圧力筋運動記録法を用いた抵抗腸間膜動脈における筋原性応答および血管作用を評価します

要約

圧力筋運動記録法は、加圧されたときに、持続収縮を開発する小動脈の血管作用を評価するために使用されます。この原稿は、ラット、血管作用と血管径の管腔内圧力の影響から小腸間膜動脈の単離されたセグメントに評価するための詳細なプロトコルを提供します。

要約

小さな抵抗動脈が収縮し、増減腔内圧力に応じてそれぞれ拡張します。筋原性応答として知られるこの現象は、局所の血流の重要な調節因子です。等圧の条件では、小さな抵抗動脈は全身血管抵抗（SVR）の主要な決定要因である筋原トーン（MT）として知られている持続的な収縮を、開発しています。そのため、小さな抵抗動脈のex vivoで加圧された製剤は、近生理学的状態で微小血管の機能を研究するための主要なツールです。これを達成するために、小さな抵抗動脈（直径〜260ミクロン）の新たに単離された無傷のセグメントは、二つの小さなガラスカニューレに取り付けられ、加圧されます。これらの動脈の製剤は、 生体内の特性とリアルタイムで血管緊張の許可評価にほとんどを保持しています。ここでは、ラットからの加小さな抵抗腸間膜動脈における血管作用を評価するための詳細なプロトコルを提供します。これらの動脈を開発します持続的な血管収縮 - 最大直径の約25％ - 70 mmHgで加圧さ。これらの調製物は、動脈内、動脈圧および血管作用との関係について治験化合物の効果を研究し、種々の疾患の動物モデルにおける微小血管機能の変化を決定することができます。

概要

小さ ​​な抵抗動脈はSVRの主要な決定であり、多くの疾患^1,2の病態生理に重要な役割を果たしています。例えば糖尿病^3、妊娠^4、虚血再灌流^5、肥満や高血圧の^6,7等の条件は頻繁に変更された微小血管機能に関連しています。血管筋運動記録法は、種々の疾患における微小血管機能の変化に重要な洞察を提供するだけでなく、治療標的を同定し、血管作用性化合物の有効性を評価するのに役立つことができるだけでなく。血管機能は、等角または同重体血管条件⁸の下で分離された小動脈を用いて研究されています。等尺性筋運動記録法の詳細な説明は、他の箇所⁹が設けられています。しかし同重体準備^10-12対アイソメトリックから得られたデータに違いがあります。加圧された動脈の製剤は、近生理学的条件下で微小血管機能の研究を可能にするので、得られた知見は、血管床^8,13 の in vivoでの挙動とのより良い相関させることができます。

1902年にベイリスは、最初の血管の直径¹⁴に経壁圧の効果を説明しました。彼は圧力の減少は血管拡張が続いたウサギ、犬や猫の様々な血管床からの小さな抵抗動脈で観察され、圧力の増加は、血管収縮が続きました。この現象は、筋原性反応として知られています。ベイリスとその後の研究者は、等圧条件で小さな抵抗動脈がMT ^15,16として知られている持続的な収縮を開発することを観察しました。筋原性応答及びMTの両方が、圧力筋運動記録法（PM）技術を用いて評価することができます。 PMは小動脈、静脈および他の血管の血管作用を決定するために主に使用されています。名前が示すように - - 血管径、PMに血管作用化合物の効果を評価することに加えて、血管内の圧力媒介CHを評価するために使用され血管径にザンジュ。過去数十年にわたりビデオ顕微鏡やガラスピペット引いを強化コンピュータソフトウェア、に進み、PM実行しやすくなりました。しかし、小血管の生存可能な、完全なセグメントの解剖は、退屈な、時には困難なままです。ここでは、ラットから単離された小腸間膜抵抗動脈における筋原性応答を研究するための詳細なプロトコルの概要を説明します。

プロトコル

ここに示した例は、ジョージアリージェンツ大学IACUCによって承認された実験からのものである - プロトコル番号：＃2011から0408

試薬の調製

1. ストック解剖液（5×）の500ミリリットルのために、21.18グラムのNaCl、0.875グラムのKCl、0.739グラムのMgSO _4、1.049グラムのMOPS、Milli-Q水450ミリリットル中0.019グラムのEDTAを溶解：解剖液ストックを準備します。 1 N NaOHを用いて7.3〜7.4にpHを調整します。ミリQ水で500ミリリットルにボリュームを構成しています。ストック溶液は、7〜10日まで保存することができます。化学物質とそのベンダーのリストについては、表1を参照してください。 mMの中の濃度については、表2を参照してください。
2. 作業解剖溶液を調製する：毎日新鮮なワーキング解剖溶液を調製します。ワーキング溶液を100ミリリットルのために、0.091グラムのグルコース、ミリQ水の79.8ミリリットル中0.016グラムのNaH ₂ PO ₄および0.022グラムのピルビン酸ナトリウムを溶解します。 voluをもたらすために0.2ミリリットル1MのCaCl ₂と20ミリリットル解剖ソリューションの株式を追加100ミリリットルの私。
3. 生理食塩水（PSS）を準備：千ミリリットルPSSを製造するために、0.365グラムのKCl、6.545グラムのNaCl、0.296グラムのMgSO _4、0.163グラムのKH ₂ PO _4、2.072グラムのグルコース、950ミリリットル中2.184グラムのNaHCO ₃および2.383グラムのHEPESを溶解ミリQ水。 1 N NaOHを用いて7.3〜7.4にpHを調整します。ミリQ水で千ミリリットルにボリュームを構成しています。溶液2mlを削除し、1 M CaCl ₂を2ミリリットルと交換してください。 （新鮮なPSSは毎日調製する必要があります）
4. のCa ²⁺なしで100ミリリットルPSSのために、0.036グラムのKCl、0.654グラムのNaCl、0.029グラムのMgSO _4、0.016グラムのKH ₂ PO _4、0.207グラムのグルコース、0.218グラムのNaHCO _3、0.238を溶解：カルシウム（Ca ^2+）を無料でPSSを準備G HEPES、ミリQ水95ミリリットル中0.015グラムのEGTAおよび0.0026グラムのニトロプルシドナトリウム（SNP）。 1 N NaOHを用いて7.3〜7.4にpHを調整します。ミリQ水で100mlにボリュームを構成しています。

ガラスカニューレの調製

1. ガラスピペットを引っ張りますメーカーのガイドライン通りにピペットプラーを使用して、100〜150μmの先端がカニューレを生成します。
2. ベベル微小電極bevellerを用いてガラスカニューレのヒントは、火はそれらを磨くとヒータプローブを使用して、〜45°のガラスカニューレ先端を曲げます。
3. マイクロピペットホルダーにカニューレをロードし、灌流チャンバーへのマイクロピペットホルダーを取り付けます。

灌流チャンバーの調製

1. 5分ごとに解剖溶液を添加したミリQ水で洗い流し灌流チャンバー。解剖溶液2mlでチャンバーをロードします。
2. 10ミリリットル注射器を用いてカニューレを介して吸入解剖液と気泡なしで慎重に全体のカニューレおよび接続されているチューブを埋めます。気泡の発生を防止するため穏やかに吸引を適用します。
3. それぞれが鈍鉗子を用いたハーフノットを持つ2つの縫合糸を準備します。眼科モノフィラメントナイロン縫合糸（10-0、0.2メートル法）があるだけで結び目を調製するために使用されているので直径1〜2ミリメートル、解剖顕微鏡を必要とすることができます。
4. 解剖顕微鏡下で可視化し、わずかに先端から部分的に閉じられた縫合糸の結び目の両方カニューレをロードするために解剖鉗子を使用しています。後、これらのノットはカニューレを挿入動脈末端に慎重にスライドされ、完全に閉じました。

SDラットから腸間膜動脈アーケードの4コレクション

1. これらの実験を実施する前に、ローカル施設内動物管理使用委員会（IACUC）の承認を求めます。制御された温度と照明と水に自由にアクセスを許可し、商業齧歯動物食と動物施設におけるハウス動物。
2. ケタミンの腹腔内注射（80mg / kg）およびキシラジン（10mg / kg）により、ラットを麻酔。つま先ピンチにより、必要に応じた管理者の追加の麻酔薬場合深麻酔を確認してください。
3. 手術用麻酔を確認した後、断頭により動物を安楽死させます。 UTIのためのAAALACガイドラインに従ってください殺処分のための適切な方法をlizing。
4. 胸骨に骨盤から中線開腹術を実行するために解剖はさみとピンセットを使用してください。これは、2つのステップで行われます。最初、皮膚を切開し、第二、下層の筋層を切開します。ケアは、腹腔内の臓器を傷つけないように注意しなければなりません。
5. 幽門に腸近く、回盲接合部に近い遠位端の近位端をカットします。両方が糜粥、従って、細胞外入浴液の汚染を回避便の漏れを防止するために、個別に終了接続します。給電血管系、すなわち 、上腸間膜動脈の近くに、そのベースで腸間膜を切開し、氷冷解剖溶液を含む50ミリリットルビーカーに全小腸腸間膜ベッドを転送します。
6. 採取した組織は、5分間氷冷解剖溶液中に滞在し、血液を取り除くために、新鮮な解剖溶液でリンスすることを可能にします。

5.単離と4 ^番目のカニューレ挿入注文腸間膜動脈

1. シルガードコートディッシュで右側の腸の近位端を突き止めます。 （ 図1）が腸間膜を広げダウンセグメントを固定し、血管を露出させ、反時計回りの経路の残りの腸の拡張。注：我々は、室温での動脈セグメントを分離します。それ以外の場合は、氷の上の皿を含む腸間膜アーケードを配置します。当院でのものを含むいくつかの研究室では、4℃で動脈を切開するためにチラーユニットを使用しています。
2. ステレオズーム顕微鏡下で小さなハサミを使用して小腸にオーダー小さな腸間膜動脈^番目 3 ^番目と4（〜260ミクロン）の平行を解剖。最初にすべてのカバーの脂肪を離れて解剖。その後静脈を解剖し、V字型の分岐点と動脈を分離します。選択したセグメントを穿刺しないように注意してください。 2 ^番目の注文支店近く脂肪を解剖起動して、3 ^番目または4 ^番目の ORDへの道を見つけますER船。
   1. 注：動脈と静脈は、それらの壁の厚さに基づいて区別することができる - 動脈壁は、静脈のより厚いです。隣接する結合組織を穏やかに血管に対して垂直に引かれたときに動脈がいない間また、静脈が容易に崩壊します。管腔直径<400μmでは、全身血管抵抗の主要な部位であると動脈ので、このプロトコルのために、我々は（直径<300μmのルーメン）注文ラット腸間膜動脈^番目の 4を使用していました。
3. 小腸に動脈平行4-5ミリのセクションを分離します。小腸への埋め込 ​​み、すべての5 ^{番目の順序}の枝を可視化し、少し離れた枝の原点から、それらをカットした部分を保持します。枝のこれらの保存された部分は、その後、それらのカニューレ挿入をガイドする、灌流チャンバーに動脈セグメントを転送する（解剖鉗子で）部位を保持し、として機能します。
4. その後に遠位の2切開を行うことで、動脈セグメントをカット動脈の両側のため枝^番 5と灌流チャンバーに転送し（ 図1Cおよび凡例を参照してください）。
5. （：100〜150μmの直径）解剖鉗子で動脈セグメントの先端を保持することによって解剖鉗子を用いてガラスマイクロピペットのいずれかの容器の一方の端部にカニューレを挿入。カニューレを挿入端に前にロードされた部分的に閉じた縫合糸をスライドさせて固定します。注：動脈の近位端は、 その場の環境で模倣するサーボ制御圧力調整装置に接続されているガラスカニューレにカニューレを挿入することができます。
6. 解剖ソリューションを取り付けカニューレとコックを接続するチューブ内の解剖液が注射器のそれと合流するように、このカニューレに接続されたコックに10ミリリットルの注射器をロードしました。ゆっくりシリンジを上げます。ソリューションの重力は、容器の開口端部から血管内の血液を除去します。動脈内の血液を除去した後、コックを閉じます。
   、また、圧力コントローラに活栓を取り付け、電源を入れ、ゆっくりと同じ結果を得る5〜10 mmHgまで圧力を高める：注意してください。
7. 慎重に動脈セグメントのアンタイド端にできるだけ近い他のカニューレをもたらすことによって、第二のガラスカニューレ上に容器の先端を接続します。カニューレを挿入端に前にロードされた部分的に閉じた縫合糸をスライドさせて固定します。ケアは、引っ張るまたは動脈セグメントを引っ張らないように注意する必要があります。両方のカニューレに取り付けられたコックが閉じていることを確認します。
8. ライブビデオ録画を備えた倒立顕微鏡のステージ上に灌流チャンバーを転送します。
9. サーボ制御圧力調整装置への動脈セグメントの近位端に接続されたカニューレのコックを接続し、安定した管腔内の圧力を維持するために閉じたままコックが他のカニューレに取り付けられていることを確認してください。
10. 次に、吸引ポートAに真空管を取り付けチャンバーの灌流ポートに灌流チューブをND。
    注：ベベル針ポートを吸引および灌流のためのブラント針ポートに使用されます。
11. 使用して2ml /分で（5％CO _{2、5％O 2}及び90％Nは、中性pHおよび適切な酸素^17を維持するためのガス混合物で平衡化し、37°C、）1つのインライン液加熱器を介して暖かいPSSと血管の灌流を開始します蠕動ポンプ。同様に上の真空をオンにします。継続的に温度を監視するために、チャンバー内にサーミスタを配置します。
12. チャンバー内のP​​SSの温度は〜37℃（通常は5分以内）に近づくと、ゆっくりと漏れを20〜100 mmHgで、チェック血管から管腔内の圧力を増加させます。これは、圧力調整器の自動圧力設定を使用して行われます。リークして血管を捨て、別のセグメントと交換します。漏れのある容器は圧力を保持することができません。
13. 100 mmHgの圧力を維持しながら曲がるための動脈セグメントを評価します。スクリューレバーを使用して、動脈セグメントをまっすぐにカニューレを移動します。以上の動脈セグメントをストレッチしないでください。目的は、 生体内 、動脈セグメント長に模倣することです。
14. 70 mmHgでの圧力を低下させる（腸間膜アーケード¹⁸ in vivoでの圧力に模倣する）および動脈セグメントが安定化し、筋原性緊張を開発することができます。動脈は、（40〜70 mmHgの）実験戦略と血管床に応じて可変に加圧することができます。以前に公開されたレビューは、異なる血管床⁸から動脈セグメントにおけるMTの変動の優れたレビューを提供しています。

動脈直径の6測定

1. モノクロビデオ電荷結合素子カメラを備えた顕微鏡で10×対物レンズで表示動脈。ビデオフレームグラバーとリアルタイムのエッジ検出システムを使用して管腔直径を測定します。使用される機器のリストを表3に提供されます。
2. モニタとレコード容器D連続iameter。
3. MTの開発のために確認します。注：我々は、ラット腸間膜抵抗動脈で、70 mmHgので、MTの開発は、直径〜20％減少することを特徴とすることを観察しました。 MTは血管床と動物種に応じて変化します。
4. 1μMのフェニレフリン（Pheで）および1μMのアセチルコリン（AChの）に血管収縮剤および血管拡張性応答を評価することにより血管の生存率を確認してください。
5. 各実験の最後に、20分間のCa ^2+を含まないPSSで動脈をインキュベートすることによって受動的直径（PD）を決定します。

7.筋原レスポンス

1. 20ミリメートルHgのに圧力を低下させ、直径が安定します。増分ステップ（20、40、60、80および100）内の管腔内の圧力を増加させ、各圧力段階で動脈が（通常は5分以内）安定した直径を達成することを可能にします。
2. 20 mmHgでの管腔内の圧力を軽減し^、2+を含まないPSS 0.39ミリモルを含むカリフォルニア州の動脈セグメントをインキュベートEGTAおよび0.1mM SNP。動脈直径（通常15分）を安定化することができます。
3. 0.39 mMのEGTAおよび0.1mMのSNPを含むのCa ^2+を含まないPSSの圧力-ステップ応答を繰り返します。

データの結果と計算の8解釈

1. CAの観察直径のパーセント差としてMTを計算²⁺以下の計算に従って各圧力でのCa ^2+を含まないPSS対含有：
   
2. 直径血管運動経動脈について1分間プラトー相を平均することによって計算することができます。関係に従って最大弛緩率（％PD）の割合として収集されたデータを表現します。％PD = 100×[ΔD/ PD]; ΔDは任意の治験化合物（ 例えば Pheで）を添加する前と後の直径との差です。 PDはまた、受動的直径（あります最大直径）。

結果

典型的な圧力ミオグラフセットアップの概略図を図1に示されている。容器の両端をガラスマイクロピペットを用いてカニューレを挿入し、両側の縫合糸で固定されています。チューブとオープン活栓を介して、1カニューレはサーボ制御された圧力調整器に接続されています。他のカニューレは閉鎖コックに接続されています。チャンバーは、PSSで灌流し、血管径の変化はCCDカメ...

ディスカッション

重要なステップ、トラブルシューティングおよび修正

典型的な等圧容器の準備では、動脈が温かい（37℃）、PSSで灌流二枚のガラスの間にカニューレ70 mmHgで加圧されています。 30〜45分後、動脈は20〜30分で安定する直径の自然減少によって特徴づけられる、MTを開発します。様々な血管床からの抵抗動脈は変数MTを開発します。 cremastric動脈がPDのMT〜40％を達成し得るが、例...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Chemical
Acetylcholine	Sigma Aldrich	A6625
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma Aldrich	223506
D-(+)-Glucose	Sigma Aldrich	G5767
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetra acetic acid (EGTA)	Sigma Aldrich	E3889
Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA)	Sigma Aldrich	E9884
HEPES	Sigma Aldrich	H3784
Magnesium sulfate (MgSO4)	Sigma Aldrich	M7506
MOPS	Sigma Aldrich	M5162
Phenylephrine	Sigma Aldrich	P6126
Potassium chloride (KCl)	Sigma Aldrich	P3911
Potassium phosphate (KH2PO4)	Sigma Aldrich	P5655
Sodium bicarbonate (NaHCO3 )	Sigma Aldrich	S6014
Sodium chloride (NaCl)	Sigma Aldrich	S7653
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma Aldrich	S5881
Sodium nitroprusside	Sigma Aldrich	13451
Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2PO4)	Sigma Aldrich	S9638
Sodium pyruvate	Sigma Aldrich	P8574
			Table 1.
			Physiological salt solution (1000 ml) mM KCl 4.9 0.365 g NaCl 112 6.545 g MgSO4.7H2O 1.2 0.296 g KH2PO4 1.2 0.163 g Glucose 11.5 2.072 g NaHCO3 26 2.184 g HEPES 10 2.383 g CaCl2 2 2 ml (1M stock) De-ionized water 998 ml Ca2+ free physiological salt solution (100 ml) mM KCl 4.9 0.036 g NaCl 112 0.645 g MgSO4.7H2O 1.2 0.029 g KH2PO4 1.2 0.016 g Glucose 11.5 0.207 g NaHCO3 26 0.218 g HEPES 10 0.238 g EGTA 0.39 0.015 g Sodium nitroprusside 0.1 0.0026 g De-ionized water 100 ml Dissection solution, stock (500 ml) mM NaCl 145 21.18 g KCl 4.7 0.875 g MgSO4 1.2 0.739 g MOPS 2 1.049 g EDTA 0.02 0.019 g De-ionized water 500 ml Working dissection solution (100 ml) mM Dissection solution stock 20 ml Glucose 1.2 0.091 g NaH2PO4 5 0.016 g Sodium pyruvate 2 0.022 g CaCl2 2 0.2 ml (1M stock) De-ionized water 79.8 ml
			Table 2. Composition of Experimetnal solutions
			Equipment
CCD Monochrome Camera	The imaging Source	DMK 21AU04
Single inline solution heater	Warner Instruments	64-0102
Thermistor	Warner Instruments	64-0108
Dual automatic temperature controller	Warner Instruments	TC-344B
Flaming/Brown micropipette puller	Sutter Instruments	P-97
Fluorescence System Interface	IonOptix	model FSI-700
Forceps and scissors	World Precision Instruments
Ion Wizard-Core and Analysis	IonOptix	Ion Wizard 6.0
Laboratory tubing	Silastic	508-005
Male Sprague Dawley rat	Harlan Laboratories
Master flex console drive	Cole-parmer
Milli-Q Plus Ultrapure Water System	Millipore	ZD5211584
Ophthalmic monofilament nylon suture	Ethicon	9007G
Photometry and Dimensioning Microscope	Motic	AE31
Pressure Servo Controller with peristaltic pump and pressure transducer	Living Systems Instrumentation	PS-200
Stereomicroscope	Nikon Instruments Inc	SMZ660
Vessel Chamber	Living Systems Instrumentation	CH-1
Dissection dish	Living Systems Instrumentation	DD-90-S
Thin Wall Glass Capillaries	World Precision Instruments	TW120-6
Microforge	Stoelting	51550
			Table 3.