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摘要

Hepatitis C Virus (HCV) is a major human pathogen that causes liver disorders, including cirrhosis and cancer. An HCV infectious cell culture system is essential for understanding the molecular mechanism of HCV replication and developing new therapeutic approaches. Here we describe a protocol to investigate various stages of the HCV replication cycle.

摘要

丙型肝炎病毒（HCV）影响世界人口的3％，并导致严重的肝脏疾病，包括慢性肝炎，肝硬化和肝细胞癌。丙型肝炎病毒是属于黄病毒科的包膜RNA病毒。目前的治疗是不充分有效的，并导致不利的副作用。没有丙型肝炎病毒疫苗可用。因此，需要开发一种疫苗和更好的治疗持续的努力。的HCV细胞培养体系是研究HCV生长的不同阶段，包括病毒进入，基因组复制，包装和出口的关键。在当前的程序提出，我们用野生型intragenotype 2a中的嵌合病毒，FNX-HCV和重组FNX-的Rluc病毒携带的Renilla荧光素酶报道基因来研究病毒的复制。一个人肝癌细胞株（Huh-7型）用于体外转录转染丙型肝炎病毒基因组RNA的。无细胞培养物上清液，蛋白裂解液和叔OTAL核糖核酸收获的不同时间点转染后，以评估HCV生长。丙型肝炎病毒基因组的复制状态是由定量RT-PCR和可视化HCV的存在双链RNA进行评估。丙型肝炎病毒蛋白的表达，用特异性HCV NS3和NS5A蛋白的抗体，Western blot和免疫荧光试验验证。感染性颗粒释放到培养上清液中和病毒滴度的HCV RNA转染的细胞进行测定。荧光素酶检测被用于评估记者丙型肝炎病毒的复制水平和传染性。总之，我们提出的各种病毒学检测表征丙型肝炎病毒复制周期的不同阶段。

引言

丙型肝炎病毒（HCV）导致肝硬化和肝癌。它影响1.7亿人在全球拥有35万人，每年死于1-3。 HCV是正链RNA病毒为9.6 kb的基因组大小。 HCV基因组被翻译成的〜3000氨基酸残基被蛋白水解由各种细胞和病毒蛋白酶裂解成10多肽的单个蛋白。 HCV是原型病毒属中的肝炎病毒，属于黄病毒科 4。曝光后，建立了丙型肝炎病毒慢性感染者中80％的个体。这种感染大多是无症状的，及时的诊断可以允许治疗性干预，以防止肝恶化。目前的治疗是不理想的，没有疫苗可用5,6。

丙型肝炎的病因在1989年7年首次描述。学习丙型肝炎病毒复制是丙型肝炎的疫苗和治疗研究的重要，但它一直由缺少一种有效的病毒培养体系的长期阻碍。丙型肝炎病毒的分子克隆被证明是在感染后肝内接种8只黑猩猩。随后，HCV亚基因组复制子进行了说明，其中允许解剖病毒基因组的复制阶段中的细胞培养系统9,10。一个基因型2a丙型肝炎病毒的发现隔离JFH-1（日本暴发性肝炎-1），能够感染细胞培养中打开丙型肝炎病毒复制的研究11-13新途径。基因型2a株JFH-1基于跨内和基因型嵌合病毒基因型1丙型肝炎病毒感染的基础培养体系可作为以及14-18。

我们已成功地使用JFH-1株和HCV intragenotype 2a中的嵌合病毒，得到蛋白质结构域和顺式作用RNA元件19,20的高分辨率官能剖析图。根据这一点，我们在这里描述的有效培养系统经常使用的，允许研究HCV复制周期和宿主 - 病原体相互作用的不同阶段。我们目前的病毒学检测，以评估病毒基因组的复制和intragenotype 2A丙型肝炎病毒和海肾萤光素酶报告基于 ​​丙型肝炎病毒新发感染。

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研究方案

该协议的一个大致轮廓示于图1。

1。细胞

  1. 制备包含10〜15％的胎牛血清（FBS），10mM的非必需氨基酸，10mM的HEPES，青霉素（100单位/ ml），链霉素（100毫克/毫升），和2mM L-谷氨酰胺的完全生长培养基。
  2. 在包含用于体外分析丙型肝炎病毒复制周期的上述补充完全生长培养基维持咦-7.5.1细胞13。
  3. 培养的病毒株在Huh-7.5.1细胞用指定的补充生长培养基，在37℃，5％的CO 2。

2，病毒和质粒构建

  1. 产生的互补DNA（cDNA）形式的HCV RNA，并克隆至为便于基因操作的质粒​​载体。注：日本的暴发性肝炎1的发现，JFH-1（基因型2a丙型肝炎病毒），隔离一直为HCV研究的关键，并且是主要用于研究丙型肝炎病毒复制周期11-13。根据JFH-1 HCV间和intragenotypic嵌合病毒常用于研究14-18。合成intragenotype 2A嵌合病毒，FNX-HCV，和一个单顺反子嵌合记者株的构建先前19和施工细节超出了本协议的范围被描述。
  2. 使用pFNX - HCV intragenotype 2a中的病毒，因为它包含一个5'NTR，结构区和P7和NS2的非结构区的一部分（核苷酸1到2878）的J6CF亲本菌株（NCBI登录号AF177036）的，如以及JFH-1病毒株（NCBI登录号AB047639）的非结构部件。注：合成FNX-HCV的基础上，JC1 intragenotype 2A嵌合HCV以前的序列15日报道。
  3. 产生单顺反子的嵌合记者病毒构建体中，pFNX-的Rluc的基础上，pFNX-HCV株（以上步骤2.2）通过插入A R5'NTR和核心基因（新台币之间的388和389）之间enilla荧光素酶基因。接着，用口蹄疫病毒2A（F2A）的肽序列，这将作为一个卵裂信号连接的荧光素酶基因和该构建体的核心基因。
  4. 工程师RNA聚合酶空（POL-）病毒构建使用无论是pFNX-HCV或pFNX，在Rluc病毒的背景。更换NS5B聚合酶催化残基，GDD（AA 2759年至2761年; nt的8615-8623）任一这些病毒骨架与AAG氨基酸残基的。

3， 在体外 HCV RNA转录

  1. 使用intragenotype 2A嵌合病毒FNX-HCV和FNX-HCV聚合酶空（POL-）对丙型肝炎病毒复制（ 图2A）的评价。
  2. 线性化病毒质粒用XbaI限制性内切酶，然后用绿豆核酸酶，产生平末端处理。通过阴离子交换层析纯化经消化的质粒。验证完整性Øf通过对DNA的琼脂糖凝胶电泳（ 图2B）的线性化的质粒。
  3. 用T7-RNA聚合酶转录的线性化病毒质粒。
  4. 净化使用RNA纯化试剂盒新合成的DNA酶处理的RNA。
  5. 通过琼脂糖凝胶电泳（ 图2C）验证RNA的生产。
  6. 用分光光度法定量的RNA。
  7. 存储所生成的RNA在-80℃下在10微克工作等分试样。注意：要通过转录RNA的一切对每个病毒样本和控制，同时每个实验的设计中尽量减少RNA质量的变化。

4，丙型肝炎病毒RNA的转染和样品采集

  1. 使用胰蛋白酶收获的Huh-7.5.1细胞。
  2. 冲洗细胞，离心并用冷低血清培养基悬浮两次暂停。重悬的细胞在低血清培养基中以每毫升1×10 7个细胞。
  3. 混合总共10＆＃956;克的转录病毒RNA在一个0.4厘米电穿孔杯中加入400μl重悬的细胞（4×10 6个细胞）。通过电穿孔在270 V转染的细胞中，100Ω和950μF。
  4. 重悬的电穿孔的细胞在10ml完全生长培养基含15％FBS中。注：电穿孔的细胞的生存力增加被认为是当的Huh-7.5.1细胞在15％胎牛血清中培养。
  5. 镀在两个T-25培养瓶中（〜1.2×10 6每烧瓶中的细胞）和48孔板（1×10 4个，每孔细胞）为下列每个时间点的细胞：4，48和96小时。
  6. 有10％FBS更换介​​质在4-8小时转染后用新鲜补充的生长介质，以从培养瓶和板去除死细胞碎片。
  7. 收获细胞培养物上清液在48中，96小时的时间点，并从采集的样品通过细胞离心4去除细胞碎片在1,500 rpm离心10分钟 ºC。
  8. 存储该无细胞上清液于-80℃。裂解细胞用于蛋白和RNA的分析用Western印迹和逆转录 - 定量聚合酶链反应在指定的时间点。

5，反转录定量PCR（RT-qPCR的），以评估丙型肝炎病毒基因组复制

  1. 执行两步RT-qPCR的确定HCV基因组RNA的拷贝数。
  2. 反转录1使用逆转录酶和其结合5'NTR（JFH RTQ注：5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3'）具体为HCV义链的引物细胞总RNA微克或特异于持家基因肽基异构酶G（PPIG R A引物：5'-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3'）。还逆转录使用HCV义链引物的已知基因组拷贝（10月1日至十月九日标准）的FNX-HCV RNA（在步骤3中生成的）。
  3. 开展定量PCR用50纳克导致转录的cDNA用HCV特异性引物（JFH RTQF：5'CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3; JFH RTQ记：5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3'）和DNA结合含有定量PCR超级混合绿色染料。进行定量PCR的看家基因PPIG以及（PPIG引物F：5'-GAAGAGTGCGATCAAGAACCCATGAC-3'; PPIG R：5'-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3'）注：为了计算准确的细胞内HCV RNA水平跨越样品，用细胞看家基因，PPIG ，表达水平扫描（CT周期）进行归一化。使用FNX-HCV基因组的拷贝数作为拷贝数测定标准。
  4. 使用以下条件时，运行定量PCR来确定HCV RNA拷贝数：95ºC为15秒和60   ºC为30秒（40个循环），使用实时PCR系统。
  5. 参见图3A和图3B为基因组复制的结果。

6，Western印迹分析检测的HCV蛋白的表达（图3C）

  1. 用细胞裂解液FROM病毒RNA转染96小时后转染蛋白免疫印迹分析。
  2. 使用SDS-PAGE，并转​​移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，解决了细胞裂解物。
  3. 用含5％脱脂乳，0.2％吐温20的磷酸盐缓冲盐水（PBS）封闭液阻断膜。
  4. 孵育膜与初级小鼠单克隆抗体NS3（1千稀释）和β-肌动蛋白（1 5000稀释）。
  5. 添加山羊抗小鼠IgG缀合至辣根过氧化物酶（1 5000稀释）和通过化学发光检测。

7，免疫荧光法（IFA）

  1. 用甲醇30分钟-20ºC的免疫荧光法修复HCV感染和转染的细胞。
  2. 用PBS洗细胞3次，用IFA阻断缓冲液阻断。
  3. 用兔多克隆抗NS5A主要抗体或鼠单克隆抗-DSR（由达斯古普塔博士，加州大学洛杉矶分校友情提供）NA抗体J2的稀释度为1:200（1微克/毫升）并孵育5小时至过夜，4 ºC。
  4. 初级抗体后，3次，用PBS洗涤细胞。
  5. 添加山羊抗兔IgG-488多克隆第二抗体或山羊抗小鼠IgG-594多克隆第二抗体以1:1000的稀释度（1微克/毫升），并孵育1小时，在室温下进行。
  6. 用PBS使用荧光显微镜（ 图3D）应用Hoechst染料和视图3倍和染色细胞核洗细胞。

8，测量病毒滴度

  1. 板幼稚的Huh-7.5.1细胞以约3×10 3个细胞/井使用一个96孔板中。第二天，进行无细胞培养上清液中使用的生长培养基的HCV RNA转染的细胞中收获的10倍系列稀释液，并一式三份接种到的Huh-7.5.1细胞。
  2. 用甲醇（30分钟，在-20℃固定细胞72小时后的感染ºC）和在第7节所列免疫染色为HCV NS5A蛋白。
  3. 使用的最高稀释度来计算的NS5A阳性病灶和每毫升计算焦点形成单元的平均数目（FFU）。参见图4为HCV滴度。

9。 海肾萤光素酶报告基因检测为病毒基因组复制和传染性

  1. 用于评价病毒基因组的复制，板的HCV RNA电穿孔的Huh-7.5.1细胞一式三份在48孔板（1×10 4个细胞/孔）。
  2. 裂解的细胞与75微升被动裂解缓冲液中在6小时，48小时和96小时后转染。
  3. 摇动板轻轻地为15分钟，在室温下储存于-80℃。
  4. 来测量海肾荧光素酶活性，解冻的蛋白质裂解物和海肾萤光素酶测定试剂至室温。
  5. 加入20微升每孔蛋白裂解液96-WEL的 L白色发光板并将板光度计。
  6. 分配100μl的海肾荧光素酶测定试剂（腔肠素底物+缓冲液中），每孔并经过2秒预读取的延迟;结合所发出的光10秒。
  7. 从一式三份生物的萤光素酶值计算出平均值和标准偏差对每个样品和经受的数据进行统计分析（ 图5）。
  8. 用于评估感染性，接种500微升无细胞上清液从HCV RNA转染的细胞在指定的时间点（48小时和96小时），一式三份在48孔板中获得到幼稚的Huh-7.5.1细胞。
  9. 用500μl新鲜培养基后，每井6小时后更换感染病毒接种。
  10. 溶胞物与步骤8.2至8.7（ 图5）中所述的细胞在48小时后的感染和受海肾萤光素酶测定。
书名“> 10。统计分析

  1. 在该图中的误差棒表示标准偏差（SD）。对P值的计算采用非配对t检验。

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结果

丙型肝炎病毒是一种RNA病毒。因此，对于遗传操作的目的，所述HCV基因组cDNA已被克隆到细菌质粒载体。甲T7 RNA聚合酶启动子序列立即被引入HCV基因组的5'末端之前。 HCV的分析工作流程的一般概述示于图1，生成HCV基因组RNA具有精确的3'末端含有质粒HCV基因组被切割用 XbaⅠ限制性内切酶和所产生的单链突出端补平用绿豆核酸酶消化。线性化的质粒的HCV的质量通过琼脂糖凝胶?...

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讨论

此图描述了用于分析丙型肝炎病毒复制循环的方法。丙型肝炎病毒是一种人类病原体和规定的生物安全议定书将必须严格遵守。感染性HCV细胞培养系统之前已经11-13,16,17说明。有下列图示的协议，当我们实现几个关键点。首先，它是非常重要，以有完整的全长病毒基因组RNA质量好于下游的研究。输入质粒携带的病毒cDNA要进行线性化处理，并仔细减弱。的绿豆核酸酶来生硬的Xba I位悬...

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披露声明

The authors have nothing to disclose.

致谢

We thank F. Chisari for providing Huh-7.5.1 cell line. We would like to thank Justine Ho for editing the manuscript. This work was supported by Cedars-Sinai Medical Center Institutional Programmatic Research Award and National Center for Advancing Translational Sciences, Grant UL1TR000124 to V.A.

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)Fisher Scientific10-017-CV
Non essential amino acidFisher ScientificMT25025CI
HEPESLife Technologies15630080
GlutamaxLife Technologies35050061
Opti-MEM Reduced Serum Medium,no Phenol RedLife Technologies11058-021
Huh-7.5.1The Scripps Research InstituteThe cell line was kindly provided by Dr. Francis Chisari to Dr. Arumugaswami under executed MTA between The Scripps Research Institute and Cedars-Sinai Medical Center
Plasmids (pFNX-HCV, pFNX-HCV Pol null, pFNX-Rluc, and pFNX-Rluc Pol null) Cedars-Sinai Medical CenterThe HCV plasmids were synthesized by Dr. Arumugaswami using overlapping oligo-nucleotides. 
XbaINew England Biolabs Inc.R0145S
Mung Bean NucleaseNew England Biolabs Inc.M0250S
T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production SystemPromegaP1320
Rneasy Mini KitQiagen74104
Nanodrop 2000Thermo ScientificNanodrop 2000
Electroporation Cuvette (4 mm)BioexpressE-5010-4
Gene Pulser Xcell Total SystemBio-Rad165-2660
mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2 English & Scientific Consulting Kft.10010200
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488Life TechnologiesA11008
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594Life TechnologiesA11020
PVDF membrane packageBio-Rad162-0263
Blotting Grade Blocker Non Fat Dry MilkBio-Rad170-6404XTU
Tween-20Bio-Rad170-6531XTU
Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [8 G-2]Abcamab65407
Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [H23]Abcamab13830
Goat anti-mouse IgG conjugated with horseradish peroxidase (HRP) Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.115-035-003
Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagents GE Healthcare Life SciencesRPN2236
SUPERSCRIPT III RT Life Technologies18080085
SYBR QPCR SUPERMIX W/ROXLife Technologies11744500
ViiA 7 real-time PCR systemLife TechnologiesNA
Renilla Luciferase Assay System kitPromegaE2810
RNase-Free DNasePromegaM6101
GloMax-Multi Detection System (Luminometer)Promega

参考文献

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