Erkennen von Fehlbildungen in Aderhautgefäßsystem in einem Maus-Modell der Altersbedingte Makuladegeneration durch Zeitverlauf Indocyaningrün-Angiographie

Zusammenfassung

Indocyaningrün-Angiographie (ICGA oder) durch Schwanzveneninjektion durchgeführt, bietet hochwertige ICGA Zeitverlauf Bilder, Anomalien in der Maus Aderhaut zu charakterisieren.

Zusammenfassung

Indocyaningrün-Angiographie (oder ICGA) ist eine Technik, die von Augenärzten durchgeführt, um Anomalien der Aderhaut und Netzhautgefäß verschiedener Augenkrankheiten, wie altersbedingte Makula-Degeneration (AMD) zu diagnostizieren. ICGA ist besonders nützlich, um das hintere Bild choroidalen Gefäßsystem des Auges aufgrund ihrer Eignung zur Durchdringung durch die pigmentierte Schicht mit Infrarotspektrum. ICGA Zeitverlauf kann in frühe, mittlere und späte Phasen unterteilt werden. Die drei Phasen liefern wertvolle Informationen über die Pathologie von Augenproblemen. Obwohl der Zeitverlauf ICGA durch intravenöse (IV)-Injektion ist weit verbreitet in der Klinik für die Diagnose und Behandlung von Aderhautproblemen eingesetzt, ICGA durch intraperitoneale Injektion (IP) wird häufig in Tierversuchen eingesetzt. Hier zeigten wir die Technik, um hochauflösende ICGA Zeitverlauf Bilder in Mäusen durch Schwanzveneninjektion und konfokale Scanning-Laser-Ophthalmoskopie erhalten. Wir nutzten diese Technik, um das Bild choroidalen legen in einem Mausmodell der altersbedingten Makuladegeneration. Obwohl es viel einfacher, ICG zur Maus Vaskulatur von IP einzuführen, zeigen unsere Daten, dass es schwierig ist, reproduzierbare ICGA Zeitverlaufsbildern von IP-ICGA erhalten. Im Gegensatz dazu ICGA über Schwanzveneninjektion bietet hochwertige ICGA Zeitverlauf Bilder vergleichbar mit Studien am Menschen. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass ICGA geführt auf Albinomäuse gibt klarere Bilder von choroidalen Gefäßen als pigmentierter Mäuse durchgeführt. Wir schlagen vor, dass die Zeit-Gänge-IV-ICGA sollte eine gängige Praxis in AMD Forschung auf der Grundlage von Tiermodellen zu werden.

Einleitung

Indocyaningrün-Angiographie (ICGA) ist ein diagnostischer Test zur Imageprobleme, die Blutgefäße in den Augen stehen. Das Absorptionsspektrum der ICG Bereiche 790-805 nm, während das Emissionsspektrum im Bereich von 770 bis 880 nm mit der Peakemission bei 835 nm ^1. Dies unterscheidet sich von den anderen bekannten Farbstoff Fluorescein-Natrium, dessen Spektrum liegt im sichtbaren Bereich. Das Infrarotspektrum ermöglicht ICG durch retinale Pigmentepithel (RPE), serosanguineous Flüssigkeit und Fettausscheidungen, die alle leicht zu blockieren Visualisierung durch Natrium-Fluorescein-basierte Fluoreszenzangiographie (FA) zu durchdringen. ICG ist zu 98% an Proteine ​​gebunden im Gefäßsystem, was zu weniger Extravasation, so dass verbesserte Bildgebung von Aderhautgefäße und choroidalen Läsionen ^1,2. ICGA ist fast die einzige Wahl, um choroidalen Gefäßsystem, die hinter RPE visualisieren. Abbildung 1 zeigt den Vergleich der ICGA und FA in bildgebenden Gefäßsystem in der Maus die Augen. FA kann be zur Abbildung der Netzhautgefäßsystem gut, aber nicht der choroidalen Gefäßsystem. Im Gegensatz dazu können die Bild ICGA sowohl retinalen und choroidalen Gefäßsystem verwendet werden. ICGA ist mit hochauflösenden Digital-Imaging-Systeme oder Scanning-Laser-Ophthalmoskop (SLO) zusammen mit infrarotempfindlichen Videokameras, die wir in dieser Studie verwenden durchgeführt.

In der Klinik hat ICGA bei der Diagnose eine Reihe von chorioretinale Störungen mit Beteiligung des Aderhautgefäßsystem einschließlich polypoidale choroidalen Vaskulopathie (PCV), Netzhaut angiomatöse Proliferation (RAP), angioiden Streifen, vitelliformen Makuladystrophie, Zentral serosa, choroidalen Hämangiom, Blutungen der Netzhaut empfohlen arteriolar Makroaneurysmen, choroidale Tumoren und bestimmte Formen von Uveitis posterior ^1,3. Die Kombination von ICGA mit FA und Optische Kohärenztomographie (OCT) bieten leistungsstarke Tools für die Ärzte in der Diagnose und Behandlung der exsudativen altersbedingten Makula-Degeneration (AMD) ^10.04. ICGA ist besonders nützlich für die Diagnose von Bedingungen, die die Aderhaut. In der Tat ist ICGA als der Goldstandard für die Diagnose von PCV, eine Variante der exsudativen AMD ^11-13. PCV wird von einem Netzwerk von verzweigenden Gefäßen mit endständigen polypoidal Streckungen in der choroidalen Gefäß ^11-13 gekennzeichnet. PCV wird häufig mit rezidivierenden serosanguineous Abteilungen der RPE und Netzhaut mit Leck und Blutungen aus den Komponenten polypoidal ^11,14,15 verbunden. Vor kurzem berichteten wir die Erzeugung des ersten PCV Tiermodell durch menschliche HTRA1, ein multifunktionales Serinprotease transgen exprimiert, in Maus retinalen Pigmentepithel (RPE) ^16. Wir haben gezeigt, dass eine erhöhte HTRA1 induzierten charakteristischen Merkmale der PCV, z. B. polypoidal Läsionen.

Hier zeigten wir den Einsatz von Zeitverlauf ICGA durch Schwanzveneninjektion in die Forschung mit unserem AMD HTRA1 Mausmodell. Unsere Daten legen nahe, dassIV-ICGA überlegen ist IP (oder subkutan (SC))-ICGA, die derzeit im Bereich ^17,18 für die Charakterisierung von Läsionen in der Aderhaut verwendet werden.

Erklärung zum Tierforschung

Tierversuche wurden nach den Protokollen, die von Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) genehmigt durchgeführt und wurden in Übereinstimmung mit der ARVO Erklärung für die Nutzung von Tieren in Ophthalmic und Vision Research durchgeführt.

Protokoll

1. Vorbereitung der Instrumente

1. Das Verfahren wird in einem Behandlungsraum in einer Tiereinrichtung durchgeführt wird.
2. Tragen Gesichtsmasken, Haarhauben, OP-Kittel, sterile Abdeckungen Fuß-und Handschuhe vor dem Beginn des Experiments.
3. Hitze Wasser in einem Becher auf ~ 40 ° C auf einer Heizplatte.
4. Legen Sie eine sterile blauen Pad auf einem Heizkissen, die später verwendet werden, um die Körpertemperatur der Maus während der Bildgebung halten wird. Schalten Sie das Heizkissen.
5. Bereiten Sie die Imaging-System:
   1. Entfernen Sie die Staubschutzabdeckung und schalten Sie den Laser.
   2. Nehmen Sie die 55 °-Objektiv und montieren sie auf die Maschine.
   3. Öffnen Sie die Imaging-Software aus dem Computer und geben Sie die Daten von der Maus für die Bildgebung unter Blatt eines neuen Patienten (zB Genotyp, Alter, etc.). Unter "Gerätetyp", wählen Sie Infrarot (IR)-Modus.

Anmerkung: Es wurde berichtet, dass die Verwendung of eine externe Doppel asphärische Linse können die Bildqualität zu verbessern ^17-20 obwohl wir haben kein Problem bei der Beschaffung von qualitativ hochwertigen Bildern von IV-ICGA ohne externe Linsen (siehe repräsentative Ergebnisse, Abbildungen 1-4).

2. Schwanzveneninjektion von ICGA

1. Dilate Maus Augen mit 1% Tropicamide Augenlösung und warten 5 Minuten.
2. Wiegen Sie die Maus, um die Menge der Narkose (Ketamin / Xylazin / Acepromazine 65-100/10-20/1-3 mg / kg) benötigt bestimmen.
3. Abrufen einer sterilen 1-ml-Spritze mit einer 32 G-Nadel. Spritzen Sie die Maus intraperitoneal mit Anästhetika (13 mg / ml Ketamin, 2,6 mg / ml Xylazin, 0,3 mg / ml Acepromazine in sterilem PBS). Warten Sie, bis die Maus vollständig betäubt wird (~ 5 min).
4. Platzieren Sie die Maus Schwanz in 40 ° C warmem Wasser, um Vasodilatation der Vene führen.
5. Abrufen einer 1 ml-Spritze mit einer 32 G-Nadel. Ziehen Sie die gewünschte Menge an ICG, typischerweise 50 &mgr; l 1 mg / ml ICG, die steril mit einem 0,2 &mgr; m-Spritzenfilter filtriert, in ein steriles Röhrchen, für eine 25 g-Maus (2 mg / kg) ist. Achten Sie darauf, um die Luft in die Spritze einzuführen.
6. Wischen Sie den Schwanz mit einem Alkoholtupfer, um den Bereich injiziert werden sterilisieren.
7. Halten den Schwanz mit einer Hand, so daß die laterale Schwanzvene steigend. Mit der Abschrägung der Nadel nach oben, die Nadel zu injizieren ~ 2 mm in die Vene zu einem minimalen Winkel. Achten Sie darauf, um die Vene zu perforieren. Zeichnen Sie wieder auf die Spritze leicht und suchen nach Spuren des Blutflusses in die Nadel-Hub, der anzeigt, dass die Nadel wurde erfolgreich in die Vene eingeführt.
8. Langsam spritzen ICG in die Vene. Es sollte minimal sein Widerstand bei der Injektion. Entfernen Sie die Nadel und wenden Sie einen Alkoholtupfer direkt auf die Injektionsstelle für ca. 5-10 Sekunden, um Blutungen zu stoppen. Die Maus ist dann bereit für die Bildgebung. Um die Frühphase (0-4 min nach der Injektion) zu fangen, ist es essential für Bild mit der Maus schnell.

Hinweis: Mouse Augen können leicht trocken und kann Katarakt unter Narkose zu entwickeln. Es ist wichtig, das Auge feucht indem sterile PBS während des Verfahrens zu halten. Wischen Sie überschüssiges PBS mit einem sterilen Wattestäbchen, bevor ICGA Aufnahme. Andere Labors haben eine Kontaktlinse eingesetzt, um Austrocknung der Hornhaut ^17-20 vermeiden.

3. ICG-Angiographie

1. Start, um Bilder aufzunehmen 30-40 sec nach ICG-Injektion, die die Erfassung der frühen Phase der Aderhautfüllung ermöglicht, bis Netzhaut-und Aderhautkreisläufe sind bei maximaler Helligkeit (0-4 min). Die Netzhautgefäßsystem wird am besten bei Fokus ~ 35-45 Dioptrien und Aderhautgefäßsystem wird bei 10-15 Dioptrien sichtbar visualisiert.
   
   Hinweis: Während der ersten Untersuchung eines Tiermodells, wird empfohlen, um Bilder aus allen Winkeln (nasal, temporal, dorsalen und ventralen) zu erfassen, um alle möglichen abno identifizierenrmalities in das Gefäßsystem. Während der frühen Phase sind die beiden mittleren und großen choroidalen Arterien und Venen gut visualisiert. Im Tiermodell in diesem Protokoll verwendet wird, kann choroidalen Läsionen (zB polypoidal Streckungen) beginnen, 1 min in der frühen Phase angezeigt.
2. Stellen Sie die Bildschärfe über das Gefäßsystem. Steuerung für Helligkeit und Fokus mit dem Steuermodul und Fokusknopf auf. Diese Werte sind digital einstellbar und leicht konstant gehalten. Den Abstand von der Maus Auge des Kameraobjektivs konstant mit der hier beschriebenen Technik die Bildqualität zu gewährleisten, ist reproduzierbar.
   
   Hinweis: Da das Gerät nur Bild ein Teil des hinteren Augen, versuchen wir, den Fokus, Helligkeit und den Abstand zwischen Linse und Auge der Maus konstant zu halten, da wir das gesamte Bild hinteren Augen aus verschiedenen Blickwinkeln. Der Schlüssel dazu ist, um die kreisförmige Lumineszenz durch die ICG durch das Auge mit dem Feld auszurichten vie emittiertenw der Kamera. Dies wird durch das von links nach rechts durchgeführt, oben und unten, und in-und aus Einstellungen der Kameraposition, bis das gesamte Bild hat keine dunklen Stellen. Wenn die Lumineszenz und das Sichtfeld der Kamera aufgereiht sind, wird der Abstand vom Auge auf die Linse reproduzierbar sein für den nächsten Satz von Bildern als auch in einem optimalen Abstand zur Bildqualität.
3. Sobald das Gefäßsystem im Fokus ist, erfassen die Bildrahmen durch Drücken der runden schwarzen Knopf auf der Erfassungsmodul. Die runde schwarze Taste kann auch verwendet werden, zu reduzieren oder zu verbessern das Signal des ICG für beste Bildqualität werden.
4. Bestimmen Sie den optimalen Blickwinkel und Fokussierung Tiefe Bild choroidalen Läsionen. Es ist wichtig, die Position des Auges, die Fokussierungstiefe und andere Geräteeinstellungen für den gesamten Zeitverlauf ICGA fixiert zu halten. Die Bilder werden durch Drücken erwerben Taste auf dem Touch-Screen-Panel des Erfassungsmodul gespeichert.
5. Erwerben Sie Bilder in der mittleren Phase bei 15.06 min achternäh Injektion.
   
   Hinweis: Sowohl die Aderhaut und Netzhautgefäße werden weniger deutlich. Aderhautgefäßsystem erscheint als diffuse Fluoreszenz. Aderhautläsionen aufweisen Hyper entstehen im Gegensatz zu den Fading umgebenden normalen Hintergrundfluoreszenz.
6. Erwerben Sie Bilder in der Spätphase bei 17-25 Minuten nach der Injektion.
   
   Hinweis: Hyperfluoreszenz verblasst. Beide Aderhaut-und Netzhautgefäße sind nicht mehr sichtbar. Der Sehnervenkopf wird schwarz. Hyperfluoreszente choroidalen Läsionen maximale Kontrast mit dem Verblassen Hintergrund.
7. Nach Abschluss der Übernahme von Bildern, gelten eine klare Schmiermittel Augen-Gel auf Maus Augen und lassen Sie die Maus auf einem Heizkissen für die Verwertung.
8. Zurück Mäuse in ihre Käfige und Haltebereich. Export Bilder als Tiff oder JPEG-Dateien zur weiteren Analyse.

Anmerkung: Der Zeitpunkt für jede Phase ist nicht absolut. Wir fanden, dass der Zeitpunkt der each Phase kann je nach der Menge des eingespritzten ICG ändern. Mehr ICG neigt dazu, jede Phase zu verlängern. Der beste Weg, um eine Phase zu definieren, ist nach den wichtigsten Funktionen der einzelnen oben aufgeführten Phase.

Ergebnisse

Wir führten ICGA Zeitverlauf in HTRA1 transgenen Mäusen und Kontroll WT Wurfgeschwistern, die beide auf der CD1 Hintergrund. Der Albino CD1 Hintergrund wurde ausgewählt, um Indocyaningrün-Angiographie (ICGA)-Bildgebung (siehe Diskussion) zu erleichtern. Einige Aneurysma wie Streckungen begann in der frühen Phase in der HTRA1 Maus erscheinen (Abbildung 2, eine rote Pfeil zeigt die Erweiterung an der Spitze eines Schiffes und ein roter Kreis zeigt eine Läsion polypoidal Cluster-Typ). Aderhautgefäß...

Diskussion

In dieser Studie haben wir gezeigt, die Verwendung von ICGA für Bild choroidalen Läsionen in HTRA1 transgenen Mäusen. Die Eigenschaften der frühen, mittleren und späten Phasen der ICGA in unserem Mausmodell entsprechen den Zeitverlauf auch in Studien am Menschen ^ein. Dies ist wichtig, um bessere Vergleiche zwischen der menschlichen Pathologie und Tier Phänotypen, die von unschätzbarem Wert für die Erforschung der pathophysiologischen Mechanismen und Behandlungsstrategien von Bedingungen, die der Aderh...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spectralis Multi-Modality Imaging System	Heidelberg Engineering, Germany	SPECTRALIS HRA+OCT
Tropicamide ophthalmic solution (1%)	Bausch & Lomb	NDC 24208-585-64	for dilation of pupils
GenTeal Gel	Genteal	NDC 58768-791-15	clear lubricant eye gel
Ketamine	Vedco Inc	NDC 50989-996-06
Xylazine	Lloyd Laboratories	NADA 139-236
Acepromazine	Vedco Inc	NDC 50989-160-11
32-G Needle	Steriject	PRE-32013
1-ml syringe	BD	309659
Indocyanine Green	Pfaltz & Bauer	I01250