Rilevamento Anomalie nella coroide Vasculature in un modello murino di età degenerazione maculare da Time-course verde indocianina angiografia

Riepilogo

Indocianina verde Angiografia (o ICGA) eseguita tramite iniezione coda vena offre immagini di alta qualità dei corsi tempo ICGA di caratterizzare anomalie nel topo coroide.

Abstract

Indocianina verde Angiografia (o ICGA) è una tecnica eseguita da oculisti per diagnosticare anomalie del sistema vascolare della retina e della coroide di varie malattie oculari come la degenerazione maculare legata all'età (AMD). ICGA è particolarmente utile per l'immagine della vascolarizzazione della coroide posteriore dell'occhio grazie alla sua capacità di penetrare attraverso lo strato pigmentato con il suo spettro infrarosso. Decorso ICGA può essere diviso in inizio, metà e fasi tardive. Le tre fasi forniscono preziose informazioni sulla patologia di problemi agli occhi. Anche se il tempo portate da ICGA endovenosa (IV) iniezione è ampiamente usato in clinica per la diagnosi e la gestione dei problemi coroide, ICGA mediante iniezione intraperitoneale (IP) è comunemente utilizzato nella ricerca animale. Qui abbiamo dimostrato la tecnica per ottenere immagini ad alta risoluzione ICGA volta portate nei topi tramite iniezione coda vena e confocale laser oftalmoscopia a scansione. Abbiamo usato questa tecnica per l'immagine della coroide lesioni in un modello murino di età-correlate degenerazione maculare. Anche se è molto più facile introdurre ICG alla vascolarizzazione mouse IP, i nostri dati indicano che è difficile ottenere immagini riproducibili corso tempo ICGA da IP-ICGA. Al contrario, ICGA tramite iniezione coda vena fornisce ICGA immagini time-Corso di alta qualità paragonabili a studi umani. Inoltre, abbiamo dimostrato che ICGA eseguita su topi albino dà immagini più chiare dei vasi coroideali quella eseguita su topi pigmentati. Suggeriamo che il tempo-corso IV-ICGA dovrebbe diventare una pratica standard nella ricerca di AMD basata su modelli animali.

Introduzione

Indocianina angiografia verde (ICGA) è un test diagnostico per problemi di immagine legati ai vasi sanguigni negli occhi. Lo spettro di assorbimento ICG varia 790-805 nm mentre lo spettro di emissione varia 770-880 nm con il picco di emissione a 835 nm ^1. Questo è diverso dall'altro colorante popolare, fluoresceina sodica, il cui spettro rientra nel campo del visibile. Lo spettro infrarosso permette ICG di penetrare attraverso l'epitelio pigmentato retinico (RPE), fluido sieroematico, e essudati lipidici, ognuno dei quali può facilmente bloccare la visualizzazione da base di sodio fluoresceina angiografia con fluoresceina (FA). ICG è del 98% legato alle proteine ​​nel sistema vascolare con conseguente stravaso di meno, consentendo una maggiore rappresentazione dei vasi coroideali e lesioni della coroide ^1,2. ICGA è quasi l'unica scelta per visualizzare vascolarizzazione della coroide, che è posteriore RPE. Figura 1 mostra il confronto dei ICGA e FA in vasi di imaging in occhi di topo. FA può be utilizzato per l'immagine del sistema vascolare e della retina, ma non il sistema vascolare della coroide. Al contrario, ICGA può essere utilizzato per l'immagine sia retinica e vascolarizzazione della coroide. ICGA viene eseguita con sistemi di imaging digitale ad alta risoluzione o oftalmoscopi scansione laser (SLO) insieme con videocamere a infrarossi sensibili, che useremo in questo studio.

Nella clinica, ICGA è stato raccomandato nella diagnosi di una serie di disturbi corioretiniche che coinvolge il sistema vascolare della coroide compreso Polypoidal coroide vasculopatia (PCV), retina angiomatose proliferazione (RAP), strie vascolari, vitelliforme distrofia maculare, corioretinopatia sierosa centrale, emangioma della coroide, emorragia retinica macroaneurysms arteriolare, tumori della coroide, e alcune forme di uveite posteriore ^1,3. La combinazione di ICGA con FA e Optical Coherence Tomography (OCT) fornire strumenti potenti per i medici nella diagnosi e gestione delle essudativa maculare legata all'etàdegenerazione (AMD) ^4-10. ICGA è particolarmente utile per le condizioni che comportano la coroide diagnosi. In realtà, ICGA è considerato il gold standard per la diagnosi di PCV, una variante di AMD essudativa ^11-13. PCV è caratterizzato da una rete di ramificazione navi con dilatazioni polypoidal terminali nel sistema vascolare coroideale ^11-13. PCV è spesso associata a ricorrenti distaccamenti sieroematico del RPE e della retina con perdite e sanguinamento dai componenti polypoidal ^11,14,15. Recentemente abbiamo riportato la generazione del primo modello animale PCV da transgenically esprimendo HTRA1 umano, una serina proteasi multifunzionale, nel topo dell'epitelio pigmentato retinico (RPE) ^16. Abbiamo dimostrato che l'aumento HTRA1 indotto caratteristiche del PCV, ad esempio lesioni polypoidal.

Qui abbiamo dimostrato l'uso del time-course ICGA tramite iniezione vena della coda nella ricerca AMD utilizzando il nostro modello di topo HTRA1. I nostri dati suggeriscono cheIV-ICGA è superiore a IP (o sottocutanea (SC))-ICGA che sono attualmente utilizzati nel campo ^17,18 per la caratterizzazione di lesioni nella coroide.

Dichiarazione sulla Animal Research

Gli esperimenti sugli animali sono stati condotti secondo protocolli approvati dalla Institutional Animal Care ed uso commissione (IACUC), e sono stati eseguiti in conformità con la Dichiarazione ARVO per l'uso di animali in Oftalmica e Vision Research.

Protocollo

1. Preparazione degli strumenti

1. La procedura viene eseguita in una sala operatoria in un impianto animale.
2. Indossare mascherine, cuffie capelli, camici chirurgici, piede copertine sterili, guanti prima di iniziare l'esperimento.
3. Riscaldare l'acqua in un becher a ~ 40 ° C su una piastra.
4. Collocare un tampone sterile blu sulla cima di una piastra elettrica che verrà utilizzato successivamente per mantenere la temperatura corporea del mouse durante l'imaging. Accendere il riscaldamento pad.
5. Preparare il sistema di imaging:
   1. Togliere il coperchio antipolvere e accendere il laser.
   2. Estrarre la lente 55 ° e montarlo sulla macchina.
   3. Aprire il software di imaging dal computer e inserire le informazioni del mouse per l'imaging in un nuovo foglio del paziente (ad esempio genotipo, età, ecc.). In "tipo di dispositivo", scegliere la modalità a infrarossi (IR).

Nota: E 'stato riportato che l'uso of una lente asferica doppia esterna può migliorare la qualità dell'immagine ^17-20 anche se non abbiamo alcun problema a ottenere immagini di alta qualità da parte IV-ICGA senza l'utilizzo di lenti esterne (vedi risultati rappresentativi, Figure 1-4).

2. Coda Vena Iniezione di ICGA

1. Dilatare gli occhi di topo con 1% soluzione oftalmica Tropicamide ed attendere 5 min.
2. Pesare il mouse per determinare la quantità di anestesia (Ketamina / xylazina / Acepromazine 65-100/10-20/1-3 mg / kg) necessari.
3. Recupero di una siringa sterile da 1 ml con un ago G 32. Iniettare il mouse per via intraperitoneale con anestetici (13 mg / ml di ketamina, 2,6 mg / ml xylazina, 0,3 mg / ml acepromazina in PBS sterile). Attendere che il mouse è completamente anestetizzato (~ 5 min).
4. Posizionare la coda di topo in 40 ° C acqua calda per provocare vasodilatazione della vena.
5. Recuperare una siringa da 1 ml con un ago G 32. Prelevare la quantità desiderata di ICG, tipicamente 50 microlitri di 1 mg / ml ICG, che è sterile filtrata con un filtro a siringa da 0,2 mM in una provetta sterile, per un 25 g mouse (2 mg / kg). Fare attenzione a non introdurre aria nella siringa.
6. Pulire la coda con alcool per sterilizzare la zona da iniettare.
7. Tenere la coda con una mano in modo che la vena caudale laterale è alto. Con la smussatura dell'ago verso l'alto, iniettare l'ago ~ 2 millimetri nella vena con un angolo minimo. Fare attenzione a non forare la vena. Disegnare indietro sulla siringa leggermente e cercare tracce di flusso di sangue nel mozzo dell'ago, che indica che l'ago è stato inserito correttamente nella vena.
8. Iniettare lentamente ICG nella vena. Ci dovrebbe essere una resistenza minima quando si inietta. Rimuovere l'ago e applicare un tampone imbevuto di alcol direttamente al sito di iniezione per ~ 5-10 sec per fermare le emorragie. Il mouse è pronto per l'imaging. Per raggiungere la fase precoce (0-4 minuti dopo l'iniezione), è Essential per l'immagine con il mouse rapidamente.

Nota: gli occhi del mouse possono ottenere facilmente secca e possono sviluppare la cataratta in anestesia. E 'importante per mantenere l'occhio umido applicando PBS sterile durante la procedura. Pulire l'eccesso di PBS con un tampone di cotone sterile prima della registrazione ICGA. Altri laboratori hanno utilizzato una lente a contatto per evitare la disidratazione del ^17-20 cornea.

3. ICG Angiografia

1. Inizia a prendere le immagini 30-40 secondi dopo ICG iniezione, che consente la cattura della prima fase del riempimento della coroide fino circolazione della retina e della coroide sono alla massima luminosità (0-4 min). La vascolarizzazione retinica è meglio visualizzato alla messa a fuoco ~ 35-45 diottrie e vascolare della coroide è visualizzato a 10-15 diottrie.
   
   Nota: Durante la prima visita di un modello animale, si consiglia di acquisire immagini da tutte le angolazioni (nasali, temporale, dorsale e ventrale) per individuare tutte le possibili abnormalities nel sistema vascolare. Durante la prima fase, entrambe le arterie e le vene della coroide medie e grandi sono ben visualizzati. Nel modello animale utilizzato in questo protocollo, le lesioni della coroide (ad esempio polypoidal dilatazioni) possono iniziare a comparire 1 min in fase precoce.
2. Impostare la messa a fuoco dell'immagine sul sistema vascolare. Controllo per la luminosità e messa a fuoco utilizzando il modulo di controllo e la manopola di messa a fuoco, rispettivamente. Questi valori sono regolabili digitalmente e sono facilmente mantenute costanti. Mantenere la distanza dall'occhio mouse per il costante obiettivo della fotocamera per assicurare una qualità dell'immagine è riproducibile con la tecnica che segue.
   
   Nota: Poiché il dispositivo può solo immagine una porzione dell'occhio posteriore, cerchiamo di mantenere la messa a fuoco, luminosità, e la distanza tra la lente e l'occhio telecamera topo costante come immagine dell'intero posteriore dell'occhio da diverse angolazioni. La chiave di questo è quello di allineare la luminescenza di forma circolare emessa dal ICG attraverso l'occhio con il campo di view della telecamera. Questo si ottiene facendo da sinistra a destra, su e giù, e in-and-out regolazioni della posizione della telecamera fino a quando l'intera immagine ha aree scure. Quando la luminescenza e il campo visivo della telecamera sono allineati, la distanza dall'occhio alla lente può essere riproducibile per la successiva serie di immagini e ad una distanza ottimale per l'imaging di qualità.
3. Una volta che il sistema vascolare è a fuoco, catturare i fotogrammi dell'immagine premendo il pulsante rotondo nero sul modulo di acquisizione. Il pulsante nero rotondo può anche essere utilizzato per ridurre o aumentare il segnale di ICG per una migliore qualità dell'immagine.
4. Determinare l'angolo di visione ottimale e la profondità di messa a fuoco dell'immagine lesioni della coroide. È importante mantenere la posizione dell'occhio, la profondità di messa a fuoco, e altre impostazioni dei dispositivi fissi per tutto il tempo portate ICGA. Le immagini vengono salvate premendo il tasto acquisire sul pannello touch screen del modulo di acquisizione.
5. Acquisire le immagini nella fase centrale a 6-15 min poppainiezione er.
   
   Nota: Sia la coroide e vasi retinici diventano meno distinti. Vascolare della coroide appare fluorescenza diffusa. Le lesioni della coroide espositrici iperfluorescenza emergono in contrasto con la dissolvenza circostante sfondo normale fluorescenza.
6. Acquisire le immagini in fase tardiva a 17-25 minuti dopo l'iniezione.
   
   Nota: iperfluorescenza svanisce. Entrambi i vasi della coroide e della retina non sono più visibili. La testa del nervo ottico diventa nero. Le lesioni della coroide Hyperfluorescent hanno un contrasto massimo con lo sfondo dissolvenza.
7. Dopo aver terminato l'acquisizione delle immagini, applicare un gel trasparente lubrificante occhio agli occhi del mouse e lasciare il mouse su una piastra elettrica per il recupero.
8. Topi tornare alle loro gabbie e la zona della holding. Esportare le immagini come file TIFF o JPEG per ulteriori analisi.

Nota: I tempi di ciascuna fase non è assoluto. Abbiamo trovato che i tempi di bisfase ch potrebbe cambiare a seconda della quantità di ICG iniettato. Più ICG tende a prolungare ogni fase. Il modo migliore per definire una fase corrisponde alle caratteristiche di ciascun fase sopra elencati.

Risultati

Abbiamo eseguito andamento nel tempo ICGA in HtrA1 topi transgenici e fratellini WT di controllo, che sono entrambi sullo sfondo CD1. Il CD1 sfondo albino è stato scelto per facilitare indocianina angiografia con verde (ICGA) immagini (vedi la discussione). Alcuni aneurisma come dilatazioni cominciarono ad apparire nella prima fase nel topo HTRA1 (Figura 2, una freccia rossa indica la dilatazione sulla punta di una nave e un cerchio rosso indica un tipo di cluster di lesione polypoidal). Vasi coroideal...

Discussione

In questo studio, abbiamo dimostrato l'uso di ICGA per immagini delle lesioni della coroide in HtrA1 topi transgenici. Le caratteristiche del primo, mezzo, e fasi tardive della ICGA nel nostro modello di topo corrispondono il decorso bene negli studi umani ^1. Questo è importante per fare meglio il confronto tra patologia e animali fenotipi umani, che sono di valore inestimabile per la ricerca sui meccanismi fisiopatologici e strategie di trattamento di condizioni relative alla coroide come AMD.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spectralis Multi-Modality Imaging System	Heidelberg Engineering, Germany	SPECTRALIS HRA+OCT
Tropicamide ophthalmic solution (1%)	Bausch & Lomb	NDC 24208-585-64	for dilation of pupils
GenTeal Gel	Genteal	NDC 58768-791-15	clear lubricant eye gel
Ketamine	Vedco Inc	NDC 50989-996-06
Xylazine	Lloyd Laboratories	NADA 139-236
Acepromazine	Vedco Inc	NDC 50989-160-11
32-G Needle	Steriject	PRE-32013
1-ml syringe	BD	309659
Indocyanine Green	Pfaltz & Bauer	I01250