Um protocolo para hepatite C Analisando replicação de vírus

Resumo

Hepatitis C Virus (HCV) is a major human pathogen that causes liver disorders, including cirrhosis and cancer. An HCV infectious cell culture system is essential for understanding the molecular mechanism of HCV replication and developing new therapeutic approaches. Here we describe a protocol to investigate various stages of the HCV replication cycle.

Resumo

Vírus da Hepatite C (HCV) afeta 3% da população mundial e causa graves doenças do fígado, incluindo hepatite crônica, cirrose e carcinoma hepatocelular. O HCV é um vírus de ARN encapsulado pertencente à família Flaviviridae. O tratamento atual não é totalmente eficaz e causa efeitos colaterais adversos. Não há vacina HCV disponível. Assim, é necessário um esforço continuado para o desenvolvimento de uma vacina e terapia melhor. Um sistema de cultura de células de VHC é fundamental para o estudo de vários estágios de crescimento de HCV, incluindo a entrada do vírus, a replicação do genoma, as embalagens, e de saída. No processo agora apresentado, foi utilizado um vírus de tipo selvagem intragenotype 2a quimérico, FNX-HCV, e um vírus FNX-Rluc recombinante portador de um gene repórter de luciferase de Renilla para estudar a replicação do vírus. Uma linha de células de hepatoma humano (Huh-7 com base) foi utilizado para a transfecção in vitro do transcrito ARN genómico de HCV. Os sobrenadantes de cultura isentos de células, lisados ​​de proteína e tRNA otal foram colhidas em vários pontos de tempo pós-transfecção para avaliar o crescimento HCV. Estado de replicação do genoma do HCV foi avaliada por RT-PCR quantitativo e visualizar a presença de ARN de HCV de cadeia dupla. A expressão da proteína do VHC foi verificada por imunofluorescência blot e ensaios de Western utilizando anticorpos específicos para as proteínas do HCV NS3 e NS5A. RNA de HCV de células transfectadas divulgados partículas infecciosas em cultura sobrenadante e o título virai foi medido. Os ensaios de luciferase, foram utilizados para avaliar o nível de replicação e infecciosidade de HCV repórter. Em conclusão, nós apresentamos vários ensaios virológicos para caracterizar diferentes estágios do ciclo de replicação do HCV.

Introdução

Vírus da hepatite C (HCV) causa cirrose e câncer de fígado. Ela afeta 170 milhões de pessoas em todo o mundo, com 350.000 pessoas morrem anualmente ^1-3. O HCV é um vírus de cadeia positiva de ARN com um tamanho de genoma de 9,6 kb. O genoma do HCV é traduzido como uma única poliproteína de ~ 3000 resíduos de aminoácidos que é clivada proteoliticamente por diversas proteases celulares e virais em 10 polipéptidos. O HCV é o vírus protótipo do género Hepacivirus e pertence à família Flaviviridae ^4. Após a exposição, o HCV estabelece a infecção crónica em 80% dos indivíduos. A infecção é geralmente assintomática e oportuna diagnóstico pode permitir a intervenção terapêutica para evitar a deterioração do fígado. O tratamento atual é de qualidade inferior e nenhuma vacina está disponível ^5,6.

A etiologia da hepatite C foi descrita pela primeira vez em 1989 ^7. Estudar a replicação do HCV é importante para a vacina contra a hepatite C e pesquisa de tratamento, mas que tinha sidolongo dificultada pela falta de um sistema de cultura de vírus eficiente. Um clone molecular de HCV foi demonstrado ser infeccioso em chimpanzés mediante inoculação ^intra-8. Subsequentemente, os replicões de HCV sub-genómicos foram descritas, o que permitiu a dissecar a fase de replicação do genoma viral em um sistema de cultura de células de ^9,10. Descoberta de um VHC genótipo 2a isolar JFH-1 (Japanese fulminante da hepatite-1), capaz de infectar cultura de células abriu novos caminhos para a pesquisa a replicação do HCV ^11-13. Genótipo 2a tensão JFH-1 baseada vírus quiméricos inter-e intra-genotípicas e do genótipo 1 do HCV sistemas de cultura infecciosas base também estão disponíveis ^14-18.

Temos utilizado com sucesso JFH-1 tensão e HCV intragenotype 2a vírus quimérico para obter o mapa de alta resolução de perfil funcional de domínios de proteínas e cis-atuantes elementos de RNA ^19,20. De acordo com isto, aqui descrevemos um sistema de cultura eficaz utilizado rotineiramente que permiteestudando várias fases do ciclo de replicação do HCV e interação patógeno-hospedeiro. Apresentamos ensaios virológicos para avaliar replicação do genoma viral e infectividade de novo de intragenotype 2a HCV e HCV repórter baseado Renilla luciferase.

Protocolo

Um esboço geral do protocolo é ilustrada na Figura 1.

1. Células

1. Preparar o meio de crescimento completo, que contém 10-15% de soro fetal bovino (FBS), 10 mM de aminoácidos não essenciais, 10 mM de Hepes, penicilina (100 unidades / ml), estreptomicina (100 mg / ml), e 2 mM de L-glutamina.
2. Manter Huh-7.5.1 células ¹³ em meios de cultura completos contendo os suplementos acima para análise in vitro do ciclo de replicação viral da hepatite C.
3. Culturas estirpes virais em células Huh-7.5.1 com o meio de crescimento suplementado especificado a 37 ° C com 5% de CO _2.

2. Vírus e plasmídeos As construções

1. Gerar a forma complementar de ADN (ADNc) do ARN de HCV e cloná-lo num vector de plasmídeo para a facilidade da manipulação genética. Nota: A descoberta da hepatite fulminante japonês 1, JFH-1 (genótipo 2a HCV), isolar tem sido fundamental para a pesquisa de HCV e éusado principalmente para estudar o ciclo de replicação do HCV ^11-13. Vírus quiméricos inter e intragenotypic baseados em JFH-1 HCV são comumente usados ​​em pesquisas ^14-18. Construção de intragenotype 2a sintético vírus quimérico, FNX-HCV, e uma cepa repórter quimérico monocistrónicas foi descrito anteriormente ¹⁹ e construção detalhes estão fora do âmbito do presente protocolo.
2. Use o pFNX-HCV vírus intragenotype 2a vez que contém um 5 'NTR, regiões e p7 estruturais e parte das regiões não-estruturais NS2 (nucleotídeos 1-2878) da J6CF cepa parental (NCBI adesão não. AF177036), como bem como os componentes não estruturais do vírus da estirpe JFH-1 (n ° de acesso NCBI. AB047639). Nota: FNX-HCV foi sintetizado com base na seqüência de Jc1 intragenotype 2a HCV quimérico relatado anteriormente ^15.
3. Gerar um construto quimérico monocistrónicas repórter viral, o pFNX-Rluc, com base na estirpe pFNX-HCV (anteriormente no passo 2.2) através da inserção de um Rdo gene da luciferase enilla entre a NTR 5 'e o gene núcleo (entre 388 e 389 nt). Posteriormente, ligar o gene da luciferase e gene núcleo dessa construção usando uma 2A vírus da febre aftosa (F2A) sequência peptídica, que funcionaria como um sinal de clivagem.
4. Engenheiro da construção viral RNA polimerase-null (Pol-) usando o pFNX-HCV ou o fundo viral pFNX-Rluc. Substitua os resíduos catalíticos NS5B polimerase, GDD (aa 2759-2761; nt 8615-8623), de qualquer um desses backbones virais com resíduos de ácido amino AAG.

3. In Vitro HCV RNA Transcrição

1. Use uma intragenotype 2a vírus quimérico FNX-VHC e FNX-HCV Pol nula (Pol-) HCV para avaliação da replicação viral (Figura 2A).
2. Linearizar os plasmídeos virais com a enzima de restrição Xbal e, em seguida, tratar com nuclease de feijão mung para produzir extremidades cegas. Purificar os plasmídeos digeridos por cromatografia de troca aniônica. Verifique a integridade of o plasmídeo linearizado submetendo ADN de electroforese em gel de agarose (Figura 2B).
3. Transcrever os plasmídeos linearizados virais usando a polimerase T7 RNA.
4. Purifica-se o ARN tratado com ADNase recém-sintetizado utilizando um kit de purificação de RNA.
5. Verificar a produção de RNA por electroforese em gel de agarose (Figura 2C).
6. Quantificar o RNA por espectrofotometria.
7. Armazenar o ARN gerado em -80 ° C em aliquotas de 10 ug de trabalho. Nota: Para minimizar a variação da qualidade de ARN em cada desenho experimental transcrevendo todos RNA para cada amostra e de controlo virai, ao mesmo tempo.

4. HCV RNA transfecção e Coleta de Amostras

1. Colher as células Huh-7.5.1 utilizando tripsina.
2. Para lavar as células, centrífuga e ressuspender a suspensão duas vezes com a mídia frio baixo soro. Ressuspender as células em meios de baixa no soro a 1 x 10 ⁷ células por ml.
3. Misturar um total de 10 & #956; g de ARN viral transcrito com 400 ul de células ressuspensas (4 x 10 ⁶ células) numa cuvete de electroporação de 0,4 cm. Transfectar as células através de electroporação a 270 V, 100 Ω, e 950 uF.
4. Ressuspender as células electroporadas em 10 ml de meio de crescimento completo com 15% de FBS. Nota: O aumento da capacidade de sobrevivência das células electroporadas é visto quando as células Huh-7.5.1 foram cultivadas em 15% de soro fetal bovino.
5. Placa as células em ambos os frascos T-25 (1,2 x 10 ~ ⁶ células por frasco) e as placas de 48 poços (1 x 10 ⁴ culas por po) para cada um dos seguintes pontos de tempo: 4, 48 e 96 horas.
6. Substitua a mídia a 4-8 horas após a transfecção com a mídia de crescimento suplementado fresco com 10% de FBS para remover restos de células mortas dos frascos de cultura e placas.
7. Os sobrenadantes de cultura de células da colheita nos 48 pontos de tempo, 96 h e remover os detritos celulares a partir de amostras recolhidas por centrifugação das células a 1500 rpm durante 10 min a 4 º C.
8. Armazenar os sobrenadantes isentos de células a -80 º C. Lisar as células de proteína e análise por Western blot de ARN e a transcrição reversa-PCR quantitativa em pontos de tempo indicados.

5. Transcrição reversa-PCR quantitativo (RT-qPCR) para a Avaliação Cópias HCV Genoma

1. Realize uma de duas etapas RT-qPCR para determinar o número de cópias do genoma do HCV RNA.
2. Transcrever Reversa 1 ug de RNA celular total, utilizando a transcriptase reversa e um iniciador específico para a cadeia de sentido directo do HCV que se liga a 5 'NTR (JFH RTQ R: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3') ou um primer específico para o gene doméstico peptidylprolyl isomerase de L (R PPIG : 5'-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3 '). Também a transcrição reversa do RNA de HCV-FNX (gerado na Etapa 3) de cópias do genoma conhecidos ⁽¹⁰ janeiro - 10 setembro padrão) usando sentido HCV cordão iniciador.
3. Realizar qPCR utilizando 50 ng do cDNA transcrito resultante usando primers específicos do HCV (JFH RTQF: 5'CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3; JFH RTQ R: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3 ') e DNA de ligação corante verde contendo qPCR de super mix. Realize qPCR para PPIG gene housekeeping, bem como (primers PPIG F: 5'-GAAGAGTGCGATCAAGAACCCATGAC-3 '; PPIG R: 5'-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3') Nota: Para o cálculo nível RNA HCV intracelular preciso através de amostras, use gene housekeeping celular, PPIG , o nível de expressão (ciclo Ct) para normalização. Utilizar o número de cópias do genoma FNX-HCV, como o padrão para a determinação do número de cópias.
4. Use as seguintes condições durante a execução de qPCR para determinar o número de cópias de RNA do HCV: 95 º C por 15 segundos e 60   º C por 30 segundos (40 ciclos), utilizando sistema em tempo real PCR.
5. Ver Figuras 3A e 3B para resultados de replicação do genoma.

6. Ocidental análise de hibridação para detecção de expressão da proteína do VHC (figura 3C)

1. Use lisatos celulares frRNA viral om transfectadas em 96 horas pós transfecção para a proteína análise Western blot.
2. Resolver o ligado celular utilizando SDS-PAGE e transferência de difluoreto de polivinilideno (PVDF) da membrana.
3. Bloquear a membrana com uma solução de bloqueio contendo 5% de leite desnatado, 0,2% de Tween 20 em tampão fosfato salino (PBS).
4. Incubar a membrana com anticorpo primário monoclonal NS3 (1 em 1000 de diluição) e da beta-actina (diluição de 1 em 5.000).
5. Adicionar cabra anti-IgG de ratinho conjugado com peroxidase de rábano (diluição de 1 em 5000) e detectadas por quimiluminescência.

7. Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI)

1. Fixar as células transfectadas e infectadas por HCV utilizando metanol durante 30 min a -20 º C para o ensaio de imunofluorescência.
2. Lava-se a células com PBS três vezes, e bloquear com IFA tampão de bloqueio.
3. Use policlonal de coelho anti-NS5A principalmente anticorpo (gentilmente cedido pelo Dr. Dasgupta, UCLA) ou anticorpo monoclonal anti-DSRNA J2 anticorpo a uma diluição de 1:200 (1 ug / ml) e incubar durante 5 horas a durante a noite a 4 º C.
4. Lavar as células com PBS três vezes, após o anticorpo primário.
5. Adicionar cabra anti-IgG de coelho-488 de anticorpo secundário ou policlonal de cabra anti-IgG de ratinho-594 de anticorpo policlonal secundário numa diluição de 1:1000 (1 ug / ml) e incubar durante 1 hora à temperatura ambiente.
6. Lave as células com PBS três vezes e núcleos mancha usando corante Hoechst e vista usando microscópio de fluorescência (Figura 3D).

8. Titer medição Vírus

1. Placa naive Huh-7.5.1 células em cerca de 3 x ³ 10 células / poço usando uma placa de 96 poços. No dia seguinte, realizar diluições em série de 10 vezes de livre de células do sobrenadante da cultura colhida a partir de RNA de HCV transfectadas células usando a mídia de crescimento e inocular em triplicado para Huh-7.5.1 células.
2. Fix células em 72 horas pós-infecção, utilizando metanol (durante 30 min a -20 º C) e immunostain para a proteína NS5A do HCV como indicado na secção 7.
3. Utilizar a diluição mais elevada para contar para os focos positivo NS5A e calcular o número médio de unidades formadoras de foco (UFF) por mililitro. Ver Figura 4 para o HCV título.

9. Renilla luciferase Ensaio para Viral Genome replicação e infectividade

1. Para avaliar a replicação do genoma viral, a placa de HCV RNA electroporado-Huh-7.5.1 células em triplicado em placas de 48 poços (1 x 10 ⁴ células / cavidade).
2. Lisar as células com 75 ul de tampão de lise passivo no 6 h, 48 h e 96 h pós-transfecção.
3. Rocha as placas suavemente durante 15 minutos à temperatura ambiente e armazenar a -80 ° C.
4. Para medir a actividade enzimática de luciferase de Renilla, descongelar o lisado de proteína e luciferase de Renilla reagentes de ensaio a temperatura ambiente.
5. Adicionar 20 ul de lisado de proteína por cavidade de uma 96-wel l placa luminescência branca e coloque a placa em um luminómetro.
6. Dispensar 100 l de Renilla luciferase reagente de ensaio (substrato celenterazina + buffer) por poço e depois de um atraso de 2 segundos pré-leitura; integrar a luz emitida durante 10 segundos.
7. Calcula-se a média eo desvio padrão para cada amostra a partir dos valores da luciferase de triplicados biológicos e submeter os dados para análise estatística (Figura 5).
8. Para avaliar a infectividade, inocular 500 mL de sobrenadante isento de células obtidas a partir de células transfectadas com ARN de HCV para os pontos de tempo indicados (48 hr e 96 hr), em triplicado, para naive Huh-7.5.1 células em placas de 48 poços.
9. Substituir o inoculo virai com 500 ul de meio fresco por po, depois de 6 horas pós-infecção.
10. Lise das células às 48 horas pós-infecção e sujeitas a ensaio de luciferase de Renilla como descritos nos passos 8,2-8,7 (Figura 5).

itle "> 10 Análise Estatística.

1. As barras de erro nos gráficos indicam os desvios padrão (SD). Os valores de p foram calculados pelo teste t não pareado.

Resultados

O vírus da hepatite C é um vírus de RNA. Assim, para fins de manipulação genética, o ADNc genómico do HCV foi clonado num vector de plasmídeo bacteriano. Uma sequência de promotor de polimerase de ARN T7 foi introduzida imediatamente antes da extremidade 5 'do genoma do VHC. Um esquema geral de fluxo de trabalho de análise do HCV é apresentada na Figura 1. Para gerar o ARN genómico de HCV com precisão a extremidade 3 ', o genoma do VHC que contém o plasmídeo é cortado com a enzim...

Discussão

Esta ilustração descreve um método para a análise do ciclo de replicação do vírus da hepatite C. HCV é um patógeno humano eo protocolo de biossegurança prescrito terá que ser rigorosamente seguidas. Sistemas de cultura de células de HCV infecciosas foram descritos anteriormente ^11-13,16,17. Existem alguns pontos cruciais que implementamos quando seguindo o protocolo ilustrado. Primeiro, é de grande importância para uma boa qualidade de comprimento RNA genômico viral completo intacto para os est...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Fisher Scientific	10-017-CV
Non essential amino acid	Fisher Scientific	MT25025CI
HEPES	Life Technologies	15630080
Glutamax	Life Technologies	35050061
Opti-MEM Reduced Serum Medium,no Phenol Red	Life Technologies	11058-021
Huh-7.5.1	The Scripps Research Institute		The cell line was kindly provided by Dr. Francis Chisari to Dr. Arumugaswami under executed MTA between The Scripps Research Institute and Cedars-Sinai Medical Center
Plasmids (pFNX-HCV, pFNX-HCV Pol null, pFNX-Rluc, and pFNX-Rluc Pol null)	Cedars-Sinai Medical Center		The HCV plasmids were synthesized by Dr. Arumugaswami using overlapping oligo-nucleotides.
XbaI	New England Biolabs Inc.	R0145S
Mung Bean Nuclease	New England Biolabs Inc.	M0250S
T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System	Promega	P1320
Rneasy Mini Kit	Qiagen	74104
Nanodrop 2000	Thermo Scientific	Nanodrop 2000
Electroporation Cuvette (4 mm)	Bioexpress	E-5010-4
Gene Pulser Xcell Total System	Bio-Rad	165-2660
mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2	English & Scientific Consulting Kft.	10010200
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488	Life Technologies	A11008
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594	Life Technologies	A11020
PVDF membrane package	Bio-Rad	162-0263
Blotting Grade Blocker Non Fat Dry Milk	Bio-Rad	170-6404XTU
Tween-20	Bio-Rad	170-6531XTU
Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [8 G-2]	Abcam	ab65407
Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [H23]	Abcam	ab13830
Goat anti-mouse IgG conjugated with horseradish peroxidase (HRP)	Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.	115-035-003
Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagents	GE Healthcare Life Sciences	RPN2236
SUPERSCRIPT III RT	Life Technologies	18080085
SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX	Life Technologies	11744500
ViiA 7 real-time PCR system	Life Technologies	NA
Renilla Luciferase Assay System kit	Promega	E2810
RNase-Free DNase	Promega	M6101
GloMax-Multi Detection System (Luminometer)	Promega