La detección de anormalidades en la vasculatura coroidea en un modelo de ratón de la relacionada con la edad degeneración macular por Time-curso de indocianina verde Angiografía

Resumen

Indocianina verde Angiografía (o ICGA) realizado por inyección en la vena de la cola proporciona imágenes de curso temporal ICGA alta calidad para caracterizar las anormalidades en la coroides ratón.

Resumen

Indocianina verde Angiografía (o ICGA) es una técnica realizada por los oftalmólogos para diagnosticar anormalidades de la coroides y la vasculatura de la retina de varias enfermedades oculares como la degeneración macular asociada a la edad (DMAE). ICGA es especialmente útil para la imagen de la vasculatura coroidea posterior del ojo debido a su capacidad de penetrar a través de la capa pigmentada con su espectro infrarrojo. Curso temporal ICGA puede dividirse en etapas temprana, media y fases finales. Las tres fases proporcionan información valiosa sobre la patología de los problemas de los ojos. Aunque el tiempo-curso ICGA por vía intravenosa (IV) de inyección se utiliza ampliamente en la clínica para el diagnóstico y manejo de problemas coroideo, ICGA por inyección intraperitoneal (IP) se utiliza comúnmente en la investigación con animales. Aquí hemos demostrado la técnica para obtener imágenes de alta resolución ICGA tiempo-por supuesto en ratones mediante la inyección de cola vena y confocal de barrido láser oftalmoscopia. Se utilizó esta técnica para la imagen de la coroides lesiones en un modelo de ratón de la degeneración macular relacionada con la edad. Aunque es mucho más fácil introducir ICG a la vasculatura del ratón a través de IP, nuestros datos indican que es difícil obtener imágenes reproducibles curso temporal ICGA por IP-ICGA. Por el contrario, a través de inyección ICGA vena de la cola proporciona imágenes tiempo-por supuesto ICGA alta calidad comparables a los estudios en humanos. Además, demostramos que ICGA realizó en ratones albinos da imágenes más claras de los vasos coroideos que la realizada con ratones pigmentados. Nosotros sugerimos que el tiempo-por supuesto-IV ICGA debería convertirse en una práctica habitual en la investigación AMD basado en modelos animales.

Introducción

Angiografía con verde indocianina (ICGA) es una prueba de diagnóstico para problemas de imagen relacionados con los vasos sanguíneos en el ojo. El espectro de absorción de ICG oscila desde 790 hasta 805 nm, mientras que el espectro de emisión oscila desde 770 hasta 880 nm con la emisión máxima a 835 nm ^1. Esto es diferente de la otra tinte popular, fluoresceína de sodio, cuyo espectro cae en el rango visible. El espectro infrarrojo permite ICG para penetrar a través de epitelio pigmentario de la retina (RPE), de fluido serosanguinolento, y exudados lipídicos, todo lo cual puede bloquear fácilmente la visualización por angiografía con fluoresceína base de sodio-fluoresceína (FA). ICG es del 98% unido a proteínas en el sistema vascular que resulta en menos extravasación, lo que permite mejorar la imagen de los vasos de la coroides y lesiones coroideas ^1,2. ICGA es casi la única opción para visualizar la vasculatura coroidea, que es posterior al RPE. La figura 1 muestra la comparación de ICGA y FA en la vasculatura de formación de imágenes en ojos de ratón. FA puede be utilizado para la imagen de la vasculatura de la retina así pero no la vasculatura coroidea. En contraste, ICGA se puede utilizar para la imagen tanto de la retina y la vasculatura coroidea. ICGA se realiza con sistemas de imágenes digitales de alta resolución o oftalmoscopios láser de barrido (SLO), junto con las cámaras de vídeo sensibles a los infrarrojos, que vamos a utilizar en este estudio.

En la clínica, ICGA se ha recomendado en el diagnóstico de una serie de trastornos coriorretinianas involucra la vasculatura coroidea incluyendo vasculopatía coroidal polipoidea (PCV), Retina angiomatosas Proliferación (RAP), estrías angioides, viteliforme distrofia macular, coriorretinopatía serosa central, hemangioma de coroides, la retina hemorragia macroaneurismas arteriolares, tumores coroideos, y ciertas formas de uveítis posterior ^1,3. La combinación de ICGA con FA y la tomografía de coherencia óptica (OCT) proporciona potentes herramientas para los médicos en el diagnóstico y manejo de exudativa macular relacionada con la edaddegeneración (AMD) ^4-10. ICGA es especialmente útil para el diagnóstico de afecciones que implican la coroides. De hecho, ICGA es considerado el estándar de oro para el diagnóstico de PCV, una variante de la DMAE exudativa ^11-13. PCV se caracteriza por una red de vasos ramificados con dilataciones polipoideas terminales en la vasculatura coroidea ^11-13. PCV se asocia frecuentemente con destacamentos serosanguinolento recurrentes del EPR y la retina con fugas y el sangrado de los componentes polipoideas ^11,14,15. Recientemente hemos informado de la generación del primer modelo animal PCV por transgénica que expresa HTRA1 humana, una serina proteasa multifuncional, en el ratón epitelio pigmentario retiniano (EPR) ^16. Hemos demostrado que el aumento de HTRA1 indujo rasgos característicos del PCV, por ejemplo, lesiones polipoideas.

Aquí hemos demostrado el uso del tiempo-por supuesto ICGA por inyección en la vena de la cola en la investigación de AMD utilizando nuestro modelo de ratón HTRA1. Nuestros datos sugieren que losIV-ICGA es superior a IP (o subcutánea (SC))-ICGA que se utilizan actualmente en el campo de ^17,18 para la caracterización de las lesiones en la coroides.

Declaración sobre Investigación Animal

Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo a los protocolos aprobados por el Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión (IACUC) y se llevaron a cabo de conformidad con la Declaración de ARVO para el uso de animales en Oftálmica y Vision Research.

Protocolo

1. Preparación de Instrumentos

1. El procedimiento se realiza en una sala de procedimientos en una instalación para animales.
2. Use mascarillas, gorros de pelo, batas quirúrgicas, los pies cubiertas estériles y guantes antes de comenzar el experimento.
3. Caliente el agua en un vaso de precipitados a ~ 40 ° C sobre una placa caliente.
4. Coloque una almohadilla azul estéril en la parte superior de una almohadilla eléctrica que se utilizará más adelante para mantener la temperatura corporal del ratón durante la exploración. Encienda la almohadilla térmica.
5. Prepare el sistema de imágenes:
   1. Quite la cubierta de polvo y encender el láser.
   2. Saque la lente de 55 ° y montarlo en la máquina.
   3. Abra el software de imagen de la computadora e ingrese la información del ratón para obtener imágenes bajo la hoja de un nuevo paciente (por ejemplo, el genotipo, la edad, etc.). En "Tipo de dispositivo", seleccione el modo de infrarrojos (IR).

Nota: Se ha informado de que el uso Of una lente asférica de doble externa puede mejorar la calidad de imagen ^17-20 aunque no tenemos ningún problema en la obtención de imágenes de alta calidad por IV-ICGA sin usar lentes externas (ver resultados representativos, Figuras 1-4).

2. Vena de la cola de inyección de ICGA

1. Dilata los ojos de ratones con 1% solución oftálmica de tropicamida y esperar 5 min.
2. Pesar el ratón para determinar la cantidad de anestesia (ketamina / xilazina / Acepromazina 65-100/10-20/1-3 mg / kg) es necesario.
3. Recuperar una jeringa estéril de 1 ml junto con una aguja de calibre 32. Inyectar el ratón por vía intraperitoneal con los anestésicos (13 mg / ml de ketamina, 2,6 mg / ml de xilazina 0,3 mg / ml de Acepromazina en PBS estéril). Espere hasta que el ratón está totalmente anestesiado (~ 5 min).
4. Coloque la cola del ratón en 40 ° C el agua caliente para causar vasodilatación de la vena.
5. Recuperar una jeringa de 1 ml con una aguja de calibre 32. Extraer la cantidad deseada de ICG, típicamente 50 l de 1 mg / ml de ICG, que es estéril filtrada con un filtro de jeringa de 0,2 M en un tubo estéril, por un 25 g de ratón (2 mg / kg). Tenga cuidado de no introducir el aire en la jeringa.
6. Limpie la cola con un algodón con alcohol para esterilizar el área a ser inyectada.
7. Sostenga la cola con una mano para que la vena lateral de la cola es ascendente. Con el bisel de la aguja hacia arriba, inyectar la aguja ~ 2 mm en la vena en un ángulo mínimo. Tenga cuidado de no perforar la vena. Dibujar atrás de la jeringa ligeramente y buscar los rastros de flujo sanguíneo en el cubo de la aguja, lo que indica que la aguja se inserta con éxito en la vena.
8. Lentamente inyectar ICG en la vena. Debe haber un mínimo de resistencia al inyectar. Retire la aguja y aplique una gasa con alcohol directamente en el sitio de inyección para ~ 5-10 segundos para detener cualquier sangrado. El ratón está entonces listo para formación de imágenes. Con el fin de captar la primera fase (0-4 min después de la inyección), es essential a la imagen con el ratón rápidamente.

Nota: los ojos del ratón pueden conseguir fácilmente en seco y pueden desarrollar cataratas bajo anestesia. Es importante mantener el ojo húmedo mediante la aplicación de PBS estéril durante el procedimiento. Limpie el exceso de PBS con un hisopo de algodón estéril antes de la grabación ICGA. Otros laboratorios han utilizado una lente de contacto para evitar la deshidratación de la córnea ^17-20.

3. ICG angiografía

1. Comience a tomar imágenes de 30-40 segundos después de la inyección de ICG, que permite la captura de la primera fase de llenado de la coroides hasta circulaciones retina y la coroides son a su máximo brillo (0-4 min). La vasculatura retinal se visualiza mejor en foco ~ 35-45 dioptrías y la vasculatura coroidea se visualiza al 10-15 dioptrías.
   
   Nota: Durante el primer examen de un modelo animal, se recomienda para capturar imágenes desde todos los ángulos (nasal, temporal, dorsal y ventral) para identificar todos los posibles abnormalities en la vasculatura. Durante la primera fase, las arterias y las venas coroideas medianas y grandes son bien visualizadas. En el modelo animal utilizado en este protocolo, las lesiones coroideas (por ejemplo polipoideas dilataciones) pueden comenzar a aparecer 1 min en la fase temprana.
2. Ajuste el enfoque de la imagen sobre la vasculatura. Control para el brillo y enfoque utilizando el módulo de control y mando de enfoque, respectivamente. Estos valores son ajustables digitalmente y son fácilmente mantienen constantes. Mantenga la distancia desde el ojo del ratón a la constante de lente de la cámara para asegurar la calidad de la imagen es reproducible utilizando la técnica que sigue.
   
   Nota: Dado que el dispositivo sólo puede imagen una porción de la parte posterior del ojo, tratamos de mantener el enfoque, el brillo y la distancia entre la lente de la cámara y el ojo del ratón constante a medida que la imagen de toda la parte posterior del ojo desde distintos ángulos. La clave para esto es para alinear la luminiscencia de forma circular emitida por el ICG a través del ojo con el campo de la vieW de la cámara. Esto se logra haciendo que de izquierda a derecha, de arriba a abajo, y en-y-hacia fuera los ajustes de la posición de la cámara hasta que la imagen tiene áreas oscuras. Cuando la luminiscencia y el campo de visión de la cámara están alineados, la distancia desde el ojo a la lente será reproducible para el siguiente grupo de imágenes, así como a una distancia óptima para la formación de imágenes de calidad.
3. Una vez que la vasculatura está enfocado, capturar los cuadros de imagen pulsando el botón redondo de color negro en el módulo de adquisición. El botón redondo de color negro también se puede utilizar para reducir o aumentar la señal de ICG para la mejor calidad de imagen.
4. Determinar el ángulo de visión óptimo y la profundidad de enfoque para imagen lesiones coroideas. Es importante mantener la posición del ojo, la profundidad de enfoque, y otros ajustes de dispositivos fijos para toda la ICGA tiempo-curso. Las imágenes se guardan pulsando el botón adquieren en el panel de la pantalla táctil del módulo de adquisición.
5. Adquirir imágenes en la fase media de 6-15 min popainyección er.
   
   Nota: Tanto la coroides y los vasos de la retina se distinguen menos. Vasculatura coroidea aparece fluorescencia difusa. Lesiones coroideas expositoras hiperfluorescencia emergen en contraste con el desvanecimiento normal circundante fluorescencia de fondo.
6. Adquirir imágenes en la fase tardía en 17-25 min después de la inyección.
   
   Nota: Hiperfluorescencia desvanece. Ambos vasos coroideos y la retina ya no son visibles. La cabeza del nervio óptico se vuelve negro. Lesiones coroideas hiperfluorescentes tienen máximo contraste con el fondo decoloración.
7. Después de terminar la adquisición de las imágenes, aplicar un gel transparente lubricante ocular para los ojos de ratones y dejar el ratón sobre una almohadilla térmica para la recuperación.
8. Ratones Vuelva a sus jaulas y zona de espera. Exportación de imágenes como archivos TIFF o JPEG para su posterior análisis.

Nota: El tiempo de cada fase no es absoluta. Encontramos que el momento de eafase ch podría cambiar dependiendo de la cantidad de ICG inyectado. Más ICG tiende a prolongar cada fase. La mejor manera de definir una fase es de acuerdo con las características principales de cada fase que aparece arriba.

Resultados

Se realizó curso de tiempo ICGA en HtrA1 ratones transgénicos y sus compañeros de camada WT de control, ambos de los cuales están en el fondo CD1. El fondo CD1 albino fue seleccionado para facilitar la angiografía con verde indocianina (ICGA) de imágenes (ver Discusión). Algunos aneurisma como dilataciones comenzó a aparecer en la primera fase en el ratón HTRA1 (Figura 2, una flecha roja indica la dilatación en el extremo de un recipiente y un círculo rojo indica una lesión polipoidea tipo c...

Discusión

En este estudio, hemos demostrado el uso de ICGA a imagen lesiones coroideas en ratones transgénicos HtrA1. Las características de los principios, mediados y finales de las fases de ICGA en nuestro modelo de ratón coincide con el curso temporal bien en los estudios humanos ^1. Esto es importante para hacer mejores comparaciones entre patología y animales fenotipos humanos, que son de gran valor para la investigación sobre los mecanismos fisiopatológicos y las estrategias de tratamiento de condiciones rel...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spectralis Multi-Modality Imaging System	Heidelberg Engineering, Germany	SPECTRALIS HRA+OCT
Tropicamide ophthalmic solution (1%)	Bausch & Lomb	NDC 24208-585-64	for dilation of pupils
GenTeal Gel	Genteal	NDC 58768-791-15	clear lubricant eye gel
Ketamine	Vedco Inc	NDC 50989-996-06
Xylazine	Lloyd Laboratories	NADA 139-236
Acepromazine	Vedco Inc	NDC 50989-160-11
32-G Needle	Steriject	PRE-32013
1-ml syringe	BD	309659
Indocyanine Green	Pfaltz & Bauer	I01250