Détecter des anomalies dans les vaisseaux sanguins de la choroïde dans un modèle de souris de la dégénérescence maculaire liée à l'âge par Time-sûr indocyanine vert angiographie

Résumé

Vert d'indocyanine (angiographie ou ICG) réalisée par injection dans la veine caudale fournit des images ICGA de cours de temps de qualité pour caractériser des anomalies dans la choroïde de la souris.

Résumé

Vert d'indocyanine angiographie (ou ICG) est une technique réalisée par les ophtalmologistes pour diagnostiquer des anomalies de la choroïde et le système vasculaire rétinien de diverses maladies oculaires telles que la dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA). ICG est particulièrement utile pour l'imagerie du système vasculaire choroïdienne postérieure de l'oeil dû à sa capacité de pénétrer à travers la couche pigmentée avec son spectre infrarouge. ICG cours du temps peut être divisé en début, milieu et fin phases. Les trois phases fournissent de précieuses informations sur la pathologie de problèmes oculaires. Bien que le temps bien sûr ICGA par voie intraveineuse (IV) l'injection est largement utilisé dans la clinique pour le diagnostic et la gestion des problèmes choroïde, ICG par injection intrapéritonéale (IP) est couramment utilisé dans la recherche animale. Ici, nous avons démontré la technique pour obtenir des images haute résolution ICGA temps-cours chez la souris par injection de queue veineuse et ophtalmoscopie confocale à balayage laser. Nous avons utilisé cette technique à l'image de la choroïde lesions dans un modèle de souris de la dégénérescence maculaire liée à l'âge. Bien qu'il soit beaucoup plus facile d'introduire ICG à la vascularisation de la souris par IP, nos données indiquent qu'il est difficile d'obtenir des images reproductibles ICGA cours du temps par IP-ICG. En revanche, ICG par injection dans la veine caudale fournit ICGA images temps de cours de qualité comparables à des études humaines. En outre, nous avons montré que ICGA effectuée sur des souris albinos donne des images plus claires de vaisseaux choroïdiens que celle réalisée sur des souris pigmentées. Nous suggérons que le temps bien sûr IV-ICG devrait devenir une pratique courante dans la recherche AMD basée sur des modèles animaux.

Introduction

Indocyanine angiographie au vert (ICG) est un test de diagnostic de problèmes d'image liés aux vaisseaux sanguins dans l'oeil. Le spectre d'absorption de l'ICG varie de 790 à 805 nm alors que le spectre d'émission s'étend de 770 à 880 nm avec le pic d'émission à 835 nm ^1. Ceci est différent de l'autre colorant populaire, la fluorescéine de sodium, dont le spectre se situe dans la gamme visible. Le spectre infrarouge permet ICG à pénétrer à travers l'épithélium rétinien pigmentaire (RPE), fluide sérosanguineux, et les exsudats lipidiques, qui peut facilement bloquer la visualisation par base de sodium de fluorescéine angiographie à la fluorescéine (FA). ICG est de 98% liée aux protéines dans le système vasculaire résultant en moins d'extravasation, permettant une meilleure imagerie des vaisseaux de la choroïde et de lésions de la choroïde ^1,2. ICG est presque le seul choix pour visualiser la vascularisation de la choroïde, qui est postérieure à l'EPR. Figure 1 montre la comparaison des ICG et FA en imagerie vasculaire dans les yeux de souris. FA peut be utilisé pour l'image de la vascularisation de la rétine bien mais pas la vascularisation de la choroïde. En revanche, ICG peut être utilisé à la fois l'image de la rétine et de la vascularisation de la choroïde. ICG est réalisée avec haute résolution de systèmes d'imagerie numérique ou ophtalmoscope laser à balayage (SLO) ainsi que dans l'infrarouge des caméras vidéo, que nous utiliserons dans cette étude.

Dans la clinique, ICG a été recommandée dans le diagnostic d'un certain nombre de troubles choriorétiniennes impliquant le système vasculaire de la choroïde, y compris polypoïdale choroïde vasculopathie (PCV), de la rétine angiomateux prolifération (RAP), stries angioïdes, vitelliforme dystrophie maculaire, CRSC, hémangiome choroïdien, la rétine hémorragie macroaneurysms artériolaires, les tumeurs de la choroïde, et certaines formes de uvéite postérieure ^1,3. La combinaison de ICG avec FA et la tomographie par cohérence optique (OCT) fournissent des outils puissants pour les cliniciens dans le diagnostic et la gestion des exsudative maculaire liée à l'âgedégénérescence (AMD) ^4-10. ICG est particulièrement utile pour des conditions impliquant la choroïde diagnostic. En fait, ICG est considéré comme l'étalon-or pour le diagnostic PCV, une variante de la DMLA exsudative ^11-13. PCV est caractérisé par un réseau de vaisseaux de ramification avec des dilatations polypoïdale terminaux dans le système vasculaire de la choroïde ^11-13. PCV est fréquemment associée à des détachements sérosanguineux récurrents de l'EPR et de la rétine avec des fuites et des saignements des composants polypoïdale ^11,14,15. Nous avons récemment rapporté la génération du premier modèle animal de PCV par voie transgénique exprimant HTRA1 humain, une serine protease multi-fonctionnel, chez la souris l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) ^16. Nous avons montré que l'augmentation induite HTRA1 caractéristiques de PCV, par exemple lésions polypoïdale.

Ici, nous avons démontré l'utilisation du temps-cours ICGA par injection dans la veine de la queue à la recherche d'AMD en utilisant notre modèle de souris de HTRA1. Nos données suggèrent queIV-ICG est supérieure à l'IP (ou sous-cutanée (SC))-ICG qui sont actuellement utilisés dans le domaine de ^17,18 pour la caractérisation des lésions dans la choroïde.

Déclaration sur la recherche sur les animaux

Les expérimentations animales ont été menées selon des protocoles approuvés par des institutionnels de protection des animaux et l'utilisation Comité (IACUC), et ont été réalisées conformément à la Déclaration ARVO pour l'utilisation d'animaux dans ophtalmique et Vision Research.

Protocole

Une. Préparation des instruments

1. La procédure est réalisée dans un bain de procédure dans une animalerie.
2. Porter des masques, bonnets, blouses chirurgicales, pied-housses stériles et des gants avant de commencer l'expérience.
3. Chauffer l'eau dans un gobelet pour ~ 40 ° C sur une plaque chauffante.
4. Placez un coussin bleu stérile sur un coussin chauffant qui sera utilisé plus tard pour maintenir la température du corps de la souris lors de l'imagerie. Mettez le coussin chauffant.
5. Préparer le système d'imagerie:
   1. Retirez le couvercle de la poussière et allumer le laser.
   2. Sortez la lentille de 55 ° et le monter sur la machine.
   3. Ouvrez le logiciel d'imagerie de l'ordinateur et entrer les informations de la souris pour l'imagerie sous la feuille d'un nouveau patient (par exemple, génotype, âge, etc.). Sous la rubrique «type de dispositif», choisissez mode infrarouge (IR).

Remarque: Il a été rapporté que l'utilisation of un à double lentille asphérique externe peut améliorer la qualité d'image ^17-20, même si nous n'avons pas de problème à obtenir des images de haute qualité en IV-ICGA sans l'aide de lentilles externes (voir résultats représentatifs, les figures 1-4).

2. L'injection de la veine caudale ICG

1. Dilater les yeux de souris avec 1% Tropicamide solution ophtalmique et attendre 5 min.
2. Peser la souris pour déterminer le montant de l'anesthésie (kétamine / xylazine / acépromazine 65-100/10-20/1-3 mg / kg) nécessaire.
3. Récupérer un 1 ml seringue stérile avec une aiguille 32 G. Injecter la souris par voie intrapéritonéale avec les anesthésiques (13 mg / ml de kétamine, 2,6 mg / ml de xylazine 0,3 mg / ml dans du PBS stérile acépromazine). Attendez jusqu'à ce que la souris est totalement anesthésié (~ 5 min).
4. Placez la queue de la souris dans 40 ° C l'eau chaude pour provoquer une vasodilatation de la veine.
5. Récupérer une seringue de 1 ml avec une aiguille 32 G. Prélever la quantité voulue de l'ICG, typiquement 50 ul de 1 mg / ml ICG, qui est stérilisée par filtration avec un filtre à seringue de 0,2 uM dans un tube stérile, pour une souris de 25 g (2 mg / kg). Veillez à ne pas introduire de l'air dans la seringue.
6. Essuyez la queue avec un tampon d'alcool pour stériliser la zone à injecter.
7. Tenez la queue d'une main de sorte que la veine caudale latérale est à la hausse. Avec le biseau de l'aiguille vers le haut, injecter l'aiguille ~ 2 mm dans la veine à un angle minimal. Veillez à ne pas perforer la veine. Dessiner sur la seringue légèrement et retrouver des traces de la circulation sanguine dans le moyeu de l'aiguille, ce qui indique que l'aiguille a été insérée avec succès dans la veine.
8. Injecter lentement ICG dans la veine. Il devrait y avoir une résistance minimale lors de l'injection. Retirer l'aiguille et appliquer un tampon imbibé d'alcool directement sur le site d'injection pendant environ 5-10 secondes pour arrêter le saignement. La souris est ensuite prêt pour l'imagerie. Afin de rattraper la première phase (0-4 min après l'injection), il est essential à l'image de la souris rapidement.

Remarque: les yeux de souris peuvent facilement se sécher et peuvent développer une cataracte sous anesthésie. Il est important de garder l'oeil humide en appliquant PBS stérile pendant la procédure. Essuyez l'excès de PBS avec un coton-tige stérile avant l'enregistrement ICG. D'autres laboratoires ont utilisé une lentille de contact pour éviter la déshydratation de la cornée de ^{17 à 20.}

3. Angiographie ICG

1. Commencer à prendre des images 30-40 secondes après injection ICG, qui permet la capture de la première phase de remplissage de la choroïde jusqu'à circulations rétiniennes et choroïdiennes sont à la luminosité maximale (0-4 min). La vascularisation rétinienne est mieux visualisé à discussion ~ 35-45 dioptries et vasculaire de la choroïde est visualisé à 10-15 dioptries.
   
   Remarque: Lors du premier examen d'un modèle animal, il est recommandé de capturer des images sous tous les angles (nasales, temporelle, dorsale et ventrale) pour identifier tous abno possiblermalities dans le système vasculaire. Au cours de la première phase, les deux artères et des veines choroïdiennes moyennes et grandes sont bien visualisées. Dans le modèle animal utilisé dans ce protocole, les lésions de la choroïde (par exemple polypoïdale de dilatations) peuvent commencer à apparaître 1 min dans la première phase.
2. Régler la mise au point de l'image sur le système vasculaire. Contrôle de la luminosité et de se concentrer à l'aide du module de commande et le bouton de mise au point, respectivement. Ces valeurs sont réglables numériquement et sont facilement maintenus constants. Gardez la distance de l'œil de la souris à la constante de lentille de la caméra pour assurer la qualité d'image est reproductible en utilisant la technique qui suit.
   
   Remarque: Comme l'appareil ne peut l'image d'une partie de l'œil postérieur, nous essayons de garder le focus, la luminosité et la distance entre la lentille de la caméra et l'oeil de la souris constante comme nous l'image de la totalité de l'œil postérieur sous des angles différents. La clé pour cela est d'aligner la luminescence en forme de cercle émis par le GIC à travers l'œil avec le domaine de la View de la caméra. Ceci est accompli en faisant de gauche à droite, des ajustements vers le haut et vers le bas, et en-and-out de la position de la caméra jusqu'à ce que la totalité de l'image n'a pas de zones sombres. Lorsque la luminescence et le champ de vision de la caméra sont alignées, la distance de l'œil à la lentille sera reproductible pour le prochain ensemble d'images, ainsi que à une distance optimale pour une qualité d'image.
3. Une fois le système vasculaire est mise au point, de capturer les trames d'image en appuyant sur le bouton rond noir sur le module d'acquisition. Le bouton rond noir peut également être utilisé pour réduire ou augmenter le signal de l'ICG pour une meilleure qualité d'image.
4. Déterminer l'angle de vue optimal et profondeur de focalisation à des lésions de la choroïde de l'image. Il est important de garder la position de l'œil, la profondeur de focalisation, et d'autres paramètres de l'appareil fixe pour l'ensemble de l'ICGA temps bien sûr. Les images sont enregistrées en appuyant sur le bouton d'acquérir sur le panneau de l'écran tactile du module d'acquisition.
5. Acquérir des images dans la phase intermédiaire à 6-15 min à l'arrièreinjection er.
   
   Remarque: Les deux de la choroïde et vaisseaux rétiniens deviennent moins distinctes. Vascularisation de la choroïde apparaît fluorescence diffuse. Lésions choroïdiennes présentant hyperfluorescence émergent contrairement à la décoloration entourant la fluorescence de fond normal.
6. Acquérir des images dans la phase tardive à 17-25 minutes après l'injection.
   
   Remarque: hyperfluorescents s'estompe. Les deux navires de la choroïde et de la rétine ne sont plus visibles. La tête du nerf optique devient noir. Lésions de la choroïde hyperfluorescentes ont contraste maximal avec le fond à la décoloration.
7. Après avoir terminé l'acquisition d'images, appliquer un gel lubrifiant œil clair pour les yeux de souris et de laisser la souris sur un coussin chauffant pour la récupération.
8. Souris retourner dans leurs cages et zone d'attente. Exporter des images sous forme de fichiers TIFF ou JPEG pour une analyse plus approfondie.

Remarque: Le calendrier de chaque phase n'est pas absolue. Nous avons constaté que le calendrier de chphase de ch pourrait changer en fonction de la quantité de ICG injectée. Plus ICG tend à prolonger chaque phase. La meilleure façon de définir une phase est fonction des caractéristiques principales de chacune des phases énumérées ci-dessus.

Résultats

Nous avons effectué ICG cours du temps dans HtrA1 des souris transgéniques de la même portée et de WT de commande, qui sont tous deux sur le fond CD1. Le CD1 fond albinos a été choisi pour faciliter l'angiographie au vert d'indocyanine (ICG) d'imagerie (voir la discussion). Certains anévrisme comme dilatations ont commencé à apparaître dans la phase précoce chez la souris HTRA1 (Figure 2, une flèche rouge indique la dilatation à l'extrémité d'un navire et un cercle rou...

Discussion

Dans cette étude, nous avons démontré l'utilisation de ICG à l'image des lésions choroïdiennes chez des souris transgéniques HtrA1. Les caractéristiques du début, au milieu, et les phases tardives de ICG dans notre modèle de souris correspondent le cours du temps et dans les études humaines ^1. Il est important de prendre de meilleures comparaisons entre pathologie et animales phénotypes humains, qui ont une valeur inestimable pour la recherche sur les mécanismes physiopathologiques et des...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spectralis Multi-Modality Imaging System	Heidelberg Engineering, Germany	SPECTRALIS HRA+OCT
Tropicamide ophthalmic solution (1%)	Bausch & Lomb	NDC 24208-585-64	for dilation of pupils
GenTeal Gel	Genteal	NDC 58768-791-15	clear lubricant eye gel
Ketamine	Vedco Inc	NDC 50989-996-06
Xylazine	Lloyd Laboratories	NADA 139-236
Acepromazine	Vedco Inc	NDC 50989-160-11
32-G Needle	Steriject	PRE-32013
1-ml syringe	BD	309659
Indocyanine Green	Pfaltz & Bauer	I01250