按时间当然吲哚菁绿血管造影检测脉络膜血管系统异常在年龄相关性黄斑变性的小鼠模型

摘要

通过尾静脉注射进行吲哚青绿血管造影（ICGA或）提供高品质的ICGA时间过程的图像在小鼠脉络表征异常。

摘要

吲哚菁绿血管造影术（或ICGA）是由眼科医生进行诊断脉络膜和各种眼病，如年龄相关性黄斑变性（AMD）的视网膜血管系统的异常的技术。 ICGA就是将图像特别有用的眼睛由于通过着色层，其红外光谱穿透它的能力后的脉络膜血管。 ICGA时间过程可分为早期，中期和晚期阶段。这三个阶段提供的眼部问题的病理有价值的信息。虽然时间过程ICGA通过静脉（IV）注射剂被广泛应用于临床为脉络膜问题的诊断和管理，ICGA腹腔注射（IP）是常用于动物研究。在这里，我们展示了技术，通过尾静脉注射和共焦激光扫描检眼镜在小鼠体内获取高分辨率ICGA时间过程的图像。我们使用这种技术对图像中的脉络膜乐本期开始的年龄相关性黄斑变性的小鼠模型。虽然这是很容易引入ICG鼠标脉管系统通过IP，我们的数据表明，这是难以通过IP ICGA获得可重复性ICGA时间过程的图像。与此相反，通过尾静脉注射ICGA提供高品质的ICGA时间过程的图像媲美人类的研究。此外，我们发现，ICGA对小白鼠进行使脉络膜血管比对色素的小鼠进行更清晰的图像。我们认为，时间进程IV-ICGA应该成为基于动物模型研究的AMD的标准做法。

引言

吲哚菁绿血管造影（ICGA）是一种诊断测试的眼睛相关的血管图像的问题。 ICG的吸收光谱从790-805纳米范围内，而发射光谱范围为770-880纳米，在835纳米¹的峰值发射。这是从其他流行染料，荧光素钠，其光谱落在在可见光范围内的不同。红外光谱使ICG穿透视网​​膜色素上皮细胞（RPE），serosanguineous流体，及脂质渗出物，所有这些都通过钠 - 荧光素为基础的荧光素血管造影术（FA）可以很容易地阻挡可视化。 ICG是98％的蛋白质结合的从而减少渗出血管，使脉络膜血管与脉络膜病变^1,2增强成像。 ICGA几乎是唯一的选择，以可视化的脉络膜血管，这是后到的RPE。 图1显示ICGA和FA在小鼠眼成像血管的比较。 FA可以bË用于图像的视网膜血管很好，但不是脉络膜血管。与此相反，ICGA可用于图像既视网膜和脉络膜血管系统。 ICGA与高分辨率数字成像系统或扫描激光检眼镜（SLO），连同红外感光摄像头，这是我们在本研究将使用执行。

在临床上，ICGA已在诊断多项的脉络膜视网膜疾病的累及脉络膜血管系统，包括息肉状脉络膜血管病变（PCV），视网膜血管瘤样增生（RAP），视网膜血管样纹，卵黄黄斑营养不良，中心性浆液性脉络膜视网膜病变，脉络膜血管瘤，出血性视网膜推荐动脉macroaneurysms，脉络膜肿瘤，及后的某些形式葡萄膜炎^1,3。 ICGA与FA和光学相干断层扫描（OCT）的结合提供了强大的工具，在渗出性年龄相关性黄斑的诊断和管理的临床医生变性^{（AMD）4-10。} ICGA用于诊断涉及脉络膜情况特别有用。事实上，ICGA被认为是黄金标准诊断PCV，渗出型AMD ^11-13的一个变种。 PCV的特点是分支血管与终端息肉状扩张术在脉络膜血管^11-13网络。 PCV经常与视网膜色素上皮和视网膜有泄漏，并从息肉状组件^11,14,15出血复发serosanguineous支队有关。我们最近通过转基因表达人HTRA1，多官能丝氨酸蛋白酶，在小鼠的视网膜色素上皮细胞^（RPE）16报告第一PCV动物模型的生成。我们发现，增加HTRA1引起的肺炎球菌结合疫苗特征， 如息肉状病变。

在这里，我们展示了通过尾静脉注射使用我们的HTRA1小鼠模型研究的AMD使用时间过程ICGA的。我们的数据表明，IV-ICGA优于IP（或皮下（SC）），当前使用中的字段^17,18为在脉络膜病变表征-ICGA。

在动物研究表

动物实验时，按照批准的机构动物护理和使用委员会（IACUC）协议进行，并按照ARVO声明在眼科和视觉研究用动物被执行。

研究方案

1。仪器的研制

1. 在过程室中的动物设施中进行的过程。
2. 在开始实验前戴口罩，帽子的头发，手术衣，无菌脚罩和手套。
3. 耐热水的烧杯〜40℃的热板上。
4. 放置无菌蓝色垫加热垫，将在以后用于保持成像时的小鼠的体温的顶部。打开加热垫。
5. 准备成像系统：
   1. 取下防尘罩，并打开激光。
   2. 取出55°镜头，并将其安装到机器上。
   3. 从电脑输入的鼠标成像的新病人的床单下（ 如基因型，年龄等 ）的信息，打开图像处理软件。在“设备类型”中，选择红外线（IR）模式。

注：据报道，使用OF予外部双非球面透镜可以改善图像质量^17-20虽然我们也没有问题在由IV-ICGA获得高质量的图像，而无需使用外部透镜（见代表性的结果， 图1-4）。

2。 ICGA的尾静脉注射

1. 扩张鼠标的眼睛，用1％托吡卡胺滴眼液，并等待5分钟。
2. 权衡鼠标来确定麻醉（氯胺酮/甲苯​​噻嗪/乙酰丙嗪65-100/10-20/1-3毫克/千克）所需的量。
3. 检索无菌1毫升注射器以及一个32号针头。用麻醉剂（13毫克/毫升氯胺酮，2.6毫克/毫升的甲苯噻嗪，0.3毫克/毫升乙酰丙嗪在无菌PBS中）腹膜内注射小鼠。等到鼠标完全麻醉（〜5分钟）。
4. 将小鼠尾部成40℃的温水，以使静脉的血管舒张。
5. 检索1 ml注射器用32号针头。撤回集成电路所需量的G，通常为50微升的1毫克/毫升的ICG，其无菌过滤用0.2微米的针筒式过滤器进入无菌管中，对于一个25克鼠标（2毫克/千克）。注意不要引入任何空气进入注射器。
6. 擦拭尾巴用酒精棉签消毒被注入的区域。
7. 握住尾巴，用一只手使尾静脉是向上的。朝上针的斜面，以最小的角度注入针〜2毫米进入静脉。要小心，不要刺穿静脉。拉回注射器略微查找血流痕迹到针毂，这表明，在针被成功插入到静脉中。
8. 慢慢地注入ICG进入静脉。注射时应该有最小的阻力。取下针头，直接涂抹酒精棉球消毒注射部位为〜5-10秒停止任何出血。鼠标然后准备成像。为了赶早阶段（注射后0-4分钟），它是埃塞赶紧微分方程边值问题的图像鼠标。

注：鼠标的眼睛可以很容易地得到干燥，可在麻醉下白内障的发展。它通过在手术过程中应用无菌PBS，以保持眼球湿润是很重要的。擦去多余的PBS与ICGA录制之前，无菌棉签。其他实验室已使用的隐形眼镜，以避免角膜^17-20中脱水。

3。 ICG血管造影

1. 开始拍摄的影像注射ICG，允许脉络膜充盈的早期阶段被捕获后30-40秒，直到视网膜和脉络膜的环流是在最大亮度（0-4分钟）。视网膜血管是最擅长的焦点〜35-45屈光度和脉络膜血管可视化10-15屈光度可视化。
   
   注：在动物模型中的第一次考试，建议从各个角度（鼻，颞，背，腹）捕捉图像，以确定所有可能的abnormalities在脉管系统。在早期阶段，无论是中型和大型脉络膜动脉和静脉都清晰可见。在本协议中使用的动物模型，脉络膜病变（ 如息肉状扩张术）可能开始出现1分钟到早期阶段。
2. 设置图像专注于血管。控制亮度，并采用集中控制模块和调焦旋钮分别。这些值是可调节的数字化，并且容易保持恒定。保持距离，从小鼠眼相机镜头恒定，以确保图像的质量是可重复使用下面的技术。
   
   注：由于该设备只能像眼后的部分，我们尽量保持相机镜头和鼠标红眼常数之间的对焦，亮度和距离，因为我们的图像，整个眼后从不同的角度。这里的关键是使通过眼睛与争夺的领域由ICG发出的圆圈形发光瓦特的相机。这是通过使左到右的完成，向上和向下，并在和出调整相机的位置的，直到整个图像没有暗区。当视摄像机的发光和场一字排开，从眼睛到透镜的距离将是可重复用于下一组图像，以及在对成像质量的最佳距离。
3. 一旦血管是重点，按采集模块上的黑色圆形按钮捕捉图像帧。的圆形黑色按钮也可以用来降低或提高的ICG为最佳图像质量的信号。
4. 确定最佳的视角和聚焦深度图像脉络膜病变。它保持在眼睛的位置，聚焦深度，并固定在整个时间过程ICGA其他设备的设置是很重要的。该图像被保存按采集模块的触摸屏面板上获取按钮。
5. 在6-15分钟船尾收购中间相的图像呃注射。
   
   注意：无论是脉络膜和视网膜血管变得不那么明显的。脉络膜血管表现为弥漫性的荧光。脉络膜病变表现出强荧光出现在对比周围正常背景荧光褪色。
6. 注射后收购的后期图像在17-25分钟。
   
   注：强荧光消失。既脉络膜和视网膜血管不再可见。视神经乳头变黑。 Hyperfluorescent脉络膜病变具有与衰落背景最大对比度。
7. 完成收购图像后，将明确的润滑剂眼胶鼠标的眼睛，离开鼠标加热垫进行恢复。
8. 返回小鼠笼子和等候区。导出图像为TIFF或JPEG文件进行进一步的分析。

注：各相的定时也不是绝对的。我们发现，EA的时机取决于ICG的注入量通道相可能会改变。更ICG趋于延长每个阶段。根据上面列出的每个阶段的主要特征来定义一个阶段的最佳方法是。

结果

我们进行ICGA时间过程中HTRA1转基因小鼠和野生型对照窝，这两者都在CD1背景。白化CD1背景被选中，以方便吲哚青绿血管造影（ICGA）成像（见讨论）。有些动脉瘤样扩张术开始出现在HTRA1小鼠的早期阶段（ 图2，红色箭头表示扩张在容器的顶端和一个红色的圆圈表示一个簇型息肉状病变）。脉络膜血管都清晰可见在WT和HTRA1老鼠在这个早期填充在ICG染料的阶段。在中间阶段，hyperfluorescent?...

讨论

在这项研究中，我们演示了使用ICGA的图像脉络膜病变HTRA1转基因小鼠。的早，中，并在我们的小鼠模型ICGA后期阶段的特征在人类研究中¹匹配的时间过程很好。这一点很重要，使人体病理学和动物的表型，这是无价的对相关的脉络，例如AMD的条件病理生理机制和治疗策略研究之间作出比较。

我们首先进行ICGA小鼠IP注射，发现的时间过程是从小鼠到小鼠高度可变的，这?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spectralis Multi-Modality Imaging System	Heidelberg Engineering, Germany	SPECTRALIS HRA+OCT
Tropicamide ophthalmic solution (1%)	Bausch & Lomb	NDC 24208-585-64	for dilation of pupils
GenTeal Gel	Genteal	NDC 58768-791-15	clear lubricant eye gel
Ketamine	Vedco Inc	NDC 50989-996-06
Xylazine	Lloyd Laboratories	NADA 139-236
Acepromazine	Vedco Inc	NDC 50989-160-11
32-G Needle	Steriject	PRE-32013
1-ml syringe	BD	309659
Indocyanine Green	Pfaltz & Bauer	I01250