Évaluer la réponse Myogenic et vasoactivité dans les artères mésentériques Résistance Utilisation myographie de pression

Résumé

myographie de pression est utilisée pour évaluer vasoactivité des petites artères qui se développent constriction soutenue lorsqu'il est sous pression. Ce manuscrit fournit un protocole détaillé pour évaluer dans des segments isolés de petites artères mésentériques des rats, vasoactivité et l'effet de la pression intraluminale sur le diamètre vasculaire.

Résumé

Petites artères de résistance se contracter et se dilater respectivement en réponse à une augmentation ou diminution de la pression intraluminale; Ce phénomène connu sous le nom de réponse myogénique est un régulateur clé de la circulation sanguine locale. Dans des conditions isobariques petites artères de résistance développent constriction connu comme tonus myogène (MT), qui est un déterminant majeur de la résistance vasculaire systémique (RVS) ont subi. Par conséquent, ex vivo des préparations pressurisées des petites artères de résistance sont les principaux outils pour étudier la fonction microvasculaire dans les Etats-près physiologique. Pour atteindre cet objectif, un segment intact fraîchement isolées d'une petite artère de résistance (diamètre ~ 260 um) est montée sur deux canules petit de verre et sous pression. Ces préparations artérielles conservent la plupart des caractéristiques de l'évaluation in vivo et de permis du tonus vasculaire en temps réel. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour évaluer vasoactivité dans pressurisés petites artères de résistance mésentériques de rats; ces artères développentvasoconstriction soutenue - environ 25% du diamètre maximal - lorsque pressurisé à 70 mmHg. Ces préparations artérielles peuvent être utilisés pour étudier l'effet des composés expérimentaux sur la relation entre la pression et la vasoactivité intra-artérielle et déterminer les changements dans la fonction microvasculaire dans des modèles animaux de maladies diverses.

Introduction

Petites artères de résistance sont des déterminants majeurs de SVR et jouent un rôle important dans la physiopathologie de nombreuses maladies ^1,2. Des conditions telles que le diabète ^{3, 4} grossesse, d'ischémie-reperfusion ^5, l'obésité et l'hypertension ^6,7 sont fréquemment associées à la fonction microvasculaire altérée. Myographie vasculaire peut non seulement fournir des informations importantes sur les changements dans la fonction microvasculaire dans diverses maladies mais aussi aider à identifier des cibles thérapeutiques et d'évaluer l'efficacité des composés vasoactifs. La fonction vasculaire a été étudiée en utilisant isolés petites artères dans des conditions de navire isométriques ou isobariques ^8. Description détaillée de myographie isométrique est prévue ailleurs ^9. Cependant, il ya des différences dans les données obtenues à partir isométrique comparativement à la préparation isobares ^10-12. Depuis préparations artérielles sous pression permettent l'étude de la fonction microvasculaire dans des conditions quasi-physiologiques, larésultats obtenus peuvent meilleure corrélation avec le comportement in vivo du lit vasculaire ^8,13.

En 1902 Bayliss décrit d'abord l'effet de la pression transmurale sur le diamètre vasculaire ^14. Il a observé dans les petites artères de résistance de différents lits vasculaires des lapins, des chats et des chiens qu'une diminution de la pression a été suivie par une vasodilatation et un accroissement de la pression a été suivie par vasoconstriction. Ce phénomène est connu comme réponse myogénique. Bayliss et chercheurs suivants ont observé que dans des conditions isobares artères petite résistance se développent constriction soutenue connu sous le nom MT ^15,16. Tant réponse myogénique et MT peuvent être évaluées en utilisant myographie de pression (PM) technique. PM est principalement utilisé pour déterminer vasoactivité des petites artères, les veines et autres vaisseaux. En plus d'évaluer l'effet des composés vasoactifs sur le diamètre vasculaire, PM - comme son nom l'indique - est utilisée pour évaluer intravasculaire ch de pression médiationAnges sur le diamètre vasculaire. Au cours des dernières décennies les progrès dans le logiciel de l'ordinateur, ce qui a renforcé la microscopie vidéo et pipette en verre de traction, ont fait PM plus facile à réaliser. Cependant, la dissection de segments intacts viables de petits vaisseaux sanguins reste fastidieuse et parfois difficile. Nous présentons ici un protocole détaillé pour étudier la réponse myogénique dans les petites artères mésentériques résistance isolés de rats.

Protocole

Les exemples présentés ici sont des expériences approuvées par IACUC à Georgia Regents de l'Université - Protocole n °: # 2011-0408

1. Préparation des réactifs

1. Préparer la solution de dissection stock: Pour 500 ml de solution mère de dissection (5x), dissoudre 21,18 g NaCl, 0,875 g de KCl, 0,739 g MgSO _4, 1,049 g et 0,019 g MOPS EDTA dans 450 ml d'eau Milli-Q. Ajuster le pH à 7.3 à 7.4 à l'aide de NaOH 1 N. Compléter le volume à 500 ml avec de l'eau Milli-Q. La solution stock peut être conservé jusqu'à 7-10 jours. Voir le tableau 1 pour une liste de produits chimiques et de leurs fournisseurs. Voir le tableau 2 pour la concentration en mM.
2. Préparer la solution de travail de dissection: Préparer une solution fraîche de dissection de travail chaque jour. Pour 100 ml de solution de travail, dissoudre 0,091 g de glucose, 0,016 g de NaH ₂ PO ₄ et de 0,022 g de pyruvate de sodium dans 79,8 ml d'eau Milli-Q. Ajouter 0,2 ml de _CaCl2 1 M et 20 ml de solution de dissection de stock pour amener volumoi à 100 ml.
3. Préparer une solution de sel physiologique (PSS): Pour préparer 1000 ml PSS, dissoudre 0,365 g de KCl, 6.545 g NaCl, 0,296 g MgSO _4, 0,163 g de KH ₂ PO _4, 2,072 g de glucose, 2.184 g de NaHCO ₃ et 2.383 g HEPES à 950 ml de l'eau Milli-Q. Ajuster le pH à 7.3 à 7.4 à l'aide de NaOH 1 N. Compléter le volume à 1000 ml avec de l'eau Milli-Q. Retirer 2 ml de solution et le remplacer par 2 ml de 1 M CaCl _2. (Fresh PSS doit être préparé tous les jours)
4. Préparer calcium (Ca2 ⁺⁾ du PSS gratuitement: Pour 100 ml PSS sans Ca ^2+, dissoudre 0,036 g de KCl, 0,654 g de NaCl, 0,029 g MgSO _4, 0,016 g de KH ₂ PO _4, 0,207 g de glucose, 0,218 g de NaHCO _3, 0,238 g HEPES, 0,015 g d'EGTA et 0,0026 g de nitroprussiate de sodium (SNP) dans 95 ml d'eau Milli-Q. Ajuster le pH à 7.3 à 7.4 à l'aide de NaOH 1 N. Compléter le volume à 100 ml avec de l'eau Milli-Q.

2. Préparation de verre canules

1. Tirez pipettes en verrepour générer les canules à pointe de 100 à 150 um en utilisant un extracteur de pipette selon les directives du fabricant.
2. Bevel les conseils de la canule de verre en utilisant une biseauteur de microélectrodes, le feu les polir et plier les conseils de la canule de verre par ~ 45 ° à l'aide d'une sonde de chauffe.
3. Chargez les canules dans le porte micropipette et fixer le support de micropipette à la chambre de perfusion.

3. Préparation de perfusion Chambre

1. Chambre de perfusion rinçage avec de l'eau Milli-Q, suivi par une solution de dissection pendant 5 minutes chacun. Chargez la chambre avec 2 ml de solution de dissection.
2. solution de dissection d'aspiration à travers la canule en utilisant seringue de 10 ml et remplissez soigneusement l'ensemble de canule et le tube joint sans bulles. Appliquer aspiration doucement pour éviter la production de bulles.
3. Préparer deux sutures avec une demi-nœud en utilisant chaque pince émoussée. Depuis ophtalmiques sutures monofilament de nylon (10-0, 0,2 métrique) sont utilisés pour préparer les noeuds qui ne sont que1-2 mm de diamètre, dissection microscope peut être nécessaire.
4. Visualisation sous dissection microscope, utiliser une pince de dissection à charger les deux canules avec des noeuds de suture partiellement fermés un peu loin de la pointe. Plus tard, ces nœuds seront glissés attentivement sur les extrémités artérielles une canule et complètement fermées.

4. Collection de l'artère mésentérique Arcade de rats Sprague-Dawley

1. Obtenir l'approbation de la commission locale animaux dans les institutions de soins et d'utilisation (IACUC) avant de procéder à ces expériences. Animaux Maison dans l'animalerie à température contrôlée et de l'éclairage et de permettre le libre accès à l'eau et un rongeur commerciale.
2. Anesthésier les rats par injection intraperitoneale de kétamine (80 mg / kg) et de xylazine (10 mg / kg). Confirmez anesthésie profonde par toe-pincement et si nécessaire administrer des anesthésiques supplémentaires.
3. Après confirmation de l'anesthésie chirurgicale, euthanasier l'animal par décapitation. Suivez les directives AAALAC pour utiLizing méthodes appropriées pour l'euthanasie des animaux.
4. Utilisez une paire de ciseaux de dissection et une pince pour effectuer une laparotomie ligne médiane à partir du bassin de sternum. Cela se fait en deux étapes: d'abord, inciser la peau et les secondes, inciser la couche musculaire sous-jacent. Il faut prendre soin de ne pas blesser les organes intra-abdominaux.
5. Coupez l'extrémité proximale de l'intestin à proximité du pylore et l'extrémité distale à proximité de la jonction iléo-caecale. Attachez les deux extrémités séparément pour éviter la fuite du chyme et les fèces, évitant ainsi la contamination de la solution de bain extracellulaire. Inciser le mésentère à sa base près de l'alimentation vasculaire-à-dire, l'artère mésentérique supérieure et de transférer la totalité du petit lit mésentérique intestinale dans un bécher de 50 ml contenant une solution de dissection glacée.
6. Laisser tissu prélevé de rester en solution de dissection froide de la glace pendant 5 min et rincer avec une solution de dissection frais pour se débarrasser du sang.

5. Isolement et Canulation de 4 ^e Commander artère mésentérique

1. Cerner l'extrémité proximale de l'intestin sur le côté droit dans un plat Sylgard-enduit. Elargir l'intestin restant dans une trajectoire anti-horaire, plaquant le segment vers le bas pour se propager le mésentère et exposer les vaisseaux sanguins (Figure 1). Note: Nous isolons segments artériels à la température ambiante. Sinon, nous plaçons l'arcade mésentérique contenant plat sur la glace. Certains laboratoires, y compris ceux dans notre institution, utilisent des unités de refroidissement à disséquer artères à 4 ° C.
2. Sous un zoom stéréo microscope disséquer 3 ^ème et 4 ^ème ordre petites artères mésentériques (~ 260 um) parallèle à l'intestin grêle à l'aide de petits ciseaux. Première disséquer toute la graisse de couverture. Puis disséquer la veine et isoler l'artère avec un point de branche en forme de V. Veillez à ne pas percer le segment sélectionné. Lancer disséquer la graisse près d'une branche afin ^de 2 ^ème et trouver le moyen de 3 ^e ou 4 ^e ordvaisseaux er.
   1. Note: Les artères et les veines peuvent être distingués en fonction de leur épaisseur de paroi - paroi artérielle est plus épaisse que la veine de. En outre, lorsque attenant tissu conjonctif est tiré doucement perpendiculaire à la vaisseaux, veines effondrement facilement tout artères ne le font pas. Depuis artères avec diamètre de la lumière <400 um sont des sites majeurs de la résistance vasculaire systémique, pour ce protocole, nous avons utilisé 4 ^ième ordre rat artères mésentériques (diamètre de la lumière <300 um).
3. Isoler une section de 4-5 mm de l'artère parallèle à l'intestin grêle. Visualisez tous les 5 branches ^ème ordre d'incorporation dans l'intestin grêle et coupez-les légèrement à l'écart de l'origine de branches et de préserver une partie. Ces parties préservées de branches servent de sites de maintien (avec une pince de dissection) pour transférer des segments artériels à une chambre de perfusion et, par la suite guider leur canulation.
4. Ensuite, couper les segments artériels en faisant deux incisions distaleles 5 branches de commande ^e de chaque côté de l'artère et la transférer à la chambre de perfusion (voir la figure 1C et la légende).
5. Cathétériser une extrémité des vaisseaux sur une micropipette de verre (diamètre: 100 à 150 pm) en utilisant des pinces à dissection en maintenant les extrémités du segment artériel avec une pince à dissection. Faites glisser la suture partiellement fermée précédemment chargé sur l'extrémité canule et le fixer. Remarque: L'extrémité proximale de l'artère peut être pourvue d'une canule sur la canule de verre qui est connecté à un appareil de régulation de pression servo-commandé à imiter en environnement in situ.
6. Fixer une solution de dissection chargé 10 ml seringue au robinet d'arrêt relié à cette canule de telle sorte que la solution de dissection dans la tubulure de raccordement de la canule et se confond avec celle robinet dans la seringue. Soulevez doucement la seringue. La force gravitationnelle sur la solution supprime le sang vasculaire intra à partir de l'extrémité ouverte du récipient. Après avoir retiré le sang intra-artérielle, Fermer le robinet.
   Remarque: vous pouvez fixer le robinet d'arrêt du régulateur de pression, l'allumer et d'augmenter légèrement la pression de 5-10 mm Hg pour obtenir le même résultat.
7. Attachez l'extrémité distale des vaisseaux sur une seconde canule en verre en mettant soigneusement la canule autre aussi près que possible de l'extrémité non liée du segment artériel. Faites glisser la suture partiellement fermée précédemment chargé sur l'extrémité canule et le fixer. Il faut veiller à ne pas tirer ou de tirer sur les segments artériels. Assurez-vous que les robinets attachées aux deux canules sont fermées.
8. Transfert chambre de perfusion sur la scène d'un microscope inversé équipé avec enregistrement vidéo en direct.
9. Connectez le robinet de la canule attachée à l'extrémité proximale du segment artériel à un dispositif de régulation de pression servo-contrôlé et assurez-vous que le robinet fixé à l'autre canule reste fermée pour maintenir la pression intraluminale stable.
10. Ensuite, attacher le tuyau d'aspiration à l'orifice d'aspiration d'une la tubulure de perfusion à l'orifice de perfusion de la chambre.
    Remarque: le port de l'aiguille biseauté est utilisé pour l'aspiration et le port d'aiguille émoussée pour perfusion.
11. Lancer la perfusion de vaisseau avec chaud PSS par simple chauffage de la solution en ligne (37 ° C, en équilibre avec le mélange de gaz: 5% de CO _2, 5% d'O ₂ et 90% N pour maintenir un pH neutre et une oxygénation adéquate ¹⁷⁾ à 2 ml / min en utilisant une pompe péristaltique. Tournez le vide sur ainsi. Placer une thermistance dans la chambre pour surveiller la température en continu.
12. Lorsque la température de PSS dans la chambre approche de ~ 37 ° C (en général moins de 5 min), d'augmenter lentement la pression intraluminale entre 20 et 100 mmHg et de vérifier l'absence de fuites bateaux. Ceci est fait en utilisant le réglage automatique de la pression du régulateur de pression. Jeter vaisseaux avec fuite et le remplacer par un autre segment. Les vaisseaux avec des fuites ne seront pas en mesure de tenir la pression.
13. Évaluer le segment artériel pour les coudes tout en maintenant la pression à 100 mmHg.Utilisation de la vis-levier, déplacer la canule pour redresser le segment artériel. Ne pas trop étirer les segments artériels; l'objectif est de mimer in vivo longueur du segment artériel.
14. Réduire la pression à 70 mm Hg (afin d'imiter la pression vivo dans l'arcade mésentérique ¹⁸⁾ et permettre le segment artériel à stabiliser et à développer tonalité myogénique. Artères peuvent être pressurisés variable (40-70 mmHg) conformément à la stratégie expérimentale et lit vasculaire. Une revue publiée précédemment fournit une excellente analyse de la variabilité de MT dans les segments artériels de différents lits vasculaires ^8.

6. La mesure du diamètre artériel

1. Voir les artères à objectif 10X sur un microscope équipé d'une caméra vidéo monochrome dispositif à couplage de charge. Mesurer le diamètre luminal utilisant trame vidéo grabber et en temps réel du système de détection de bord. Une liste du matériel utilisé est fourni dans le tableau 3.
2. Surveiller et navire record diameter continu.
3. Observez pour le développement de MT. Note: Nous avons observé que chez le rat mésentériques artères de résistance, à 70 mmHg, le développement de MT est caractérisé par ~ diminution de 20% de diamètre. MT varie selon les espèces de lit et animales vasculaires.
4. Confirmez viabilité vasculaire en évaluer les réponses vasoconstricteurs et vasodilatateurs à 1 uM phényléphrine (Phe) et 1 uM acétylcholine (Ach).
5. A la fin de chaque expérience, déterminer diamètre passive (PD) par incubation dans les artères exempt de Ca2 ⁺ PSS pendant 20 min.

7. Réponse Myogenic

1. Réduire la pression à 20 mm Hg et le diamètre permet de se stabiliser. Augmenter la pression intraluminale dans des étapes incrémentielles (20, 40, 60, 80 et 100) et à chaque pas de pression permettent de réaliser les artères un diamètre stable (en général moins de 5 min).
2. Réduire la pression intraluminale à 20 mmHg et incuber le segment artériel Ca ²⁺ exempt PSS contenant 0,39 mMEGTA et 0,1 mM de SNP. Laisser le diamètre artériel à stabiliser (habituellement 15 minutes).
3. Répétez la réponse à la pression dans l'étape Ca ²⁺ de PSS exempt contenant mM EGTA 0,39 et 0,1 mM SNP.

8. Interprétation des résultats et le calcul des données

1. Calculer le MT en tant que la différence de diamètre pour cent observé pour Ca ²⁺ contenant du Ca2 ⁺ par rapport à chaque PSS exempt de pression selon le calcul suivant:
   
2. Pour les artères subissant la vasomotricité le diamètre peut être calculé en faisant la moyenne de la phase de plateau pendant 1 min. Exprimez les données recueillies que pour cent de la relaxation maximale (% PD) selon la relation: PD% = 100 x [AD / PD]; AD est la différence entre le diamètre avant et après l'addition de tout composé à l'étude (par exemple, Phe); PD est le diamètre passive (également lediamètre maximal).

Résultats

Représentation schématique d'un myographe de pression typique mis en place est représenté sur la Figure 1. Les deux extrémités de l'enceinte sont canulées avec une micropipette de verre et fixées avec des sutures, des deux côtés. Via tube et un robinet d'arrêt ouvert, une canule est reliée à un régulateur de pression servo-commandé; l'autre canule est reliée à un robinet d'arrêt fermé. La chambre est perfusée avec PSS diamètre vasculaire et des changements observ...

Discussion

Étapes critiques, le dépannage et modifications

Dans une préparation de navire isobarique typique, l'artère est sous pression à 70 mmHg entre deux canules de verre perfusés avec chaud (37 ° C) PSS. Après 30-45 minutes, les artères se développent MT, caractérisé par une diminution spontanée de diamètre qui se stabilise en 20-30 min. Les artères de résistance de différents lits vasculaires se développent MT variable. Pour une résistance de rat par exemple les artères mése...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Chemical
Acetylcholine	Sigma Aldrich	A6625
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma Aldrich	223506
D-(+)-Glucose	Sigma Aldrich	G5767
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetra acetic acid (EGTA)	Sigma Aldrich	E3889
Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA)	Sigma Aldrich	E9884
HEPES	Sigma Aldrich	H3784
Magnesium sulfate (MgSO4)	Sigma Aldrich	M7506
MOPS	Sigma Aldrich	M5162
Phenylephrine	Sigma Aldrich	P6126
Potassium chloride (KCl)	Sigma Aldrich	P3911
Potassium phosphate (KH2PO4)	Sigma Aldrich	P5655
Sodium bicarbonate (NaHCO3 )	Sigma Aldrich	S6014
Sodium chloride (NaCl)	Sigma Aldrich	S7653
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma Aldrich	S5881
Sodium nitroprusside	Sigma Aldrich	13451
Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2PO4)	Sigma Aldrich	S9638
Sodium pyruvate	Sigma Aldrich	P8574
			Table 1.
			Physiological salt solution (1000 ml) mM KCl 4.9 0.365 g NaCl 112 6.545 g MgSO4.7H2O 1.2 0.296 g KH2PO4 1.2 0.163 g Glucose 11.5 2.072 g NaHCO3 26 2.184 g HEPES 10 2.383 g CaCl2 2 2 ml (1M stock) De-ionized water 998 ml Ca2+ free physiological salt solution (100 ml) mM KCl 4.9 0.036 g NaCl 112 0.645 g MgSO4.7H2O 1.2 0.029 g KH2PO4 1.2 0.016 g Glucose 11.5 0.207 g NaHCO3 26 0.218 g HEPES 10 0.238 g EGTA 0.39 0.015 g Sodium nitroprusside 0.1 0.0026 g De-ionized water 100 ml Dissection solution, stock (500 ml) mM NaCl 145 21.18 g KCl 4.7 0.875 g MgSO4 1.2 0.739 g MOPS 2 1.049 g EDTA 0.02 0.019 g De-ionized water 500 ml Working dissection solution (100 ml) mM Dissection solution stock 20 ml Glucose 1.2 0.091 g NaH2PO4 5 0.016 g Sodium pyruvate 2 0.022 g CaCl2 2 0.2 ml (1M stock) De-ionized water 79.8 ml
			Table 2. Composition of Experimetnal solutions
			Equipment
CCD Monochrome Camera	The imaging Source	DMK 21AU04
Single inline solution heater	Warner Instruments	64-0102
Thermistor	Warner Instruments	64-0108
Dual automatic temperature controller	Warner Instruments	TC-344B
Flaming/Brown micropipette puller	Sutter Instruments	P-97
Fluorescence System Interface	IonOptix	model FSI-700
Forceps and scissors	World Precision Instruments
Ion Wizard-Core and Analysis	IonOptix	Ion Wizard 6.0
Laboratory tubing	Silastic	508-005
Male Sprague Dawley rat	Harlan Laboratories
Master flex console drive	Cole-parmer
Milli-Q Plus Ultrapure Water System	Millipore	ZD5211584
Ophthalmic monofilament nylon suture	Ethicon	9007G
Photometry and Dimensioning Microscope	Motic	AE31
Pressure Servo Controller with peristaltic pump and pressure transducer	Living Systems Instrumentation	PS-200
Stereomicroscope	Nikon Instruments Inc	SMZ660
Vessel Chamber	Living Systems Instrumentation	CH-1
Dissection dish	Living Systems Instrumentation	DD-90-S
Thin Wall Glass Capillaries	World Precision Instruments	TW120-6
Microforge	Stoelting	51550
			Table 3.