развивать миогенную тон. Артерии может находиться под давлением переменно (40-70 мм рт.ст.) в соответствии с экспериментальной стратегии и сосудистого русла. Ранее опубликована обзор дает отличный обзор изменчивости в МТ в артериальных сегментов из различных сосудистых ⁸ спальных мест.

6. Измерение артериального Диаметр

1. Посмотреть артерии в 10 раз цель на микроскоп оснащен камерой монохромный видео прибор с зарядовой связью. Измерьте диаметр просвета с помощью захвата видеокадра и в режиме реального времени система обнаружения края. Перечень оборудования, используемого приведены в таблице 3.
2. Мониторинг и запись судно гiameter непрерывно.
3. Соблюдайте для развития МП. Примечание: Мы наблюдали, что у крыс брыжеечных артерий сопротивления, при 70 мм рт.ст., развитие МТ характеризуется ~ 20% уменьшением диаметра. МТ изменяется в соответствии с сосудистыми слоем и животных.
4. Подтвердите сосудистой жизнеспособность по оценке сосудосуживающие и сосудорасширяющие ответов 1 мкМ фенилэфрина (Phe) и 1 мкМ ацетилхолина (АХ).
5. В конце каждого эксперимента, определить пассивный диаметр (PD) путем инкубации в артерии Ca ²⁺ -бесплатно PSS в течение 20 мин.

7. Миогенный Ответ

1. Снизить давление до 20 мм ртутного столба и позволяют диаметр стабилизироваться. Увеличение внутрипросветного давление поэтапно (20, 40, 60, 80 и 100) и на каждом шаге давления позволяют артерий для достижения стабильной диаметр (обычно в течение 5 мин).
2. Уменьшите давление в просвете до 20 мм рт.ст. и инкубировать артериального сегмента в Ca ²⁺ -бесплатно PSS, содержащий 0,39 мМEGTA и 0,1 мМ SNP. Разрешить диаметр артерий для стабилизации (обычно 15 мин).
3. Повторите давления шаг ответ в Ca ²⁺ -свободных PSS, содержащего 0,39 мМ EGTA и 0.1 мМ SNP.

8. Интерпретация результатов и расчет данных

1. Рассчитайте MT, как разница процентов в диаметре, наблюдаемой для Ca ²⁺ -содержащего против Ca ²⁺ -бесплатно PSS на каждом давления в соответствии с следующим расчетом:
   
2. Для артерий, проходящих сосудодвигательная реакция диаметра может быть рассчитана путем усреднения фазы плато в течение 1 мин. Экспресс собранные данные в процентах от максимальной релаксации (% Pd) в соответствии с соотношением:% Pd = 100 х [ΔD / PD]; ΔD разница между диаметром до и после добавления любого исследуемого соединения (например, Phe); PD является пассивным диаметр (такжеМаксимальный диаметр).

Результаты

Схематическое изображение миографа типичный давление настройке показано на рисунке 1. Два конца сосуда канюлируют со стеклянной микропипетки и закрепляется швами с обеих сторон. Через трубки и открытым краном, один канюли соединен с сервоуправлением регулятора давления; с д?...

Обсуждение

Критические шаги, устранение неисправностей и модификации

В типичной изобарической подготовки сосуда, артерии давлением на 70 мм рт.ст. между двумя стеклянными канюли перфузии теплой (37 ° C) PSS. После 30-45 мин, артерии развивать MT, характеризуется спонтанным уменьшением диам?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Chemical
Acetylcholine	Sigma Aldrich	A6625
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma Aldrich	223506
D-(+)-Glucose	Sigma Aldrich	G5767
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetra acetic acid (EGTA)	Sigma Aldrich	E3889
Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA)	Sigma Aldrich	E9884
HEPES	Sigma Aldrich	H3784
Magnesium sulfate (MgSO4)	Sigma Aldrich	M7506
MOPS	Sigma Aldrich	M5162
Phenylephrine	Sigma Aldrich	P6126
Potassium chloride (KCl)	Sigma Aldrich	P3911
Potassium phosphate (KH2PO4)	Sigma Aldrich	P5655
Sodium bicarbonate (NaHCO3 )	Sigma Aldrich	S6014
Sodium chloride (NaCl)	Sigma Aldrich	S7653
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma Aldrich	S5881
Sodium nitroprusside	Sigma Aldrich	13451
Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2PO4)	Sigma Aldrich	S9638
Sodium pyruvate	Sigma Aldrich	P8574
			Table 1.
			Physiological salt solution (1000 ml) mM KCl 4.9 0.365 g NaCl 112 6.545 g MgSO4.7H2O 1.2 0.296 g KH2PO4 1.2 0.163 g Glucose 11.5 2.072 g NaHCO3 26 2.184 g HEPES 10 2.383 g CaCl2 2 2 ml (1M stock) De-ionized water 998 ml Ca2+ free physiological salt solution (100 ml) mM KCl 4.9 0.036 g NaCl 112 0.645 g MgSO4.7H2O 1.2 0.029 g KH2PO4 1.2 0.016 g Glucose 11.5 0.207 g NaHCO3 26 0.218 g HEPES 10 0.238 g EGTA 0.39 0.015 g Sodium nitroprusside 0.1 0.0026 g De-ionized water 100 ml Dissection solution, stock (500 ml) mM NaCl 145 21.18 g KCl 4.7 0.875 g MgSO4 1.2 0.739 g MOPS 2 1.049 g EDTA 0.02 0.019 g De-ionized water 500 ml Working dissection solution (100 ml) mM Dissection solution stock 20 ml Glucose 1.2 0.091 g NaH2PO4 5 0.016 g Sodium pyruvate 2 0.022 g CaCl2 2 0.2 ml (1M stock) De-ionized water 79.8 ml
			Table 2. Composition of Experimetnal solutions
			Equipment
CCD Monochrome Camera	The imaging Source	DMK 21AU04
Single inline solution heater	Warner Instruments	64-0102
Thermistor	Warner Instruments	64-0108
Dual automatic temperature controller	Warner Instruments	TC-344B
Flaming/Brown micropipette puller	Sutter Instruments	P-97
Fluorescence System Interface	IonOptix	model FSI-700
Forceps and scissors	World Precision Instruments
Ion Wizard-Core and Analysis	IonOptix	Ion Wizard 6.0
Laboratory tubing	Silastic	508-005
Male Sprague Dawley rat	Harlan Laboratories
Master flex console drive	Cole-parmer
Milli-Q Plus Ultrapure Water System	Millipore	ZD5211584
Ophthalmic monofilament nylon suture	Ethicon	9007G
Photometry and Dimensioning Microscope	Motic	AE31
Pressure Servo Controller with peristaltic pump and pressure transducer	Living Systems Instrumentation	PS-200
Stereomicroscope	Nikon Instruments Inc	SMZ660
Vessel Chamber	Living Systems Instrumentation	CH-1
Dissection dish	Living Systems Instrumentation	DD-90-S
Thin Wall Glass Capillaries	World Precision Instruments	TW120-6
Microforge	Stoelting	51550
			Table 3.