Valutare Miogenica risposta e Vasoactivity nelle arterie di resistenza mesenteriche Utilizzando Myography Pressione

Riepilogo

Myography pressione è utilizzato per valutare vasoactivity di piccole arterie che si sviluppano costrizione sostenuta quando sotto pressione. Questo manoscritto fornisce un protocollo dettagliato per valutare in segmenti isolati di piccole arterie mesenterici di ratto, vasoactivity e l'effetto della pressione intraluminale del diametro vascolare.

Abstract

Le piccole arterie di resistenza restringono e si dilatano rispettivamente in risposta ad un aumento o diminuzione della pressione endoluminale; questo fenomeno noto come risposta miogenico è un regolatore chiave di flusso ematico locale. In condizioni isobariche piccole arterie di resistenza sviluppano sostenuti costrizione noto come tono miogenico (MT), che è un importante determinante di resistenze vascolari sistemiche (SVR). Quindi, ex vivo preparazioni pressione di piccole arterie di resistenza sono i principali strumenti per studiare la funzione microvascolare negli stati vicini-fisiologico. Per ottenere questo, un segmento intatto fresco isolato di una piccola arteria resistenza (diametro ~ 260 micron) è montata su due cannule piccolo vetro e pressurizzato. Queste preparazioni arteriose conservano più a caratteristiche vivo e la valutazione permesso del tono vascolare in tempo reale. Qui forniamo un protocollo dettagliato per la valutazione vasoactivity in pressurizzati piccole arterie resistenza mesenterici di ratti; queste arterie sviluppanovasocostrizione sostenuta - circa il 25% del diametro massimo - quando sotto pressione a 70 mmHg. Queste preparazioni arteriose possono essere utilizzati per studiare l'effetto dei composti in fase di sperimentazione in relazione tra pressione intra-arteriosa e vasoactivity e determinare alterazioni della funzione microvascolare in modelli animali di varie malattie.

Introduzione

Arterie piccola resistenza sono i principali determinanti di SVR e svolgono un ruolo importante nella fisiopatologia di molte malattie ^1,2. Condizioni come il diabete ^3, la gravidanza ^4, ischemia-riperfusione ^5, obesità e ipertensione ^6,7 sono spesso associati con la funzione microvascolare alterata. Myography vascolare può fornire non solo importanti conoscenze cambiamenti nella funzione microvascolare in varie malattie, ma anche aiutare a identificare target terapeutici e di valutare l'efficacia di composti vasoattivi. Funzione vascolare è stata studiata utilizzando isolate piccole arterie in condizioni di nave isometriche o isobariche ^8. Descrizione dettagliata di myography isometrica è fornito altrove ^9. Tuttavia ci sono differenze tra i dati ottenuti da isometrica contro preparazioni isobariche ^10-12. Poiché preparazioni arteriosi pressurizzati permettono lo studio della funzione microvascolare in condizioni pressoché fisiologiche, larisultati ottenuti possono correlare meglio con il comportamento in vivo del letto vascolare ^8,13.

Nel 1902 Bayliss descrisse per primo l'effetto della pressione transmurale del diametro vascolare ^14. Si osserva in piccole arterie di resistenza di vari distretti vascolari di conigli, cani e gatti che una diminuzione della pressione è stata seguita da vasodilatazione, e un aumento della pressione è stata seguita da vasocostrizione. Questo fenomeno è noto come risposta miogenico. Bayliss e gli investigatori successivi hanno osservato che in condizioni isobariche arterie piccola resistenza sviluppano costrizione sostenuta chiamato MT ^15,16. Sia risposta miogenica e MT possono essere valutati utilizzando myography pressione (PM) tecnica. PM viene utilizzato principalmente per determinare vasoactivity delle piccole arterie, vene e altre imbarcazioni. Oltre a valutare l'effetto dei composti vasoattivi sul diametro vascolare, PM - come indica il nome - viene utilizzato per valutare intravascolare ch-mediata pressioneanges del diametro vascolare. Nel corso degli ultimi decenni i progressi nel software per computer, che ha migliorato la microscopia video e pipetta di vetro tirando, hanno reso PM più facile da eseguire. Tuttavia, la dissezione di segmenti intatti vitali di piccoli vasi sanguigni rimane noiosa e talvolta impegnativo. Qui descriviamo un protocollo dettagliato per studiare la risposta miogenico nelle piccole arterie di resistenza mesenteriche isolati da ratti.

Protocollo

Gli esempi qui riportati sono da esperimenti approvati dal IACUC presso la Georgia Regents University - Protocollo n: # 2011-0408

1. Preparazione dei reagenti

1. Preparare la soluzione dissezione magazzino: per 500 ml di soluzione madre dissezione (5x), sciogliere 21,18 g NaCl, 0,875 g KCl, 0,739 g _MgSO4, 1.049 g MOPS e 0.019 g di EDTA in 450 ml di acqua Milli-Q. Regolare il pH a 7,3-7,4 con 1 N NaOH. Portare al volume di 500 ml con acqua Milli-Q. Soluzione madre può essere conservata fino a 7-10 giorni. Vedi Tabella 1 per un elenco delle sostanze chimiche e dei loro fornitori. Vedere la Tabella 2 per la concentrazione in mm.
2. Preparare la soluzione dissezione di lavoro: Preparare la soluzione dissezione di lavoro fresco ogni giorno. Per 100 ml di soluzione di lavoro, sciogliere 0,091 g di glucosio, 0,016 g NaH ₂ PO ₄ e 0,022 g di sodio piruvato in 79,8 ml di acqua Milli-Q. Aggiungere la soluzione 0,2 dissezione ml 1M CaCl ₂ e 20 ml di brodo di portare volume a 100 ml.
3. Preparare soluzione salina fisiologica (PSS): Per preparare 1.000 ml PSS, sciogliere 0,365 g KCl, 6,545 g di NaCl, 0,296 g _MgSO4, 0,163 g KH ₂ PO _4, 2.072 g di glucosio, 2.184 g NaHCO ₃ e 2.383 g HEPES a 950 ml di acqua Milli-Q. Regolare il pH a 7,3-7,4 con 1 N NaOH. Portare al volume di 1000 ml con acqua Milli-Q. Rimuovere 2 ml di soluzione e sostituirlo con 2 ml di 1 M CaCl _2. (Fresh PSS deve essere preparato al giorno)
4. Preparare calcio (Ca ²⁺⁾ PSS libero: per 100 ml PSS senza Ca ^2+, sciogliere 0,036 g KCl, 0,654 g di NaCl, 0,029 g _MgSO4, 0.016 g KH ₂ PO _4, 0,207 g di glucosio, 0.218 g NaHCO _3, 0.238 g HEPES, 0,015 g EGTA e 0,0026 g di sodio nitroprussiato (SNP) in 95 ml di acqua Milli-Q. Regolare il pH a 7,3-7,4 con 1 N NaOH. Portare al volume di 100 ml con acqua Milli-Q.

2. Preparazione di vetro cannule

1. Pull pipette di vetroper generare i 100-150 micron cannule capovolti con un estrattore pipetta secondo le linee guida del produttore.
2. Bevel le punte della cannula di vetro con un beveller microelettrodo, fuoco li lucidare e piegare le punte della cannula di vetro da ~ 45 ° con una sonda di riscaldamento.
3. Caricare le cannule nel supporto micropipetta e fissare il supporto micropipetta al camera di perfusione.

3. Preparazione di perfusione Camera

1. Sciacquare camera di perfusione con acqua Milli-Q seguita da dissezione soluzione per 5 minuti ciascuno. Caricare la camera con 2 ml di soluzione di dissezione.
2. Soluzione dissezione di aspirazione attraverso cannula utilizzando siringa da 10 ml e compilare accuratamente l'intera cannula e il tubo attaccato senza bolle. Applicare delicatamente aspirazione per impedire la produzione di bolle.
3. Preparare due punti di sutura con un mezzo nodo ciascuno con pinze smussato. Poiché suture monofilamento di nylon oftalmiche (10-0, 0,2 metrico) vengono utilizzati per preparare i nodi che sono solo1-2 mm di diametro, può essere necessario microscopio dissezione.
4. Visualizzare al microscopio dissezione, usare il forcipe dissezione per caricare entrambe le cannule con nodi di sutura parzialmente chiuse un po 'lontano dalla punta. In seguito questi nodi verranno fatti scorrere con attenzione sulle estremità arteriose cannulate e chiuso completamente.

4. Raccolta di mesenterica Arcade di ratti Sprague-Dawley

1. Cercate approvazione dell'Ordinario del luogo Istituzionale Cura e Comitato uso degli animali (IACUC) prima di effettuare questi esperimenti. Animali Casa nella struttura animale con temperatura controllata e l'illuminazione e consentire il libero accesso all'acqua e un chow roditore commerciale.
2. Anestetizzare topi mediante iniezione intraperitoneale di ketamina (80 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg). Confermare profonda anestesia da punta pinch e se amministra necessario anestetici supplementari.
3. Dopo aver confermato l'anestesia chirurgica, eutanasia dell'animale per decapitazione. Seguire le linee guida AAALAC per utilizing metodi appropriati per l'eutanasia degli animali.
4. Utilizzare una forbice dissezione e una pinza per eseguire una laparotomia linea mediana da bacino a sterno. Questo viene fatto in due fasi: in primo luogo, incidere la pelle e il secondo, incise lo strato muscolare sottostante. Bisogna fare attenzione a non danneggiare gli organi intra-addominali.
5. Tagliare l'estremità prossimale dell'intestino pressi piloro e l'estremità distale vicino alla giunzione ileo-cecale. Tie entrambe le estremità separatamente per evitare perdite di chimo e feci evitando così la contaminazione di soluzione di balneazione extracellulare. Incidere il mesentere alla sua base, vicino al alimentazione vascolare cioè, arteria mesenterica superiore e trasferire l'intero piccolo letto mesenterica intestinale per un bicchiere da 50 ml contenente soluzione di dissezione ghiacciata.
6. Lasciare che il tessuto raccolto per rimanere in ghiaccio soluzione dissezione a freddo per 5 minuti e risciacquare con soluzione dissezione fresco per sbarazzarsi di sangue.

5. Isolamento e Incannulazione di 4 ^° Ordine mesenterica

1. Definire con precisione l'estremità prossimale dell'intestino sul lato destro in un piatto Sylgard rivestite. Estendere l'intestino rimanente in un percorso antiorario, pinning segmento giù per diffondere mesentere ed esponendo i vasi sanguigni (Figura 1). Nota: isolare segmenti arteriosi a temperatura ambiente. In caso contrario, abbiamo posto l'arcata mesenterica contenente piatto sul ghiaccio. Alcuni laboratori, comprese quelle presso il nostro istituto, utilizzano refrigeratori di sezionare le arterie a 4 ° C.
2. Al microscopio zoom stereo sezionare fuori 3 ^° e 4 ^° ordine piccole arterie mesenteriche (~ 260 micron) parallelo al piccolo intestino utilizzando piccole forbici. Prima sezionare via tutto il grasso di copertura. Poi sezionare fuori la vena e isolare l'arteria con punto di diramazione a forma di V. Fare attenzione a non forare il segmento selezionato. Avviare sviscerare il grasso nei pressi di una filiale per 2 ^° e trovare il modo di 3 ^° e 4 ^° ordvasi er.
   1. Nota: arterie e le vene si distinguono in base alla loro spessore della parete - parete arteriosa è più spessa di vena di. Inoltre, quando adiacente il tessuto connettivo è tirato delicatamente perpendicolarmente alla navi, vene crollo prontamente mentre le arterie non lo fanno. Poiché arterie con diametro del lume <400 micron sono maggiori siti di resistenza vascolare sistemica, per questo protocollo abbiamo usato 4 ^° ordine ratto arterie mesenteriche (lume diametro <300 micron).
3. Isolare una sezione 4-5 mm dell'arteria parallelo al piccolo intestino. Visualizza tutte le 5 filiali ^° ordine incorporamento in tenue e tagliarli un po 'lontano dall'origine di rami e di preservare una porzione. Queste porzioni conservati di rami servono come possesso siti (con una pinza dissezione) per il trasferimento di segmenti arteriosi in una camera di perfusione e, successivamente, la loro guida incannulamento.
4. Poi tagliare i segmenti arteriosi facendo 2 incisioni distaleIl ⁵ ° rami ordine su ogni lato dell'arteria e trasferirlo alla camera di perfusione (Figura 1C e legenda).
5. Cannulate una estremità dei vasi su uno dei micropipetta di vetro (diametro: 100-150 micron) con pinze dissezione tenendo le punte del segmento arterioso con una pinza per dissezione. Far scorrere il precedentemente caricato sutura parzialmente chiusa sull'estremità cannulato e fissarlo. Nota: Estremità prossimale dell'arteria può essere incannulata sulla cannula di vetro che è collegato al dispositivo di regolazione della pressione servocomandato per simulare in ambiente situ.
6. Fissare una soluzione dissezione caricata siringa da 10 ml al rubinetto collegato a questo cannula tale soluzione dissezione nel tubo di collegamento della cannula e rubinetto si fonde con quella nella siringa. Alzare delicatamente la siringa. La forza gravitazionale sulla soluzione rimuoverà il sangue vascolare intra dall'estremità aperta del recipiente. Dopo aver rimosso il sangue intra-arteriosa, Chiudere il rubinetto.
   Nota: Alternativamente, collegare il rubinetto al regolatore di pressione, accenderlo e aumentare leggermente la pressione di 5-10 mm Hg per ottenere lo stesso risultato.
7. Tie la estremità distale dei vasi su una seconda cannula vetro portando lentamente l'altro cannula il più vicino possibile alla fine slegato del segmento arterioso. Far scorrere il precedentemente caricato sutura parzialmente chiusa sull'estremità cannulato e fissarlo. Bisogna fare attenzione a non tirare o tirare sui segmenti arteriosi. Assicurarsi che rubinetti collegati a entrambe le cannule sono chiusi.
8. Trasferire camera di perfusione alla fase di microscopio invertito dotato di registrazione video dal vivo.
9. Collegare il rubinetto della cannula legata all'estremità prossimale del segmento arteriosa ad un dispositivo di regolazione della pressione servocomandato e assicurarsi che rubinetto collegato a altra cannula rimane chiuso per mantenere la pressione intraluminale stabile.
10. Quindi, collegare il tubo di vuoto alla bocca di aspirazione unnd la perfusione tubazione alla porta della camera di perfusione.
    Nota: la porta ago smussato viene utilizzato per l'aspirazione e la porta smussata ago per perfusione.
11. Avviare perfusione del vaso con calda PSS attraverso riscaldatore singola soluzione linea (37 ° C, equilibrata con miscela di gas: 5% CO _2, 5% O ₂ e 90% N per mantenere il pH neutro e un'adeguata ossigenazione ¹⁷⁾ a 2 ml / min usando una pompa peristaltica. Accendere il vuoto su pure. Inserire un termistore nella camera per controllare la temperatura in continuo.
12. Come la temperatura del PSS nella camera avvicina ~ 37 ° C (di solito entro 5 min), lentamente aumentare la pressione intraluminale da 20 a 100 mmHg e controllare vasi eventuali perdite. Questo viene fatto usando l'impostazione automatica della pressione del regolatore di pressione. Eliminare le navi con perdita e sostituirlo con un altro segmento. I vasi con perdite non saranno in grado di mantenere la pressione.
13. Valutare il segmento arterioso per curve mantenendo la pressione a 100 mmHg.Utilizzando la vite leva, spostare la cannula per raddrizzare il segmento arterioso. Non più di allungare i segmenti arteriosi; l'obiettivo è quello di simulare in vivo lunghezza segmento arterioso.
14. Ridurre la pressione a 70 mmHg (per imitare in pressione vivo nella galleria mesenterica ¹⁸⁾ e permettere al segmento arterioso per stabilizzare e sviluppare il tono miogena. Le arterie possono essere sotto pressione variabile (40-70 mmHg) in base alla strategia sperimentale e letto vascolare. Una revisione precedentemente pubblicato fornisce un'eccellente recensione di variabilità in MT in segmenti arteriosi provenienti da diversi distretti vascolari ^8.

6. Misurazione del diametro arterioso

1. Guarda le arterie a obiettivo 10X su un microscopio dotato di una fotocamera dispositivo video in bianco e nero ad accoppiamento di carica. Misurare il diametro luminale usando frame video grabber e il sistema di bordo di rilevamento in tempo reale. Un elenco delle attrezzature utilizzate sono riportate nella tabella 3.
2. Monitorare e registrare nave diameter continuamente.
3. Osservare per lo sviluppo di MT. Nota: Abbiamo osservato che nel ratto arterie di resistenza mesenteriche, a 70 mmHg, sviluppo di MT è caratterizzata da ~ 20% di diminuzione di diametro. MT varia secondo letto e animali vascolari specie.
4. Confermare la vitalità vascolare valutando vasocostrittori e vasodilatatori risposte a 1 micron fenilefrina (Phe) e 1 micron acetilcolina (ACh).
5. Al termine di ogni esperimento, determinare diametro passiva (PD) incubando arterie Ca ²⁺ -free PSS per 20 min.

7. Risposta Miogenica

1. Ridurre la pressione a 20 mm Hg e consentire il diametro si stabilizzi. Aumentare la pressione intraluminale in passi incrementali (20, 40, 60, 80 e 100) e ad ogni passo pressione consentono arterie per raggiungere un diametro stabile (di solito entro 5 min).
2. Ridurre la pressione endoluminale a 20 mmHg e incubare il segmento arterioso in Ca ^{2 +} -free PSS contenente 0.39 mMSNP mM EGTA e 0.1. Lasciare che il diametro delle arterie di stabilizzarsi (15 min).
3. Ripetere la risposta pressoria passo a Ca PSS ^{2 +} -free contenente 0.39 mM EGTA e 0,1 SNP mm.

8. Interpretazione dei risultati e calcolo dei dati

1. Calcolare la MT come differenza percentuale di diametro osservato per Ca ²⁺ -contenenti rispetto Ca ²⁺ -free PSS ad ogni pressione secondo la seguente formula:
   
2. Per arterie sottoposti vasomotricità diametro può essere calcolato facendo la media della fase di plateau per 1 min. Esprimere i dati raccolti come percento di relax massima (% PD) secondo la relazione:% Pd = 100 x [ΔD / PD]; ΔD è la differenza tra il diametro prima e dopo l'aggiunta di qualsiasi composto sperimentale (es Phe); PD è diametro passivo (anche ildiametro massimo).

Risultati

Rappresentazione schematica di un miografo pressione tipico set-up è mostrata in Figura 1. Le due estremità del recipiente sono cannulati con una micropipetta di vetro e fissati con suture su entrambi i lati. Via tubo e un rubinetto aperto, una cannula viene collegato ad un regolatore di pressione servocomandato; l'altra cannula è collegata ad un rubinetto chiuso. La camera è perfuso con PSS e diametro vascolare cambiamenti sono osservati da un microscopio invertito collegato ad una telecamera C...

Discussione

Passaggi critici, risoluzione dei problemi e modifiche

In una preparazione tipica imbarcazione isobarica, l'arteria viene pressurizzato a 70 mmHg tra due cannule di vetro perfusi con acqua calda (37 ° C) PSS. Dopo 30-45 min, arterie sviluppano MT, caratterizzato dalla riduzione spontanea di diametro che stabilizza in 20-30 min. Le arterie di resistenza dai vari distretti vascolari sviluppano MT variabile. Per esempio resistenza ratto arterie mesenteriche sviluppano MT ~ 25% di PD, mentre l...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Chemical
Acetylcholine	Sigma Aldrich	A6625
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma Aldrich	223506
D-(+)-Glucose	Sigma Aldrich	G5767
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetra acetic acid (EGTA)	Sigma Aldrich	E3889
Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA)	Sigma Aldrich	E9884
HEPES	Sigma Aldrich	H3784
Magnesium sulfate (MgSO4)	Sigma Aldrich	M7506
MOPS	Sigma Aldrich	M5162
Phenylephrine	Sigma Aldrich	P6126
Potassium chloride (KCl)	Sigma Aldrich	P3911
Potassium phosphate (KH2PO4)	Sigma Aldrich	P5655
Sodium bicarbonate (NaHCO3 )	Sigma Aldrich	S6014
Sodium chloride (NaCl)	Sigma Aldrich	S7653
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma Aldrich	S5881
Sodium nitroprusside	Sigma Aldrich	13451
Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2PO4)	Sigma Aldrich	S9638
Sodium pyruvate	Sigma Aldrich	P8574
			Table 1.
			Physiological salt solution (1000 ml) mM KCl 4.9 0.365 g NaCl 112 6.545 g MgSO4.7H2O 1.2 0.296 g KH2PO4 1.2 0.163 g Glucose 11.5 2.072 g NaHCO3 26 2.184 g HEPES 10 2.383 g CaCl2 2 2 ml (1M stock) De-ionized water 998 ml Ca2+ free physiological salt solution (100 ml) mM KCl 4.9 0.036 g NaCl 112 0.645 g MgSO4.7H2O 1.2 0.029 g KH2PO4 1.2 0.016 g Glucose 11.5 0.207 g NaHCO3 26 0.218 g HEPES 10 0.238 g EGTA 0.39 0.015 g Sodium nitroprusside 0.1 0.0026 g De-ionized water 100 ml Dissection solution, stock (500 ml) mM NaCl 145 21.18 g KCl 4.7 0.875 g MgSO4 1.2 0.739 g MOPS 2 1.049 g EDTA 0.02 0.019 g De-ionized water 500 ml Working dissection solution (100 ml) mM Dissection solution stock 20 ml Glucose 1.2 0.091 g NaH2PO4 5 0.016 g Sodium pyruvate 2 0.022 g CaCl2 2 0.2 ml (1M stock) De-ionized water 79.8 ml
			Table 2. Composition of Experimetnal solutions
			Equipment
CCD Monochrome Camera	The imaging Source	DMK 21AU04
Single inline solution heater	Warner Instruments	64-0102
Thermistor	Warner Instruments	64-0108
Dual automatic temperature controller	Warner Instruments	TC-344B
Flaming/Brown micropipette puller	Sutter Instruments	P-97
Fluorescence System Interface	IonOptix	model FSI-700
Forceps and scissors	World Precision Instruments
Ion Wizard-Core and Analysis	IonOptix	Ion Wizard 6.0
Laboratory tubing	Silastic	508-005
Male Sprague Dawley rat	Harlan Laboratories
Master flex console drive	Cole-parmer
Milli-Q Plus Ultrapure Water System	Millipore	ZD5211584
Ophthalmic monofilament nylon suture	Ethicon	9007G
Photometry and Dimensioning Microscope	Motic	AE31
Pressure Servo Controller with peristaltic pump and pressure transducer	Living Systems Instrumentation	PS-200
Stereomicroscope	Nikon Instruments Inc	SMZ660
Vessel Chamber	Living Systems Instrumentation	CH-1
Dissection dish	Living Systems Instrumentation	DD-90-S
Thin Wall Glass Capillaries	World Precision Instruments	TW120-6
Microforge	Stoelting	51550
			Table 3.