Un protocolo para el análisis de la hepatitis C de replicación del virus

Resumen

Hepatitis C Virus (HCV) is a major human pathogen that causes liver disorders, including cirrhosis and cancer. An HCV infectious cell culture system is essential for understanding the molecular mechanism of HCV replication and developing new therapeutic approaches. Here we describe a protocol to investigate various stages of the HCV replication cycle.

Resumen

Virus de Hepatitis C (VHC) afecta a 3% de la población mundial y causa graves enfermedades del hígado incluyendo hepatitis crónica, cirrosis y carcinoma hepatocelular. El VHC es un virus de ARN con envoltura que pertenece a la familia Flaviviridae. El tratamiento actual no es totalmente eficaz y causa efectos secundarios adversos. No existe una vacuna contra el VHC disponible. Por lo tanto, se requiere un esfuerzo continuado para el desarrollo de una vacuna y mejor terapia. Un sistema de cultivo celular VHC es crítica para el estudio de varias etapas de crecimiento del VHC incluyendo la entrada del virus, la replicación del genoma, el envasado, y la salida. En el procedimiento actual presentado, se utilizó un virus de tipo salvaje intragenotype 2a quimérico, FNX-VHC, y un virus FNX-Rluc recombinante que lleva un gen indicador de luciferasa de Renilla para estudiar la replicación del virus. Una línea celular de hepatoma humano se utilizó (basa Huh-7) para la transfección de transcritos in vitro de VHC ARN genómicos. Sobrenadantes de cultivo libres de células, lisados ​​de proteínas y tARN otal se recogieron en varios puntos de tiempo después de la transfección para evaluar el crecimiento del VHC. VHC estado de la replicación del genoma se evaluó mediante RT-PCR cuantitativa y la visualización de la presencia de VHC ARN de doble cadena. La expresión de la proteína del VHC se verificó por transferencia de Western y ensayos de inmunofluorescencia utilizando anticuerpos específicos para las proteínas del VHC NS3 y NS5A. Células transfectadas de ARN del VHC liberadas partículas infecciosas en sobrenadante de cultivo y el título viral se midió. Se utilizaron ensayos de luciferasa para evaluar el nivel de replicación y la infectividad del VHC reportero. En conclusión, se presentan varios ensayos virológicos para la caracterización de las diferentes etapas del ciclo de replicación del VHC.

Introducción

Virus de Hepatitis C (VHC) causa la cirrosis y cáncer de hígado. Afecta a 170 millones de personas en todo el mundo, con 350.000 personas que mueren cada año ^1-3. El VHC es un virus ARN de cadena positiva con un tamaño de genoma de 9,6 kb. El genoma del HCV se traduce como una sola poliproteína de ~ 3.000 residuos de aminoácidos que se escinde proteolíticamente por diversas proteasas celulares y virales en 10 polipéptidos. VHC es el virus prototipo del género Hepacivirus y pertenece a la familia Flaviviridae ^4. Tras la exposición, el VHC establece la infección crónica en el 80% de los individuos. La infección generalmente es asintomática y oportuno diagnóstico puede permitir la intervención terapéutica para evitar el deterioro del hígado. El tratamiento actual es subóptimo y no se dispone de vacuna ^5,6.

La etiología de la hepatitis C fue descrita por primera vez en 1989 ^7. Estudiar la replicación del VHC es importante para la vacuna contra la hepatitis C y la investigación del tratamiento, pero había sidolargo obstaculizada por la falta de un sistema de cultivo viral eficiente. Un clon molecular del VHC ha demostrado ser infecciosa en los chimpancés a la inoculación intrahepática ^8. Posteriormente, replicones del VHC sub-genómicas se describen, lo que permitió a diseccionar la etapa de la replicación del genoma viral en un ^9,10 sistema de cultivo celular. El descubrimiento de un VHC genotipo 2 bis aislar JFH-1 (hepatitis fulminante-1 japonés), capaz de infectar un cultivo celular abierto nuevas vías para la investigación la replicación del VHC ^11-13. Cepa del genotipo 2 bis JFH-1 basada virus quiméricos inter e intra-genotípica y el genotipo 1 del VHC sistemas de cultivo basados ​​infecciosas son disponibles también ^14-18.

Hemos utilizado con éxito JFH-1 cepa y VHC intragenotype 2a virus quimérico obtener el mapa de alta resolución del perfil funcional de los dominios de la proteína y cis-elementos que actúan de ARN ^19,20. De acuerdo con esto, aquí se describe un sistema de cultivo eficaz utilizado rutinariamente que permiteel estudio de las diversas etapas del ciclo de replicación del VHC y la interacción huésped-patógeno. Presentamos los ensayos virológicos para evaluar la replicación del genoma viral y la infectividad de novo de intragenotype VHC 2a y un reportero de VHC basado en la luciferasa de Renilla.

Protocolo

Un esquema general del protocolo se ilustra en la Figura 1.

1. Las células

1. Preparar medio de crecimiento completo que contiene suero de 10-15% de bovino fetal (FBS), 10 mM de aminoácidos no esenciales, 10 mM de Hepes, penicilina (100 unidades / ml), estreptomicina (100 mg / ml), y 2 mM de L-glutamina.
2. Mantener Huh-7.5.1 células ¹³ en medio de crecimiento completo que contienen los suplementos anteriores para el análisis in vitro de la hepatitis C ciclo de replicación viral.
3. Cepas virales Cultura en Huh-7.5.1 células con el medio de cultivo complementado especificada a 37 ° C con 5% de CO _2.

2. Virus y Construcciones de plásmidos

1. Generar la forma complementaria de ADN (ADNc) del ARN del VHC y clonar en un vector plásmido para la facilidad de manipulación genética. Nota: El descubrimiento de los japoneses hepatitis fulminante 1, JFH-1 (genotipo 2a HCV), aísle ha sido fundamental para la investigación y el VHC esutilizado principalmente para estudiar el ciclo de ^11-13 replicación del VHC. Virus quiméricos inter e intragenotypic basados ​​en JFH-1 del VHC se utilizan comúnmente en la investigación ^14-18. Construcción de intragenotype 2a sintética virus quimérico, FNX-VHC, y una cepa reportera quimérico monocistronic fue descrito previamente ¹⁹ y los detalles de construcción están más allá del alcance de este protocolo.
2. Utilice el virus intragenotype 2a pFNX-VHC, ya que contiene una NTR 5 ', regiones y P7 estructurales, y parte de las regiones no estructurales NS2 (nucleótidos 1 hasta 2878) de la cepa parental J6CF (NCBI n º de acceso. AF177036), como así como los componentes no estructurales de la JFH-1 cepa viral (NCBI n º de acceso. AB047639). Nota: FNX-VHC se sintetizó basándose en la secuencia de Jc1 intragenotype 2a VHC quimérico se informó anteriormente ^15.
3. Generar un constructo monocistrónico quimérico reportero viral, el pFNX-Rluc, basado en la cepa pFNX-VHC (antes en la etapa 2.2) mediante la inserción de un Rgen de la luciferasa enilla entre el 5 'NTR y el gen del núcleo (entre nt 388 y 389). Posteriormente, conecte el gen de la luciferasa y el gen del núcleo de esta construcción usando un 2A del virus de la fiebre aftosa (F2A) secuencia del péptido, que funcionaría como una señal de la escisión.
4. Ingeniero de la ARN polimerasa nulo (Pol-) construcción viral utilizando el pFNX-VHC o el fondo viral pFNX-Rluc. Reemplazar los residuos catalíticos de la polimerasa NS5B, GDD (aa 2759-2761; nt 8615 a 8.623), de cualquiera de estas cadenas principales virales con residuos de aminoácidos de la AAG.

3. In vitro el ARN del VHC Transcripción

1. Utilice un intragenotype 2a quimérico virus FNX-HCV y nulo Pol FNX-HCV (Pol-) HCV para la evaluación de la replicación viral (Figura 2A).
2. Linealice los plásmidos virales con la enzima de restricción XbaI y después tratar con nucleasa de judía mung para generar extremos romos. Purifica los plásmidos digeridos por cromatografía de intercambio de aniones. Verificar la integridad of el plásmido linealizado de ADN sometiendo a electroforesis en gel de agarosa (Figura 2B).
3. Transcribir los plásmidos virales linealizadas utilizando la T7 ARN polimerasa.
4. Se purifica el ARN tratado con DNasa recién sintetizado usando un kit de purificación de ARN.
5. Verifique la producción de ARN mediante electroforesis en gel de agarosa (Figura 2C).
6. Cuantificar el RNA por espectrofotometría.
7. Almacenar el ARN generados en -80 ° C en 10 g alícuotas de trabajo. Nota: Para minimizar la variación de la calidad del ARN dentro de cada diseño experimental por la transcripción de todos los ARN para cada muestra viral y de control al mismo tiempo.

4. VHC ARN transfección y toma de muestras

1. Recoger las células Huh-7.5.1 usando tripsina.
2. Para enjuagar las células, centrifugar y resuspender la suspensión dos veces con los medios de comunicación en frío bajo suero. Resuspender las células en medios de baja de suero con 1 x 10 ⁷ células por ml.
3. Mezclar con un total de 10 & #956; g de ARN viral transcrito con 400 l de células resuspendidas (4 x 10 ⁶ células) en una cubeta de electroporación de 0,4-cm. Transfectar las células mediante electroporación a 270 V, 100 Ω y 950 mF.
4. Resuspender las células a electroporación en 10 ml de medio de crecimiento completo con 15% de FBS. Nota: El aumento de la supervivencia de las células sometidas a electroporación se observa cuando las células Huh-7.5.1 se cultivaron en 15% suero bovino fetal.
5. Placa de las células en los dos matraces T-25 (~ 1,2 x 10 ⁶ células por matraz) y las placas de 48 pocillos (1 x 10 ⁴ células por pocillo) para cada uno de los siguientes puntos de tiempo: 4, 48 y 96 h.
6. Reemplazar los medios de comunicación a 4-8 h después de la transfección con medio de crecimiento suplementado fresco con 10% de FBS para eliminar los residuos de células muertas de los matraces y placas de cultivo.
7. Sobrenadantes de cultivo celular de cosecha en los 48, 96 puntos de tiempo hr y eliminar los desechos celulares de las muestras recogidas por centrifugación de las células a 1.500 rpm durante 10 min a 4 º C.
8. Almacene los sobrenadantes libres de células a -80 º C. Lisar las células para la proteína y el análisis por Western blot de ARN y la transcripción inversa-PCR cuantitativa en los puntos de tiempo indicados.

5. Transcripción inversa-PCR cuantitativa (RT-qPCR) para la evaluación de las copias del VHC Genoma

1. Realice una de dos etapa de RT-qPCR para determinar el número de copias de ARN genómico del VHC.
2. Transcribir inversamente 1 g de ARN celular total utilizando la transcriptasa inversa y un cebador específico para el VHC cadena con sentido que se une a NTR 5 '(JFH RTQ R: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3') o un cebador específico para el gen de mantenimiento peptidilprolil isomerasa G (R ppig : 5'-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3 '). También transcribir inversamente FNX-HCV RNA (generado en el paso 3) de copias del genoma conocidos (enero ^10-09 10 estándar), utilizando el sentido del VHC primer capítulo.
3. Llevar a cabo qPCR utilizando 50 ng del ADNc transcrito resultante utilizando cebadores específicos de HCV (JFH RTQF: 5'CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3; JFH RTQ R: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3 ') y el ADN vinculante tinte verde que contiene qPCR súper mezcla. Realice qPCR para la limpieza gen ppig también (cebadores ppig F: 5'-GAAGAGTGCGATCAAGAACCCATGAC-3 '; ppig R: 5'-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3') Nota: Para calcular el nivel de ARN del VHC intracelular exacta a través de muestras, utilice gen de mantenimiento celular, ppig , el nivel de expresión (ciclo Ct) para la normalización. Utilice el número de copias del genoma FNX-VHC como el estándar para la determinación del número de copias.
4. Utilice las siguientes condiciones cuando se ejecuta qPCR para determinar el número de copias de ARN del VHC: 95 º C durante 15 segundos y 60   º C durante 30 segundos (40 ciclos) usando el sistema de PCR en tiempo real.
5. Véanse las Figuras 3A y 3B para resultados replicación del genoma.

6. Análisis Western Blot para detectar la expresión de proteínas del VHC (Figura 3C)

1. Utilice lisados ​​de células FRARN viral om transfectadas a 96 h después de la transfección de proteínas análisis Western Blot.
2. Resolver el lisado celular utilizando SDS-PAGE y transferencia de difluoruro de polivinilideno (PVDF).
3. Bloquear la membrana utilizando una solución de bloqueo que contiene leche desnatada 5%, 0,2% de Tween 20 en solución salina tamponada con fosfato (PBS).
4. Incubar la membrana con el anticuerpo primario monoclonal de ratón NS3 (1 en 1000 de dilución) y beta-actina (1 en 5000 de dilución).
5. Añadir IgG de cabra anti-ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante (1 en 5000 de dilución) y detectar por quimioluminiscencia.

7. Ensayo de inmunofluorescencia (IFA)

1. Fijar las células infectadas con el VHC y se transfectaron usando metanol durante 30 min a -20 º C para el ensayo de inmunofluorescencia.
2. Lavar la célula con PBS tres veces y bloquear con tampón de bloqueo IFA.
3. Utilice conejo policlonal anti-NS5A principalmente anticuerpo (amablemente proporcionados por el doctor Dasgupta, UCLA) o monoclonales de ratón anti-DSRNA J2 anticuerpo a una dilución de 1:200 (1 mg / ml) y se incuba durante 5 horas a la noche a 4 º C.
4. Lavar las células con PBS tres veces después de que el anticuerpo primario.
5. Añadir cabra anti-IgG de conejo-488 anticuerpo secundario policlonal o anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón-594 anticuerpo secundario policlonal a una dilución 1:1.000 (1 g / ml) e incubar durante 1 hora a temperatura ambiente.
6. Lavar las células con PBS tres veces y núcleos de tinción utilizando colorante Hoechst y vista con microscopio de fluorescencia (Figura 3D).

8. Titulación de medición Virus

1. Ingenuos células Plate Huh-7.5.1 en aproximadamente 3 x 10 ³ células / pocillo utilizando una placa de 96 pocillos. Al día siguiente, realizar diluciones seriadas de 10 veces de sobrenadante de cultivo libre de células recolectadas a partir de células transfectadas de ARN del VHC utilizando medio de cultivo e inocular por triplicado en Huh-7.5.1 células.
2. Fijar las células a las 72 horas después de la infección usando metanol (durante 30 min a -20 º C) y la inmunotinción de la proteína NS5A del VHC como se indica en la sección 7.
3. Utilice la dilución más alta que contar para los focos NS5A positivo y calcular el número medio de foco unidad de formación (UFF) por mililitro. Consulte la Figura 4 para el título del VHC.

9. Renilla Luciferase reportero de ensayo para el genoma viral de replicación e infectividad

1. Para la evaluación de la replicación del genoma viral, Huh-7.5.1 células de ARN-VHC a electroporación placa por triplicado en placas de 48 pocillos (1 x 10 ⁴ células / pocillo).
2. Lyse las células con 75 l de tampón de lisis pasiva al 6 horas, 48 ​​horas y 96 horas después de la transfección.
3. Rock the placas suavemente durante 15 minutos a temperatura ambiente y se almacena a -80 º C.
4. Para medir la actividad enzimática de luciferasa de Renilla, descongelar el lisado de proteínas y la luciferasa de Renilla reactivos de ensayo a temperatura ambiente.
5. Añadir 20 l de lisado de proteína por pocillo de una 96-WEL l placa luminiscencia blanca y coloque la placa en un luminómetro.
6. Vierta 100 l de Renilla luciferasa reactivo de ensayo (sustrato coelenterazina + buffer) por pozo y después de un retraso de 2 segundos antes de la lectura; integrar la luz emitida por 10 seg.
7. Calcular la media y la desviación estándar para cada muestra a partir de los valores de luciferasa de triplicados biológicos y someter los datos a análisis estadístico (Figura 5).
8. Para evaluar la infectividad, inocular 500 l de sobrenadante libre de células obtenidas a partir de células de ARN-VHC transfectadas para el tiempo indicado puntos (48 hy 96 h), por triplicado, en células de los animales Huh-7.5.1 en placas de 48 pocillos.
9. Vuelva a colocar el inóculo viral con 500 l de medio fresco por pocillo después de las 6 horas después de la infección.
10. Lisar las células en 48 horas después de la infección y sujetos a ensayo de luciferasa de Renilla tal como se describe en los pasos 8.2 a 8.7 (figura 5).

í tulo "> 10. Análisis estadístico

1. Las barras de error en los gráficos indican las desviaciones estándar (DE). Los valores de p se calcularon por el test t no apareado.

Resultados

Virus de la hepatitis C es un virus de ARN. Por lo tanto para el propósito de la manipulación genética, el ADNc genómico del VHC ha sido clonado en un plásmido vector bacteriano. Una secuencia promotora de ARN polimerasa de T7 se introdujo inmediatamente antes del extremo 5 'del genoma del VHC. Un esquema general de flujo de trabajo de análisis de VHC se presenta en la Figura 1. Para generar ARN genómico del VHC con el extremo precisa 3 ', del genoma del VHC que contiene el plásmido se c...

Discusión

Esta ilustración describe un método para analizar el ciclo de replicación de la hepatitis C virus. HCV es un patógeno humano y el protocolo de bioseguridad prescritas tendrá que ser seguido estrictamente. Sistemas de cultivo celular de VHC infecciosas se han descrito anteriormente ^11-13,16,17. Hay algunos puntos cruciales que implementamos cuando se sigue el protocolo ilustrado. En primer lugar, es de gran importancia para tener una buena calidad de intacta longitud viral ARN genómico completo para estu...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Fisher Scientific	10-017-CV
Non essential amino acid	Fisher Scientific	MT25025CI
HEPES	Life Technologies	15630080
Glutamax	Life Technologies	35050061
Opti-MEM Reduced Serum Medium,no Phenol Red	Life Technologies	11058-021
Huh-7.5.1	The Scripps Research Institute		The cell line was kindly provided by Dr. Francis Chisari to Dr. Arumugaswami under executed MTA between The Scripps Research Institute and Cedars-Sinai Medical Center
Plasmids (pFNX-HCV, pFNX-HCV Pol null, pFNX-Rluc, and pFNX-Rluc Pol null)	Cedars-Sinai Medical Center		The HCV plasmids were synthesized by Dr. Arumugaswami using overlapping oligo-nucleotides.
XbaI	New England Biolabs Inc.	R0145S
Mung Bean Nuclease	New England Biolabs Inc.	M0250S
T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System	Promega	P1320
Rneasy Mini Kit	Qiagen	74104
Nanodrop 2000	Thermo Scientific	Nanodrop 2000
Electroporation Cuvette (4 mm)	Bioexpress	E-5010-4
Gene Pulser Xcell Total System	Bio-Rad	165-2660
mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2	English & Scientific Consulting Kft.	10010200
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488	Life Technologies	A11008
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594	Life Technologies	A11020
PVDF membrane package	Bio-Rad	162-0263
Blotting Grade Blocker Non Fat Dry Milk	Bio-Rad	170-6404XTU
Tween-20	Bio-Rad	170-6531XTU
Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [8 G-2]	Abcam	ab65407
Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [H23]	Abcam	ab13830
Goat anti-mouse IgG conjugated with horseradish peroxidase (HRP)	Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.	115-035-003
Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagents	GE Healthcare Life Sciences	RPN2236
SUPERSCRIPT III RT	Life Technologies	18080085
SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX	Life Technologies	11744500
ViiA 7 real-time PCR system	Life Technologies	NA
Renilla Luciferase Assay System kit	Promega	E2810
RNase-Free DNase	Promega	M6101
GloMax-Multi Detection System (Luminometer)	Promega